濃戊二醛防凍消毒劑的防凍及消殺效果

龐學(xué)敏，謝書宇，盧 迪，齊六衛(wèi)，趙寶凱，楊作豐，劉 俊，高志峰，魏園園，董 娜

（1.遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，遼寧沈陽(yáng) 110015；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北武漢 430070；3.沈陽(yáng)偉嘉牧業(yè)技術(shù)有限公司，遼寧沈陽(yáng) 110027；4.沈陽(yáng)市農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法隊(duì)，遼寧沈陽(yáng) 110000）

2018 年我國(guó)首發(fā)非洲豬瘟疫情[1]。非洲豬瘟疫情對(duì)我國(guó)生豬飼養(yǎng)以及屠宰、運(yùn)輸、獸藥、飼料等相關(guān)產(chǎn)業(yè)都造成了極大沖擊，造成的損失不可估量。非洲豬瘟是我國(guó)的一類動(dòng)物疫病，發(fā)病率、病死率可高達(dá)100%[2]。針對(duì)非洲豬瘟，目前仍沒(méi)有有效的疫苗可用[3]，因此隔離傳染源、切斷傳播途徑是最有效的防控措施[4]。其中，消毒是最直接、有效、簡(jiǎn)單的控制手段之一，做好疫點(diǎn)、疫區(qū)消毒工作，可以有效抑制疫情擴(kuò)散[5]。

濃戊二醛是新一代醛類消毒劑[6]。它不僅克服了甲醛消毒劑的諸多缺點(diǎn)，也具有很強(qiáng)的廣譜殺菌能力，是當(dāng)前醛類消毒劑中應(yīng)用較廣的一種消毒劑，在農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公布的《非洲豬瘟疫情應(yīng)急實(shí)施方案》（第五版）中被列為推薦的消毒劑種類，主要應(yīng)用于車輛等運(yùn)輸工具、畜舍建筑物、圍欄、木質(zhì)結(jié)構(gòu)物、水泥表面、地面等的消毒，是生豬飼養(yǎng)場(chǎng)常用的開(kāi)放環(huán)境消毒藥。

東北地區(qū)冬季溫度常達(dá)-20 ℃以下，室外噴灑濃戊二醛消毒劑很快就會(huì)結(jié)成冰膜，直接限制了消毒液顆粒的運(yùn)動(dòng)，既起不到消毒作用，也會(huì)對(duì)路面行車安全造成隱患，對(duì)疫點(diǎn)、疫區(qū)的疫病防控以及省界動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督檢查站、飼養(yǎng)場(chǎng)戶的冬季日常消毒造成極大困擾。為解決東北地區(qū)冬季消毒問(wèn)題，向濃戊二醛消毒劑中添加不同量的防凍劑，并開(kāi)展防凍及消殺效果試驗(yàn)，篩選最佳防凍劑添加量。

1 材料與方法

1.1 材料

防凍劑：主要成分為乙二醇[7]，由沈陽(yáng)偉嘉生物技術(shù)有限公司提供；消毒劑：20%的濃戊二醛成品（批號(hào)2020120101），由沈陽(yáng)偉嘉生物技術(shù)有限公司提供；非洲豬瘟病毒：以高致病性Pig/HLJ/2018 毒株為骨架，構(gòu)建攜帶GFP 標(biāo)簽的感染性克隆毒株，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所（國(guó)家非洲豬瘟專業(yè)實(shí)驗(yàn)室）鑒定和保存；標(biāo)準(zhǔn)菌：金黃色葡萄球菌（G+）與大腸桿菌（G-），購(gòu)自廣州市辰飛生物科技有限公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂：沈陽(yáng)偉嘉生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 防凍性能測(cè)試標(biāo)準(zhǔn) 參照國(guó)家衛(wèi)生健康委辦公廳印發(fā)的《低溫消毒劑衛(wèi)生安全評(píng)價(jià)技術(shù)要求》。

