表達(dá)長效生長激素的C HO細(xì)胞培養(yǎng)工藝的優(yōu)化及放大

梁久佳，劉玉林，劉涵，俞露，張凱寧，2，劉景會(huì)，李利

1.長春生物制品研究所細(xì)胞因子室，吉林長春130012；

2.長春理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春130022

許多治療性多肽和蛋白質(zhì)均具有較短的血漿半衰期，從幾分鐘到幾小時(shí)不等，導(dǎo)致必須頻繁地進(jìn)行給藥。生長激素相對分子質(zhì)量約為22 000，經(jīng)靜脈和皮下注射后的半衰期分別為0.36和3.4 h［1］。蛋白酶的降解和腎臟過濾的快速清除是導(dǎo)致半衰期縮短的主要原因。將生長激素與IgGFc段相結(jié)合可通過Fc段與其受體（neonatal Fc receptor，F(xiàn)cRn）結(jié)合減少蛋白酶的降解［2］，又因?yàn)榻Y(jié)合Fc段后相對分子質(zhì)量的顯著增加可有效減少腎臟的過濾作用［3］，而且在加入Fc片段后會(huì)引入糖基化位點(diǎn)，從而增加負(fù)電荷，進(jìn)一步使腎臟清除速度變慢［4］，從而可延長生長激素的半衰期。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞由于具有蛋白質(zhì)折疊、組裝和翻譯后修飾的能力，已成為臨床應(yīng)用的重組蛋白生產(chǎn)的主要系統(tǒng)。因此，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，其質(zhì)量和生物學(xué)活性要優(yōu)于其他宿主，如細(xì)菌、植物和酵母［5］。CHO細(xì)胞由于具有單細(xì)胞懸浮生長的能力，目前在重組蛋白產(chǎn)品的大規(guī)模生產(chǎn)領(lǐng)域占主導(dǎo)地位［6］。CHO細(xì)胞的規(guī)?；囵B(yǎng)是在生物反應(yīng)器中進(jìn)行的，其中溫度、pH、溶氧、通氣速率、攪拌槳轉(zhuǎn)速是生物反應(yīng)器的基本控制參數(shù)。先利用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（Design of Experiment，DOE）在小規(guī)模反應(yīng)器獲取相對較優(yōu)的培養(yǎng)條件，再利用相關(guān)的經(jīng)驗(yàn)公式放大，可在很大程度上實(shí)現(xiàn)足夠的氧氣供應(yīng)和細(xì)胞生長［7］。在不同體積的生物反應(yīng)器中，細(xì)胞往往很難處于同樣微環(huán)境當(dāng)中［8］，通過對培養(yǎng)過程的代謝產(chǎn)物分析，可更好地實(shí)現(xiàn)工藝一致性［9］。本研究旨在優(yōu)化表達(dá)重組人長效生長激素（recombinant human growth hormone Fc fusion protein，rhGH-Fc）的CHO細(xì)胞的培養(yǎng)工藝，使代謝副產(chǎn)物可以控制在合理區(qū)間內(nèi)，以提高表達(dá)量，并實(shí)現(xiàn)14 L到40 L的培養(yǎng)工藝放大。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株 表達(dá)rhGH-Fc的CHO細(xì)胞株由北京比洋生物技術(shù)有限公司構(gòu)建，細(xì)胞庫由長春生物制品研究所有限責(zé)任公司細(xì)胞因子室建立并保存。

