小反芻獸疫病毒抗體ELISA 試驗測量不確定度評估

王治維，圖門巴雅爾，孫 娜，胡明明，孫 杰，寧 艷，雷 沖，王 錦，趙 凱，張 昱，雷宇平，陳 勇，王仲兵

（1.山西省動物疫病預(yù)防控制中心，山西太原 030027；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，山西晉中 03080 1；3.磐石市農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法大隊，吉林磐石 132300）

測量不確定度簡稱不確定度，是指根據(jù)所用到的信息，表征賦予被測量值分散性的非負參數(shù)（JJF 1059.1—2012）或表示與測量結(jié)果相關(guān)聯(lián)的參數(shù)，表征合理地賦予被測量值的分散性（CNASGL043：2020）[1-2]。其本質(zhì)為表征結(jié)果的分散性，根據(jù)計算公式，其必然為非負數(shù)。具體而言，不確定度包括由系統(tǒng)影響引起的若干分量。測量結(jié)果包括估計值和測量不確定度，而不確定度反映了測量結(jié)果的可信程度[3]。

ELISA 試驗因操作相對簡便，檢測敏感性和特異性較高，成為近年來獸醫(yī)系統(tǒng)實驗室常用的檢測方法之一。隨著檢測實驗室認證認可要求的提高，測量不確定度評估在獸醫(yī)實驗室越來越被接受及應(yīng)用?？谔阋?、禽白血病抗體ELISA 檢測已經(jīng)開展了相應(yīng)測量不確定度評估[4-5]。

本研究利用ELISA 試驗測定小反芻獸疫病毒（PPRV）抗體，并對測量不確定度進行了評定和計算，提供了測量過程中各分量的組成和計算方法，科學(xué)評定了此方法的準(zhǔn)確性，以期為獸醫(yī)實驗室測量不確定度評估提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品與試劑 PPRV 阻斷ELISA 抗體檢測試劑盒（批號20200701），購自武漢科前生物股份有限公司，包括試劑盒自帶的陰性和陽性對照樣品；5 份待測羊血清樣品，來源于山西省動物疫病預(yù)防控制中心獸醫(yī)實驗室，均為留樣樣品，其中3份陽性、2 份陰性。

1.1.2 主要儀器酶標(biāo)儀（型 號CYTATION5），為美國BioTek 公司產(chǎn)品；移液器（量程20～200 μL），為Eppendorf 公司產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)箱（型號SPX-150B III），為天津泰斯儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 檢測方法

按照《小反芻獸疫診斷技術(shù)》（GB/T 27982—2011），應(yīng)用ELISA 試驗檢測血清中PPRV 抗體。

2 結(jié)果及分析

2.1 被測量的數(shù)學(xué)模型

根據(jù)試劑盒說明書中提供的公式進行計算和判定。被測量的數(shù)學(xué)模型為PB=（1-S/N）×100%。式中，PB 為阻斷率，S和N分別為樣品和陰性對照在450 nm 波長處的吸光度（OD450nm）。

2.2 不確定度來源分析

根據(jù)檢測的方法原理，影響不確定度的因素有移液器、加樣時間、孵育溫度、孵育時間、試劑盒質(zhì)量和酶標(biāo)儀精度等。對各不確定度分量的來源進行分析并建立相應(yīng)數(shù)學(xué)模型，此試驗不確定度分量的來源主要為樣品（T）和陰性對照（N）的不確定度，分別由uT、uN表示。

2.2.1uT的來源 根據(jù)檢測原理及試劑盒說明書，樣品（T）OD450nm的不確定度分量有：孔間試劑OD450nm的不確定度（uT1）；樣品加樣量帶入的不確定度（uT2），包括移液器相對誤差、加樣量、溫度效應(yīng)分別引入的不確定度uT2-1、uT2-2、uT2-3；樣品加樣時間帶入的不確定度（uT3）；酶標(biāo)儀帶入的測量不確定度（uT4），包括OD450nm值準(zhǔn)確度、重復(fù)性引入的不確定度uT4-1、uT4-2以及校準(zhǔn)酶標(biāo)儀時所使用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度uT4-3；孵育時間引入的不確定度（uT5），包括第1 次孵育60 min、第2 次孵育30 min 引入的不確定度uT5-1、uT5-2；孵育溫度引入的不確定度（uT6），包括第1、2 次孵育引入的不確定度uT6-1、uT6-2。