1.2.2 防凍性能測(cè)試試驗(yàn) 將防凍劑分別以2、3、4 mL 的添加量加入到100 mL 濃戊二醛成品中（對(duì)應(yīng)體積分?jǐn)?shù)分別為2%、3%、4%），充分溶解，在-10 ℃條件下放置24 h，記錄防凍情況；將防凍劑分別以8、10、12、14 mL 的添加量加入到100 mL 濃戊二醛成品中（對(duì)應(yīng)體積分?jǐn)?shù)分別為8%、10%、12%、14%），充分溶解，在-20 ℃條件下放置24 h，記錄防凍情況。將不添加防凍劑的濃戊二醛成品作為空白對(duì)照組，在-20 ℃條件下放置24 h，記錄上凍情況[8]。

1.2.3 抑菌試驗(yàn) 依據(jù)《消毒劑實(shí)驗(yàn)室殺菌效果檢驗(yàn)方法》（GB/T 38502—2020），用斜面培養(yǎng)基分別培養(yǎng)金黃色葡萄球菌與大腸桿菌[9]，培養(yǎng)好后冷藏備用。配制營(yíng)養(yǎng)瓊脂，滅菌備用。在玻璃平皿中加入20 mL 營(yíng)養(yǎng)瓊脂，凝固后用生理鹽水沖洗斜面培養(yǎng)基，取3%的菌液加入涼至45 ℃以下的營(yíng)養(yǎng)瓊脂中，搖勻；取5 mL 加入平皿中，凝固后擺放4 個(gè)牛津杯，統(tǒng)一加樣量為200 μL（孔徑6 mm），分別加入生理鹽水（孔1）以及不加防凍劑消毒劑（孔2）、10%防凍消毒劑（孔3）和12%防凍消毒劑（孔4）的100 倍稀釋液，蓋上陶瓷蓋37 ℃恒溫培養(yǎng)12～16 h 后觀察抑菌圈大小。

1.2.4 體外殺滅非洲豬瘟病毒試驗(yàn) 委托中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所（國(guó)家非洲豬瘟專業(yè)實(shí)驗(yàn)室）開(kāi)展試驗(yàn)。依據(jù)《非洲豬瘟診斷技術(shù)》（GB/T 18648—2020），將12%的防凍消毒劑與病毒液等體積均勻混合，在-20～20 ℃的不同溫度條件下，每10 ℃設(shè)為一檔，分別作用10、30、60 min，加入中和劑室溫作用10 min；分別以5%、10%、20%的體積分?jǐn)?shù)用水稀釋防凍消毒劑，然后接種于已長(zhǎng)滿單層 PAMs 細(xì)胞（豬肺泡巨噬細(xì)胞）培養(yǎng)板中，每個(gè)稀釋度重復(fù)4 孔，同時(shí)分別設(shè)置中和劑對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組；放置于37 ℃5% CO2溫箱中培養(yǎng)，每24 h 觀察細(xì)胞狀態(tài)及病毒復(fù)制產(chǎn)生熒光情況[10]，96 h 后統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果。3 種稀釋度（體積分?jǐn)?shù)5%、10%、20%）的防凍消毒劑滅活病毒結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：以陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞90%以上出現(xiàn)明顯熒光信號(hào)，陰性對(duì)照組孔內(nèi)無(wú)熒光信號(hào)為前提，若試驗(yàn)組無(wú)明顯熒光信號(hào)，證明非洲豬瘟病毒被完全殺滅，若試驗(yàn)組孔內(nèi)出現(xiàn)明顯熒光信號(hào)，證明非洲豬瘟病毒未被防凍消毒劑完全滅活。

