上海市豬丹毒桿菌流行株耐藥性分析

張玉杰，徐 鋒，沈莉萍，王曉旭，齊新永，朱九超，孫泉云，趙洪進(jìn)，王 建

（上海市動物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103）

豬丹毒（swine erysipelas）是由豬丹毒桿菌（Erysipelothrix rhuiopathiae）感染引起的一種急性熱性傳染性疾病。感染豬可發(fā)生心內(nèi)膜炎和關(guān)節(jié)炎，嚴(yán)重者出現(xiàn)敗血癥，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。同時，它還是一種人獸共患病，不僅可以感染人表層皮膚，還可以造成菌血癥和心內(nèi)膜炎[1-2]。該病分布于世界各地，主要感染3～12 月齡豬，一年四季均可發(fā)病，以炎熱多雨季節(jié)為盛；常為散發(fā)性，偶有暴發(fā)性流行，發(fā)病率一般為10%～15%，嚴(yán)重時死亡率可達(dá)50%。在20 世紀(jì)90 年代初期，我國通過疫苗免疫等防控手段，使豬丹毒得到了有效控制。但近年來，豬丹毒“老病新發(fā)”。自2010 年開始，我國多個省份出現(xiàn)了豬丹毒較大范圍流行，如江蘇、湖南、福建、云南、廣東等地均有該病暴發(fā)的報道[3-6]，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴(yán)重危害。2010 年以來，上海市動物疫病預(yù)防控制中心確診的豬丹毒病例不斷增加，2014 年達(dá)到高峰，發(fā)病率約為30%，死亡率高達(dá)80%，體質(zhì)量75 kg 以上的育肥豬及母豬易發(fā)病[7]。鑒于此，本研究擬通過對不同來源豬丹毒菌株的耐藥性進(jìn)行分析比較，了解臨床分離的致病菌株與屠宰場分離的健康帶毒株的耐藥現(xiàn)狀及差異，以期為上海市豬丹毒防控及臨床合理用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

1.1.1 參考菌株 豬丹毒桿菌G4T10 株，分離自中牧實業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的豬瘟、豬丹毒和豬多殺性巴氏桿菌病三聯(lián)活疫苗。

1.1.2 臨床分離株 2011—2015 年分離自上海市豬丹毒發(fā)病率較高豬場病死豬的臟器，包括心、肝、脾、肺、腎，共計41 株。

1.1.3 健康帶毒株 2016—2017 年分離自上海市屠宰場正常屠宰豬的臟器，包括扁桃體、淋巴結(jié)和肺臟，共計37 株。

1.2 試劑

臨床常用的18 種藥敏紙片，購自杭州天和微生物試劑有限公司。其中用于Kirby-Baued 紙片瓊脂擴(kuò)散法（K-B法）試驗的藥物為四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、林可霉素、氯霉素、慶大霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素、磺胺異噁唑、復(fù)方新諾明、紅霉素、阿奇霉素、恩諾沙星、氧氟沙星、頭孢拉定、頭孢曲松、阿莫西林、阿莫西林/棒酸、氨芐西林；用于微量肉湯稀釋法（MIC法）的藥物為青霉素、氨芐西林、頭孢噻呋、泰樂菌素、替考米星、托拉菌素、克林霉素、泰妙菌素、恩諾沙星、達(dá)氟沙星、金霉素、土霉素、慶大霉素、氟苯尼考、大觀霉素、新霉素、磺胺間二甲氧嘧啶、復(fù)方新諾明。MIC 藥敏板（型號BOP06F 牛/豬類藥敏板），購自ThermoFisher Scientif ic 公司；TSA 平板培養(yǎng)基，購自美國BD公司。

1.3 操作步驟

1.3.1 K-B法 將41 株臨床分離株分別涂布于TSA 平板，待稍干后用無菌鑷子將18 種藥敏紙片分別平貼于培養(yǎng)基表面，置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察測定抑菌圈大小。根據(jù)杭州天和微生物試劑有限公司提供的K-B法藥敏試驗抑菌圈直徑標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。