1.2主要試劑及儀器 HycloneActipro基礎(chǔ)培養(yǎng)基、Hyclone cell boost 7a和Hyclone cell boost 7b補(bǔ)料培養(yǎng)基均購自美國GE公司；抗細(xì)胞結(jié)團(tuán)劑購自美國Thermo Fisher公司；NaHCO3購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Na2HPO4和NaH2PO4購自湖南九典制藥股份有限公司；葡萄糖、精氨酸和鹽酸購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；臺(tái)盼藍(lán)購自碧云天生物技術(shù)有限公司；Applikonez-control 7 L生物反應(yīng)器購自荷蘭Applikon公司；NewBrunSwick310 14 L生物反應(yīng)器和NewBrunSwick510 40 L生物反應(yīng)器購自德國Eppendorf公司；Mettler Toledo YSI 2950生化分析儀購自美國Xylem公司；Osmomat o30滲透壓儀購自德國Gonotec公司；ISF1-XC型CO2搖床購自瑞士Khner公司；CO2培養(yǎng)箱購自德國IRM公司；Count star細(xì)胞計(jì)數(shù)儀購自上海睿鈺生物科技有限公司；超微量分光光度計(jì)購自德國Implen公司；PerkinElmer Flexar型高效液相色譜儀購自美國Perkin-Elmer公司。

1.3N e w B r u n S w ic k31014L生物反應(yīng)器的工藝優(yōu)化

1.3.1細(xì)胞復(fù)蘇 提前在Actipro培養(yǎng)基中加入0.5%（v／v）抗細(xì)胞結(jié)團(tuán)劑，取20 mL培養(yǎng)基于75 cm2方瓶中，置37℃，5%CO2孵箱中孵育30 min備用。從液氮罐中取出1支工作細(xì)胞，于37℃水浴鍋中迅速融化，將細(xì)胞懸液加入預(yù)先孵育的培養(yǎng)基中，混勻后置37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)24 h。

1.3.2細(xì)胞種子液的制備 提前在Actipro培養(yǎng)基中加入0.5%（v／v）抗細(xì)胞結(jié)團(tuán)劑，取40 mL培養(yǎng)基于125 mL搖瓶中，置37℃，5%CO2搖床中孵育30 min備用。將方瓶中培養(yǎng)24 h的細(xì)胞液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，800×g離心10 min，棄上清，取6 mL孵育好的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，全部轉(zhuǎn)移至125 mL搖瓶中，混勻后置37℃，5%CO2搖床中培養(yǎng)24 h。

提前在Actipro培養(yǎng)基中加入0.5%（v／v）抗細(xì)胞結(jié)團(tuán)劑，取120 mL培養(yǎng)基于500 mL搖瓶中，置37℃，5%CO2搖床中孵育30 min備用。將搖瓶中培養(yǎng)24 h的細(xì)胞液全部轉(zhuǎn)移至500 mL搖瓶中。此后每天取樣，用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，待細(xì)胞密度達(dá)2×106個(gè)／mL時(shí)，同樣方法分至2個(gè)搖瓶中。待4個(gè)搖瓶中細(xì)胞密度達(dá)2×106個(gè)／mL時(shí)，接種至生物反應(yīng)器中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.3NewBrunSwick310生物反應(yīng)器培養(yǎng) 生物反應(yīng)器滅菌后，待罐體溫度降至40℃以下，向罐體中泵入50%（v／v）最大工作體積Actipro培養(yǎng)基，通氣設(shè)置為0.02 vvm。待溶氧電極極化完畢后，進(jìn)行溶氧參數(shù)校正。溶氧參數(shù)校正完畢后，設(shè)置反應(yīng)器操作參數(shù)：轉(zhuǎn)速、溫度、pH、溶氧、通氣速率，見表1。待參數(shù)穩(wěn)定后，接種細(xì)胞開始培養(yǎng)，第3天后開始取樣、計(jì)數(shù)、測定生化代謝參數(shù)以及滲透壓。第3天后開始每天補(bǔ)加總培養(yǎng)體積3%的cell boost 7a和總培養(yǎng)體積0.3%的cell boost 7b，當(dāng)葡萄糖濃度低于2 g／L時(shí)，需補(bǔ)加240 g／L的葡萄糖溶液至培養(yǎng)液葡萄糖終濃度為4 g／L。當(dāng)細(xì)胞數(shù)達(dá)（1.2～1.5）×107個(gè)／mL時(shí)進(jìn)行降溫培養(yǎng)，7～8 d后離心收獲上清液。

表1 14 L生物反應(yīng)器各批次培養(yǎng)條件Tab.1 Culture condition for various batches in 14 L bioreactor