2.2.2uN的來源 主要包括陰性對照（N）OD450nm重復(fù)性引入的不確定度uN-1以及酶標(biāo)儀的測量不確定度uT4。

2.3 測量不確定度分量評定

2.3.1 孔間試劑吸光度值不確定度（uT1）試劑反應(yīng)孔間的不確定度可通過實驗室試驗獲得，結(jié)果見表1。依據(jù)JJF 1059.1—2012 中A 類合并樣本標(biāo)準(zhǔn)差的方法，取m=5，可得到試劑孔間OD450nm的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

表1 批內(nèi)精密性數(shù)據(jù)

2.3.2 樣品加樣量引入的不確定度（uT2）

2.3.2.1 移液器相對誤差引入的不確定度（uT2-1）移液器校準(zhǔn)證書中在100 μL 量程處的RE（relative error，相對誤差）為0.2%。根據(jù)JJF 1059.1—2012，進行B 類不確定度評定，假設(shè)移液器的誤差均勻分布，即等概率地落在區(qū)間內(nèi)，uT2-1=a/k，k=根據(jù)公式可得出移液器100 μL 量程處的RE 引入的不確定度為0.115 μL。同理，50 μL 量程處的RE 為0.3%（按照0.2%～0.4%平均值計算），可得出uT2-1-1=0.086 6 μL。

2.3.2.2 移液器加樣引入的不確定度（uT2-2）根據(jù)移液器100 μL 量程處的相關(guān)數(shù)據(jù)，其準(zhǔn)確度為2%，試驗中每次的加樣量為100 μL，按照矩形分布，移液器加樣引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度uT2-2=（100 μL×2%）=1.15 μL。同理，50 μL 量程的準(zhǔn)確度為3%（按照2%～4%平均值計算），ELISA試驗中加樣量為50 μL，按照矩形分布，移液器加樣引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度uT2-2-1=（50 μL×3%）=0.866 μL。

2.3.2.3 移液器溫度效應(yīng)引入的不確定度（uT2-3）容量器皿在20 ℃被校準(zhǔn)，根據(jù)實驗室實際工作溫度在（20±4）℃波動，水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃，按照矩形分布，在100 μL 量程處移液器由溫度效應(yīng)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度uT2-3=100×4×2.1×10-4=0.084 μL，在50 μL 量程處的標(biāo)準(zhǔn)不確定度uT2-3-1=50×4×2.1×10-4=0.042 μL。

2.3.3 樣品加樣時間引入的不確定度（uT3）每次檢測的樣品加樣時間不超過10 min，假設(shè)樣品的加樣時間等概率落在0～10 min 區(qū)間內(nèi)，則uT3=a/k=（10/2）=2.887 min。

2.3.4 酶標(biāo)儀引入的測量不確定度（uT4）根據(jù)CYTATION5 酶標(biāo)儀的校準(zhǔn)證書，OD450nm準(zhǔn)確度為±0.005，OD450nm測量重復(fù)性為0.1%（技術(shù)要求為≤1.0%）。假設(shè)酶標(biāo)儀測量的OD450nm重復(fù)性均勻分布，可得出OD450nm準(zhǔn)確度引入的不確定度uT4-1=a/k=（0.005/2）=0.001；OD450nm重復(fù)性引入的不確定度uT4-2=a/k=（1×0.1%/2）=0.000 3；酶標(biāo)儀的校準(zhǔn)證書給出檢定用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的吸光度U=0.01A（k=2），則標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度uT4-3=a/k=0.006。

2.3.5 孵育時間引入的測量不確定度（uT5）根據(jù)ELISA 試劑盒說明書，試驗中孵育時間分別為（60±3）min 和（30±3）min，按照均勻分布計算，標(biāo)準(zhǔn)差==1.732 min。uT5=

2.3.6 孵育溫度引入的測量不確定度（uT6）根據(jù)ELISA 試劑盒說明書，試驗中孵育溫度均為（37±t）℃，根據(jù)均勻分布計算，其標(biāo)準(zhǔn)差為=±1 ℃，所以孵育溫度的相對不確定度uT6=

2.3.7 陰性對照吸光度值引入的不確定度（uN）本研究設(shè)置19 個陰性對照，陰性對照OD450nm及SD值見表2。根據(jù)貝塞爾公式，計算出陰性對照的標(biāo)準(zhǔn)不確定度uN-1==0.071。陰性對照引入的不確定度（uN）由重復(fù)性不確定度uN-1及uT4兩個分量組成，因此

表2 陰性對照及陽性對照孔數(shù)據(jù)