1.3.2 MIC法 以G4T10 株為參考菌株，41 株臨床分離株與37 株健康帶毒株為試驗菌株。采用美國臨床驗證標(biāo)準(zhǔn)委員會（CLSI）推薦的方法：在MIC 藥敏板中連續(xù)倍比稀釋藥物，得到一系列100 μL 藥物梯度稀釋液，空白對照為培養(yǎng)基（100 μL），陰性對照為菌懸液和培養(yǎng)基的混合物（100 μL）；將MIC 藥敏板置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，根據(jù)CLSI 抗生素的判定標(biāo)準(zhǔn)（M45-A2）進(jìn)行結(jié)果判定（同時參照同屬鏈球菌的判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判定）。

2 結(jié)果與分析

2.1 K-B法

41 株臨床分離株的敏感藥物主要為β-內(nèi)酰胺類（敏感率分別為阿莫西林100%、阿莫西林/棒酸94.74%、氨芐西林84.21%）和大環(huán)內(nèi)酯類（敏感率分別為紅霉素84.21%、阿奇霉素84.21%）。臨床分離株對多種抗菌藥物的敏感率較低，包括四環(huán)素類（敏感率分別為四環(huán)素21.05%、強(qiáng)力霉素10.00%）、頭孢菌素類（敏感率分別為頭孢拉定31.58%、頭孢曲松47.36%）、喹諾酮類（敏感率分別為恩諾沙星11.11%、氧氟沙星32.46%）、林可霉素（敏感率11.11%），對氯霉素、磺胺類（磺胺異噁唑、復(fù)方新諾明）和氨基糖苷類（慶大霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素）藥物敏感率均為0，即完全耐藥。詳見圖1。

2.2 MIC法

所有菌株的敏感藥物為β-內(nèi)酰胺類和大環(huán)內(nèi)酯類藥物，對其他抗菌藥物均表現(xiàn)不同程度耐藥。其中耐藥程度較高的為四環(huán)素類（耐藥率分別為金霉素98.72%、土霉素96.15%）、氨基糖苷類（慶大霉素耐藥率為98.72%）、氯霉素類（氟苯尼考耐藥率為76.93%）、喹諾酮類（恩諾沙星耐藥率為65.38%），詳見表1。

臨床分離株與健康帶毒株MIC 試驗結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，臨床分離株的耐藥程度總體要高于健康帶毒株，其中對達(dá)氟沙星、恩諾沙星、大觀霉素、泰妙菌素等藥物的耐藥性差異較大。由圖2 可知，90%以上的臨床分離株對達(dá)氟沙星、恩諾沙星耐藥，80%左右的臨床分離株對大觀霉素、泰妙菌素耐藥，而健康帶毒株中只有20%左右對上述藥物耐藥。

3 討論

自1882 年P(guān)asteur 和Thuillier 在死豬體內(nèi)分離到豬丹毒桿菌[8]后，人們逐漸對該桿菌有了認(rèn)識。發(fā)病豬臨床表現(xiàn)形式大致可分為3 種類型，即急性、亞急性和慢性型。急性型主要表現(xiàn)為明顯的敗血性癥狀，亞急性型則是病豬皮膚出現(xiàn)疹塊，慢性型則以出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎和心內(nèi)膜炎為主要特征。疫苗免疫接種被認(rèn)為是防控豬丹毒最經(jīng)濟(jì)、有效的手段。但是傳統(tǒng)滅活苗、弱毒苗或多聯(lián)苗存在一定缺陷，如病豬、瘦弱豬、食欲或體溫不正常豬以及臨產(chǎn)期母豬，均不宜注射疫苗，并且由于個體差異，抗體產(chǎn)生時間和水平也不同。弱毒株接種豬只后有可能恢復(fù)毒力，或者隱性感染豬接種疫苗后，可能會引發(fā)弱毒苗菌株毒力返強(qiáng)而導(dǎo)致豬發(fā)病[9]，同時流行菌株之間的差異也會在一定程度上導(dǎo)致免疫失敗。所以防治豬丹毒，除做好免疫接種外，還應(yīng)結(jié)合使用抗生素，即在限抗政策允許范圍內(nèi)，合理科學(xué)使用抗生素。