1.4N e w B r u n S w ic k31014L生物反應(yīng)器到N e w B r u n-S w ic k510 40 L生物反應(yīng)器工藝放大 NewBrunSwick-510 40 L生物反應(yīng)器細(xì)胞培養(yǎng)流程與NewBrunSwick 310 14 L生物反應(yīng)器一致，區(qū)別僅在于NewBrun-Swick510 40 L的種子培養(yǎng)過程在7 L Applikon生物反應(yīng)器中進(jìn)行，接種時(shí)采用快接頭對接的方式接種。NewBrunSwick510 40 L生物反應(yīng)器的培養(yǎng)條件見表2。

表2 40 L生物反應(yīng)器各批次培養(yǎng)條件Tab.2 Culture condition for various batches in 40 L bioreactor

1.5代謝過程參數(shù)的測定

1.5.1細(xì)胞數(shù) 每天取樣后，取45μL培養(yǎng)液與0.2%臺(tái)盼藍(lán)溶液混合，取20μL，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測定細(xì)胞數(shù)。

1.5.2滲透壓 每天取樣后，取1mL培養(yǎng)液，2 500×g離心5 min，收集上清液，取50μL，使用冰點(diǎn)滲透壓儀測定滲透壓。

1.5.3葡萄糖、乳酸、銨離子、鉀離子 每天取樣后，取1 mL培養(yǎng)液，1 500×g離心5 min，收集上清液，取200μL，使用生化分析儀進(jìn)行測定。按下式計(jì)算比耗糖速率。

比耗糖速率［g／（109cell·d）］=（前一天葡萄糖量+補(bǔ)料中葡萄糖量-當(dāng)前葡萄糖量）／cells

1.5.4表達(dá)量 將收獲后的培養(yǎng)液800×g離心10 min，收集上清液，繼續(xù)4 500×g離心20 min，收集上清液，經(jīng)0.45μm濾膜過濾澄清后，采用HPLC法測定rhGH-Fc表達(dá)量（1.076×積分峰面積／5 026 100.83）。色譜條件：色譜柱為Aglient Bio-Monolith Protein A Columns；流動(dòng)相A為20 mmol／L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）；流動(dòng)相B為甘氨酸鹽酸緩沖液（pH 2.8）；上樣量100μL；流速1.0 mL／min；檢測波長280 nm。

2 結(jié)果

2.1N e w B r u n S w ic k31014L生物反應(yīng)器工藝優(yōu)化結(jié)果

2.1.1代謝過程產(chǎn)物 開始培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞數(shù)呈指數(shù)生長趨勢，降溫后仍可增長2 d，降溫后第3天細(xì)胞數(shù)達(dá)到整個(gè)培養(yǎng)周期峰值，此后開始下降見圖1A；培養(yǎng)開始時(shí)乳酸逐漸累積，第5天開始消耗，降溫3 d后乳酸又從消耗轉(zhuǎn)變?yōu)槔鄯e，見圖1B；降溫前滲透壓基本穩(wěn)定在320 mOsm／kg左右，降溫后開始逐漸增加，見圖1C；銨離子和鉀離子在培養(yǎng)開始后逐漸增加，見圖1D、1E；細(xì)胞培養(yǎng)第7天后降溫，降溫開始后比耗糖速率先降低，降溫第3天后開始升高，降溫第5天后趨于穩(wěn)定，降溫后比耗糖速率見圖1F。

圖1 310各批次代謝過程產(chǎn)物檢測結(jié)果Fig.1 Metabolic process products of 310 STD-1 lot，310 STD-2 lot，310 STD-3 lot and 310 STD-4 lot

2.1.2蛋白表達(dá)量 STD-1、STD-2、STD-3、STD-4批蛋白表達(dá)量分別為0.59、0.76、0.31、0.90 g／L。細(xì)胞培養(yǎng)降溫后蛋白表達(dá)量逐日升高，見圖2（以STD-4批為例）。

圖2 310 STD-4批每日蛋白表達(dá)量Fig.2 Expression levels of protein of 310 STD-4 lot on various days