1.2.5 消毒劑含量檢測(cè) 依據(jù)《中國(guó)獸藥典》（2020年）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)。檢測(cè)樣品：添加防凍劑的濃戊二醛消毒液（體積分?jǐn)?shù)12%）和添加水的濃戊二醛消毒液（體積分?jǐn)?shù)12%）。檢測(cè)時(shí)間：配制成品前以及配制成品后24、48 h。檢測(cè)試劑：三乙醇胺溶液、鹽酸羥胺、純化水、異丙醇、溴酚藍(lán)乙醇、硫酸滴定液。含量檢測(cè)方法[11]：取本品1 mL（相當(dāng)于戊二醛約0.20 g），精密稱定，加入體積分?jǐn)?shù)6.5%的三乙醇胺溶液20 mL、鹽酸羥胺中性溶液（取鹽酸羥胺17.50 g，加水75 mL 溶解，用異丙醇稀釋至500 mL，搖勻，加體積分?jǐn)?shù)為0.04%的溴酚藍(lán)乙醇溶液15 mL，用體積分?jǐn)?shù)為6.5%的三乙醇胺溶液滴定至溶液顯藍(lán)綠色）25 mL，搖勻，放置1 h；用硫酸滴定液（0.25 mol/L）滴定至溶液顯藍(lán)綠色，并將滴定結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。每1 mL硫酸滴定液（0.25 mol/L）相當(dāng)于25.03 mg 戊二醛。戊二醛有效含量=（空白滴定體積-樣品滴定體積）×滴定液F 值×25.03/（樣品稱樣量× 規(guī)格）/1 000×100%；F 值=實(shí)際濃度/名義濃度。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 防凍效果

不同體積分?jǐn)?shù)的防凍消毒劑在-10℃、-20 ℃條件下，24 h 內(nèi)防凍性均較好，沒(méi)有出現(xiàn)凍結(jié)現(xiàn)象（表1）。

表1 不同體積分?jǐn)?shù)防凍消毒劑在不同溫度下的凍結(jié)情況

2.2 抑菌效果

各消毒劑100 倍稀釋后，大腸桿菌及金黃色葡萄球菌培養(yǎng)基的抑菌圈均可達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求（＞15 mm），對(duì)金黃色葡萄球菌較為敏感，其中添加防凍劑的消毒液抑菌圈平均大于不加防凍劑的消毒液1 mm 左右（表2）。

表2 消毒劑抑菌圈試驗(yàn)結(jié)果 單位：mm

2.3 殺滅非洲豬瘟病毒效果

5%稀釋的防凍消毒劑在20 ℃條件下作用10 min、10 ℃條件下作用30 min、0 ℃條件下作用60 min 均能完全滅活非洲豬瘟病毒，10%稀釋的防凍消毒劑在-10 ℃條件下作用30 min 能完全滅活非洲豬瘟病毒，20%稀釋的防凍消毒劑在-20 ℃條件下作用30 min 能完全滅活非洲豬瘟病毒（表3）。

表3 不同稀釋度防凍消毒劑與非洲豬瘟病毒作用后熒光觀察結(jié)果

2.4 有效含量

經(jīng)硫酸滴定，體積分?jǐn)?shù)12%的防凍消毒劑首次檢定結(jié)果與24、48 h 后的檢定結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)差為±0.04，有效含量（能夠抑菌的最低含量）分別為96.7%、96.2%和95.6%（表4），說(shuō)明戊二醛有效含量比較穩(wěn)定，在2020 年獸藥典規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)（95%～100%）。

表4 體積分?jǐn)?shù)12%防凍消毒液的有效含量檢測(cè)結(jié)果

3 討論

按照國(guó)家衛(wèi)生健康委辦公廳印發(fā)的《低溫消毒劑衛(wèi)生安全評(píng)價(jià)技術(shù)要求》，在低溫消毒劑說(shuō)明書規(guī)定的最低適用溫度下，測(cè)試該低溫消毒劑是否能保持液體狀態(tài)。取5 mL 低溫消毒劑（應(yīng)用液）放置于相應(yīng)低溫下過(guò)夜（＞8 h），觀察并記錄其性狀。該低溫消毒劑保持液體狀態(tài)，無(wú)析出、無(wú)結(jié)晶，則判定為合格。本試驗(yàn)證明，-10 ℃的環(huán)境下，在100 mL 濃戊二醛消毒劑中添加2 mL 防凍劑就可以起到很好的防凍效果，-20 ℃的環(huán)境下，在100 mL濃戊二醛消毒劑中添加8 mL 防凍劑也可以起到很好的防凍效果，可以有效解決冬季噴灑消毒藥瞬間結(jié)冰的窘境和難題。有試驗(yàn)證明，乙二醇作為防凍劑在低溫情況下的消毒效果最好[12]。本研究參考衛(wèi)生健康委消毒技術(shù)規(guī)范進(jìn)行低溫冷凍試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)更合理、更標(biāo)準(zhǔn)化。