2.4 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度評定

2.4.1 樣品加樣量引入的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度（uT2）對于ELISA 試驗，測定OD 時，樣品孔中液層由底物溶液（V底）和終止液（V終）組成，加入100 μL底物（V底）引起的標(biāo)準(zhǔn)合成不確定度u（V底）==1.159 μL。同理，加入50 μL終止液（V終）引入的標(biāo)準(zhǔn)合成不確定度u（V終）==0.871 μL。因為u（V底）和u（V終）是兩個相互獨立的分量，由加樣量引入的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度uT2=

2.4.2 酶標(biāo)儀引入的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度（uT4）由于各分量互不相關(guān)，故酶標(biāo)儀的測量標(biāo)準(zhǔn)不確定度0.006 09。

2.4.3 檢測樣品OD450nm的合成不確定度（uT）根據(jù)經(jīng)驗值確定：（1）樣品加樣量每±1 μL，樣品（T）的吸光度值±0.020，故uT2靈敏系數(shù)為0.020；（2）樣品加樣時間每±1 min，樣品（T）的吸光度值±0.010，故uT3的靈敏系數(shù)為0.010；（3）樣品孵育時間每±1 min，樣品（T）的吸光度值±0.012，故uT5的靈敏系數(shù)為0.012；（4）樣品孵育溫度每±1 ℃，樣品（T）的吸光度值±0.001，故uT6的靈敏系數(shù)為0.001。檢測樣品（T）OD450nm的不確定度（uT）分量見表3。因各分量互不相關(guān)，均相互獨立，合成檢測樣品（T）OD450nm的標(biāo)準(zhǔn)不確定度uT=0.086 3。

表3 檢測樣品（T）OD450nm 的不確定度評定一覽表

2.4.4 合成樣品（T）OD450nm與陰性對照的比值（S/N）的不確定度（uS/N）根據(jù)公式uS/N=，經(jīng)過計算，（1）樣品OD450nm引入的不確定度的靈敏系數(shù)為0.011；（2）陰性對照OD450nm引入的不確定度的靈敏系數(shù)為0.11。本研究中樣品的OD450nm為0.168，陰性對照的OD450nm均值為1.531，S/N值為89.03%。S/N值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度uS/N

2.5 擴展不確定度評定

取k=2，則uS/N的擴展不確定度U=ku=1.36%（k=2）。

3 討論

不確定度表征被測量值可能出現(xiàn)的范圍，代表著測量結(jié)果質(zhì)量。測量結(jié)果附上不確定度才更完整、有意義。ELISA 試驗引入不確定度后，提升了測量結(jié)果的可信性，有效降低了誤判風(fēng)險。本研究中，根據(jù)ELISA 抗體檢測試劑盒說明書中判定標(biāo)準(zhǔn)，若PB ≥50%，則判定為PPRV 抗體陽性；若PB ＜50%，則判定為PPRV 抗體陰性。若考慮其測量不確定度對結(jié)果的影響，則PB±U≥50%，判定為PPRV 抗體陽性；PB±U＜50%，判定為PPRV 抗體陰性。這一研究表明，在PB±U區(qū)間內(nèi)樣品應(yīng)判定為陽性，可有效減少假陰性樣品出現(xiàn)概率，有助于精確評估免疫效果，避免過度免疫；也有助于小反芻獸疫退出強制免疫的評估。杜鵑[4]研究了口蹄疫病毒O型抗體測量不確定度的引入，并分析了各不確定度分量在整體不確定度值中所占的比例，有效降低了假陽性、假陰性結(jié)果的出現(xiàn)概率，抗體效價判定更為準(zhǔn)確。李雪蓮等[5]將測量不確定度引入ELISA檢測活疫苗中病毒污染研究，對生產(chǎn)使用真正純凈疫苗具有重要意義。史喜菊等[6]在牛布魯氏菌補體結(jié)合試驗中引入測量不確定度，提高了測量結(jié)果質(zhì)量。因此，研究不同試驗方法的測量不確定度，可以逐步構(gòu)建動物疫病檢測領(lǐng)域試驗的不確定度評定體系。

通過對構(gòu)成不確定度的各分量進行詳細分析，并分析各分量在整體不確定度值中所占的比例，可直觀了解對檢測結(jié)果質(zhì)量影響最大的因素，在對這些因素針對性地改進后，可以有效提高檢測質(zhì)量。本研究中，影響ELISA 檢測結(jié)果質(zhì)量的主要因素為試劑孔間吸光度值和酶標(biāo)儀的測量。可以通過嚴格按照酶標(biāo)儀相關(guān)規(guī)程進行核查和維護，合理利用校準(zhǔn)數(shù)據(jù)來降低酶標(biāo)儀引入的不確定度。因ELISA試驗中孔間OD 值引入的不確定度很難進行較大改善，只能通過選用敏感性、特異性等更好的試劑進一步減小不確定度。