2.2N e w B r u n S w ic k 510 40 L生物反應(yīng)器工藝放大結(jié)果

2.2.1代謝過程產(chǎn)物 510各批次代謝產(chǎn)物趨勢無明顯差異，且與310各批次代謝產(chǎn)物趨勢一致，見圖3。

圖3 510各批次代謝過程產(chǎn)物檢測結(jié)果Fig.3 Metabolic process products of 510 STD-1 lot，510 STD-2 lot and 510 STD-3 lot

2.2.2蛋白表達(dá)量 510 STD-1、STD-2、STD-3批耗糖曲線變化趨勢一致，蛋白表達(dá)量分別0.94、1.01、0.97 g／L，與310培養(yǎng)時(shí)無明顯差異。

3 討論

由于細(xì)胞在整個(gè)培養(yǎng)周期的生命活動(dòng)是動(dòng)態(tài)變化的，前期培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞數(shù)目少，對氧的需求量小，較小的通氣速率即可滿足其生長所需，此時(shí)培養(yǎng)基中的碳源也不須補(bǔ)充，對攪拌速率的要求也較低，因此本實(shí)驗(yàn)前期采用小通氣速率、低攪拌速度。而后期進(jìn)行蛋白表達(dá)時(shí)，對營養(yǎng)物質(zhì)以及氧的需求較高，因此后期需提高氧的傳遞，本實(shí)驗(yàn)采用后期增加轉(zhuǎn)速及通氣速率的方式來增加氧傳遞。培養(yǎng)時(shí)需對整個(gè)培養(yǎng)周期進(jìn)行代謝過程產(chǎn)物的檢測，以防止培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生代謝失衡。常見的代謝產(chǎn)物包括乳酸、銨離子、鉀離子、鈉離子，而葡萄糖與谷氨酰胺通常作為能源物質(zhì)也需監(jiān)測。其中較重要的代謝產(chǎn)物為乳酸與銨離子，乳酸的產(chǎn)生與多種因素有關(guān)，乳酸的異常變化提示培養(yǎng)過程的代謝異常［10］。本實(shí)驗(yàn)檢測了乳酸、銨離子、鉀離子的代謝情況。乳酸的變化為在開始培養(yǎng)時(shí)逐漸累積，而后由于攪拌槳轉(zhuǎn)速的升高與通氣速率的提升會(huì)由累積轉(zhuǎn)變?yōu)橄?，降? d后會(huì)再次升高。本實(shí)驗(yàn)中310 STD-3批培養(yǎng)由于后續(xù)通氣速率過低，導(dǎo)致pH降至最低控制限，從而與堿液添加造成惡性閉環(huán)，引起代謝失衡。而銨離子的濃度直接影響細(xì)胞狀態(tài)，而且高濃度的銨離子會(huì)影響蛋白的修飾水平［11］，銨離子的代謝為從培養(yǎng)開始時(shí)到培養(yǎng)結(jié)束一直累積，后期隨著銨離子濃度的升高，細(xì)胞狀態(tài)會(huì)快速降低，當(dāng)銨離子濃度達(dá)10 mmol／L左右即需進(jìn)行收獲。本實(shí)驗(yàn)中所有批次收獲時(shí)銨離子濃度均未達(dá)到10 mmol／L。良好的培養(yǎng)條件可使代謝產(chǎn)物維持在較好的范圍內(nèi)，從而使細(xì)胞狀態(tài)更佳，表達(dá)時(shí)間更長，獲得更高的表達(dá)量。