通過(guò)抑菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，加入防凍劑的濃戊二醛消毒液抑菌效果非但沒(méi)有降低反而略有提升。這是因?yàn)榉纼鰟┑募尤?，增加了消毒液的流?dòng)性，降低了分子擴(kuò)散阻力，加快了消毒液擴(kuò)散速率，使其有效工作濃度得到保證甚至提升；而高濃度金屬離子和陽(yáng)離子表面活性劑具有高壓滲透作用，可非特異性造成病毒、細(xì)菌蛋白變性沉淀，增強(qiáng)其通透性，使其破裂死亡，從而使消毒劑分子更易進(jìn)入，致使消毒效果有效提升。

經(jīng)過(guò)硫酸滴定試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，防凍劑溶解后呈現(xiàn)pH 中性，理化性質(zhì)穩(wěn)定，無(wú)腐蝕性，不會(huì)與各類酸性或堿性消毒劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，抗有機(jī)物能力強(qiáng)，受有機(jī)物以及溫度影響小[13]，混合后長(zhǎng)時(shí)間放置也不會(huì)降低消毒液中有效成分含量，可連續(xù)使用24 h。

經(jīng)體外病毒殺滅試驗(yàn)證明，5%、10%、20%稀釋的防凍濃戊二醛消毒液，在設(shè)定溫度下都對(duì)非洲豬瘟病毒有很強(qiáng)的殺滅作用。濃戊二醛對(duì)非洲豬瘟病毒的殺滅原理為，消毒劑在低溫狀態(tài)下與病原蛋白質(zhì)結(jié)合，使其發(fā)生變性，破壞其生物膜結(jié)構(gòu)，從而抑制轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，破壞蛋白質(zhì)-DNA交聯(lián)等反應(yīng)?；瘜W(xué)消毒劑中戊二醛具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性[14]，結(jié)合防凍劑中的高濃度金屬離子和陽(yáng)離子表面活性劑的高壓滲透作用，可以導(dǎo)致非特異性病毒蛋白變性沉淀，因而提升了戊二醛分子深入病毒、殺滅病毒的能力。因此，在東北地區(qū)氣溫較低或高污染條件下，加入防凍劑的濃戊二醛消毒液依然具有對(duì)非洲豬瘟病毒很高的殺滅能力[15]。

冬天東北地區(qū)氣溫比較低，常規(guī)消毒劑在低溫狀態(tài)下容易結(jié)冰，消毒效果大打折扣，不能夠有效殺滅環(huán)境中的病原微生物，尤其是在非洲豬瘟病毒長(zhǎng)期存在的大背景下，因氣溫低而導(dǎo)致環(huán)境消殺不徹底，感染病毒的概率大幅增加。而以乙二醇為主要成分的防凍劑經(jīng)過(guò)試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，防凍效果比較好。乙二醇沸點(diǎn)高、冰點(diǎn)低，是國(guó)內(nèi)外較為常用的穩(wěn)定劑。配合使用濃戊二醛消毒劑能夠殺滅細(xì)菌和病毒，尤其是能夠殺滅非洲豬瘟病毒，從而為養(yǎng)豬業(yè)生物安全及環(huán)境消毒保駕護(hù)航。本研究結(jié)果表明，隨著濃度的提升，加入防凍劑的濃戊二醛防凍效果也隨著提升，且具有很好的貯存穩(wěn)定性，能夠有效滿足北方冬季殺滅非洲豬瘟病毒的需求。