本研究采用K-B法對上海市2011—2015 年豬丹毒桿菌臨床分離株進(jìn)行了藥敏試驗。結(jié)果顯示，豬丹毒桿菌對β-內(nèi)酰胺類和大環(huán)內(nèi)酯類藥物敏感，對磺胺類和氨基糖苷類則全部耐藥，這與2020 年龔爭等[10]報道的華東地區(qū)豬丹毒桿菌分離株耐藥性分析結(jié)果一致。雖然青霉素類藥物仍然是防治豬丹毒的首選藥物，但本試驗顯示臨床分離株對頭孢曲松、頭孢拉定等頭孢菌素類藥物的敏感性較低，并且對四環(huán)素類（四環(huán)素、強(qiáng)力霉素）、林可霉素、氯霉素及喹諾酮類（恩諾沙星、氧氟沙星）等藥物的耐藥性明顯增強(qiáng)。據(jù)報道，Ding 等[11]對2012—2013 年在我國7 個省收集的48 株豬丹毒桿菌進(jìn)行耐藥性分析，姚炎彬等[12]對2012—2015 年安徽省豬丹毒桿菌分離株進(jìn)行耐藥性分析，其結(jié)果均顯示豬丹毒桿菌的耐藥性明顯小于本次試驗的分析結(jié)果。推測原因，一是頭孢菌素類抗生素具有抗菌譜廣、抗菌作用強(qiáng)、使用安全等眾多優(yōu)勢，使得其在獸醫(yī)臨床中被廣泛使用，但同時不合理使用導(dǎo)致臨床細(xì)菌對頭孢菌素的耐藥性也大大增加[13]；二是抗生素選擇性壓力導(dǎo)致耐藥菌株增殖。因此在使用抗菌藥物過程中，必須加強(qiáng)抗菌藥物敏感性的實時監(jiān)測，掌控豬丹毒桿菌耐藥性的變化趨勢，從而篩選合適藥物應(yīng)用于臨床。這不僅有利于減緩豬丹毒桿菌耐藥性產(chǎn)生的速度，更對豬丹毒防控有重要意義。

為驗證K-B法對豬丹毒桿菌敏感性試驗的有效性及準(zhǔn)確性，本研究又采用MIC法對上海市78株豬丹毒桿菌分離株進(jìn)行藥敏試驗。結(jié)果顯示，豬丹毒桿菌對β-內(nèi)酰胺類和大環(huán)內(nèi)酯類藥物敏感，這與K-B法結(jié)果一致。同時本研究還對臨床分離的致病菌株和屠宰場分離的健康帶毒株的MIC 結(jié)果進(jìn)行了比較分析。結(jié)果顯示，臨床分離的致病菌株耐藥程度整體高于屠宰場分離的健康帶毒株，其中對達(dá)氟沙星、恩諾沙星、大觀霉素、泰妙菌素的耐藥性差異較大。而達(dá)氟沙星和恩諾沙星屬于喹諾酮類，大觀霉素屬于氨基糖苷類，泰妙菌素屬于雙萜類。目前，我國批準(zhǔn)的動物養(yǎng)殖業(yè)可用于防治動物疾病和促生長的獸用抗菌藥分為抗生素和合成抗菌藥兩大類，其中就包括氨基糖苷類、喹諾酮類藥物[14]。2015 年李敬濤等[15]對湖北省某豬場病死豬中分離的豬丹毒桿菌進(jìn)行藥敏試驗，發(fā)現(xiàn)臨床分離菌株的耐藥性比較嚴(yán)重且耐藥譜廣。究其原因可能是養(yǎng)殖戶在養(yǎng)殖和疾病防控中大量使用相關(guān)抗生素，從而加速了耐藥性的產(chǎn)生。

本試驗雖然對2011—2017 年上海市豬丹毒桿菌分離株的耐藥性進(jìn)行了分析，但是分離菌株并未表現(xiàn)出規(guī)律性的耐藥性變遷。針對目前上海市豬丹毒桿菌耐藥性的變化，應(yīng)該引起廣泛重視。在臨床治療豬丹毒時，應(yīng)結(jié)合藥敏試驗結(jié)果科學(xué)合理用藥，同時注意給藥次數(shù)及時間，避免反復(fù)用藥，以避免增加豬丹毒桿菌的耐藥性。