在小型反應(yīng)器進(jìn)行DOE后，細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的許多控制參數(shù)已確定，如溫度、pH、溶解氧，而培養(yǎng)基、補(bǔ)糖策略也無需再做調(diào)整。在反應(yīng)器已選型結(jié)束的情況下，在不同體積反應(yīng)器中的培養(yǎng)可調(diào)整的參數(shù)只有攪拌槳轉(zhuǎn)速與通氣速率。在反應(yīng)器規(guī)模擴(kuò)大的考量下，小體積生物反應(yīng)器的轉(zhuǎn)速不宜過低，由于培養(yǎng)規(guī)模的擴(kuò)大，轉(zhuǎn)速過低無法保證大體積反應(yīng)器的混勻效果，而且攪拌速率的增加可提高氣泡在培養(yǎng)液中的停留時(shí)間［12］。本實(shí)驗(yàn)在優(yōu)化310培養(yǎng)條件時(shí)，旨在提高攪拌槳轉(zhuǎn)速，以期為后續(xù)實(shí)驗(yàn)放大奠定良好的基礎(chǔ)。關(guān)于攪拌速率的放大，主要依賴于維持單位體積攪拌功率（P／V）一致的方法放大［13-14］。由于哺乳動(dòng)物細(xì)胞無細(xì)胞壁，不耐剪切，葉尖速度最高不能超過1.0 m／s。本實(shí)驗(yàn)在放大時(shí)考慮到由于小體積生物反應(yīng)器的電極及取樣管路均深入至培養(yǎng)液中，可在一定程度上增加氧的傳遞，因此，在后續(xù)放大時(shí)略增加一些轉(zhuǎn)速，但最終葉尖速度仍在安全范圍內(nèi)，而增加的轉(zhuǎn)速也未對細(xì)胞產(chǎn)生明顯損傷。通氣速率與CO2的去除、泡沫的產(chǎn)生密切相關(guān)，過低的通氣速率會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)中CO2的快速積累，使得pH降低與堿液添加形成惡性閉環(huán)，最終導(dǎo)致整體滲透壓的快速升高、細(xì)胞代謝失衡［15-16］。在培養(yǎng)周期中，通過通氣速率的增加，氣泡可帶走培養(yǎng)液中溶解的CO2。但過多的氣泡會(huì)在培養(yǎng)液表面停留從而產(chǎn)生泡沫，氣泡在上升至氣液交界處會(huì)產(chǎn)生射泡現(xiàn)象，使附著在氣泡表面的細(xì)胞受到較大剪切力，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。本實(shí)驗(yàn)中采用的通氣孔直徑約為1 mm，較通氣直徑?。ㄐ∮?5μm）所產(chǎn)生的氣泡對細(xì)胞的傷害小，但由于氣泡本身體積增大，相較微泡通氣在液體中的停留時(shí)間短，分布范圍窄，氧傳遞系數(shù)低，因此較微泡通氣所需的通氣量大大提高。但大氣泡可更好地帶走溶液中溶解的CO2，在培養(yǎng)過程中可通過增加通氣速率來使pH維持在最低控制限內(nèi)，從而減少堿液添加。本實(shí)驗(yàn)中310 STD-4通過增加通氣速率替代了堿液的流加，從而使得滲透壓得到了較好的控制。后續(xù)放大至40 L生物反應(yīng)器也可通過通氣速率來減少甚至替代堿液流加。在培養(yǎng)液中添加保護(hù)劑，如非離子表面活性劑Pluronic家族，可減輕細(xì)胞所受到的來自于攪拌和通氣所帶來的機(jī)械破損。通氣策略的改變可使得細(xì)胞在培養(yǎng)過程中堿液的添加量降低，從而降低整個(gè)培養(yǎng)過程中的滲透壓，使細(xì)胞維持良好的狀態(tài)。放大過程中通氣策略和攪拌轉(zhuǎn)速的平衡可依據(jù)氧傳遞系數(shù)（KLa）進(jìn)行，KLa可通過廠家提供的技術(shù)文件獲得，也可自行測量［17］。本實(shí)驗(yàn)在310 STD-4的基礎(chǔ)上進(jìn)行放大，以后期KLa為基本參照，對公式計(jì)算后的攪拌速率及通氣速率進(jìn)行調(diào)整，以維持后期KLa基本一致，從而獲得40 L生物反應(yīng)器的培養(yǎng)工藝。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立了表達(dá)rhGH-Fc的CHO細(xì)胞培養(yǎng)的規(guī)?；瘮U(kuò)大方法，為后續(xù)進(jìn)一步擴(kuò)大生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。