嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2核衣殼蛋白的制備及其初步應(yīng)用

李光，任仲，胡道奇，劉汨，李克強(qiáng)，張玉玲，周松輝，方曉蘭，李衛(wèi)平，滕淑靜

1.岳陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 岳陽414000；2.湖南康潤藥業(yè)股份有限公司，湖南 岳陽414000；

3.免疫診斷試劑湖南省工程研究中心，湖南岳陽414000

嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severeacuterespiratory syndromecoronavirus2，SARS-CoV-2）引起的新型冠狀病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）疫情在世界范圍內(nèi)持續(xù)蔓延，嚴(yán)重影響人類的衛(wèi)生健康。SARS-CoV-2屬于冠狀病毒科β冠狀病毒屬，基因組主要編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白：刺突蛋白（spike protein，S蛋白）、核衣殼蛋白（nucleocapsid protein，N蛋白）、包膜蛋白（envelope protein）、膜蛋白（membrane protein）。其中N蛋白由413個(gè)氨基酸殘基組成，結(jié)合于病毒基因組RNA上形成核衣殼，N蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平的免疫反應(yīng)，恢復(fù)期患者血清中含有大量的N蛋白抗體。針對(duì)N蛋白的IgM和IgG抗體是SARS-CoV-2感染的重要檢測靶標(biāo)。

SARS-CoV-2的N蛋白是一個(gè)緊密的、交織的二聚體，通過與RNA及關(guān)鍵宿主細(xì)胞蛋白的相互作用在體內(nèi)形成或調(diào)節(jié)生物分子凝聚體，可能利用這種活性來調(diào)節(jié)病毒的生命周期和宿主細(xì)胞對(duì)病毒感染的反應(yīng)［1-2］。免疫印跡試驗(yàn)結(jié)果顯示，COVID-19感染患者血清中存在抗N蛋白的IgA、IgM和IgG抗體，證明了N蛋白在宿主免疫和診斷中的重要性［3］。用熒光素酶免疫沉淀分析系統(tǒng)（luciferase immuno precipitation system，LIPS）定量檢測100例SARS-CoV-2感染患者血漿或血清中N蛋白和S蛋白抗體，結(jié)果顯示，抗SARS-CoV-2的N蛋白抗體比S蛋白抗體對(duì)早期感染更敏感［4］。基于重組N蛋白和重組S蛋白的ELISA用于抗體（IgM和／或IgG）檢測，陽性樣本檢出率分別為80.4%和82.2%，抗N蛋白的IgM和IgG陽性率隨發(fā)病后天數(shù)的增加而升高，但在發(fā)病35 d后IgM陽性率下降［5］。將N蛋白用于稀土摻雜納米顆粒橫向流動(dòng)免疫分析，實(shí)現(xiàn)了快速靈敏檢測IgG抗體［6］。新型冠狀病毒的S蛋白能夠誘導(dǎo)中和抗體，因此，很多研究者以抗S蛋白抗體作為檢測目標(biāo)［7］。但也有研究顯示，由于N蛋白在活躍感染期間的大量表達(dá)，證明其更具免疫原性［8］。

相比真核表達(dá)系統(tǒng)，原核表達(dá)系統(tǒng)具有高效、廉價(jià)的優(yōu)勢，用大腸埃希菌表達(dá)N蛋白是最佳選擇。重組蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)往往形成誘導(dǎo)包涵體，可收獲大量的重組N蛋白，利于進(jìn)一步的純化及應(yīng)用。N蛋白具有高的PI值（10.07），能夠通過與RNA和宿主蛋白相互結(jié)合形成生物分子凝聚體［8］，增加了純化的難度。通過復(fù)性，使包涵體蛋白恢復(fù)天然狀態(tài)，與雜質(zhì)分離，具有了生物活性，才可用于檢測或診斷［9］。本研究利用大腸埃希菌大量表達(dá)SARS-CoV-2重組N蛋白，并經(jīng)兩步陽離子交換層析純化后，利用其制備免疫膠體金檢測試劑。

1 材料與方法

1.1質(zhì)粒及菌株 含N蛋白基因的重組質(zhì)粒pET-28a、感受態(tài)大腸埃希菌BL21（DE3）由蘇州泓迅生物科技股份有限公司提供。

1.2主要試劑及儀器 瓊脂粉、氨芐青霉素（Ampicillin）、BCA蛋白定量試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；蛋白胨、酵母粉購自英國OXDID公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體、鼠抗人IgM（2 mg／mL）、鼠抗人IgG（2 mg／mL）、羊抗雞IgY及酪蛋白購自北京索萊寶科技有限公司；膠體金由湖南康潤藥業(yè)股份有限公司實(shí)驗(yàn)室合成并提供；兔抗SARS-CoV-2 N蛋白單抗由義翹神州公司惠贈(zèng)；IPTG、Ni-NTA瓊脂糖樹脂、G25葡聚糖凝膠、SP FF陽離子瓊脂糖樹脂購自美國GE公司；CM Focurose 6HP陽離子瓊脂糖樹脂購自日本東曹化工公司；Biological LP層析儀為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.3重組N蛋白的表達(dá) 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌BL21（DE3），于瓊脂平板上挑取單個(gè)菌落，接種至3 mL LB液體培養(yǎng)基（含50μg／mL氨芐青霉素），37℃，200 r／min振蕩培養(yǎng)過夜；將菌液接種至500 mL LB液體培養(yǎng)基（含50μg／mL卡那霉素，在自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中另外加入0.2%乳糖、0.05%葡萄糖、0.5%甘油、0.05 mol／L tris）中，37℃，250 r／min振蕩培養(yǎng)至A600為0.8~1.2（約5 h）時(shí)，分別加入IPTG使其終濃度為0、1 mmol／L，37℃誘導(dǎo)表達(dá)過夜；4 500×g離心30 min，收集菌體，沉淀重懸于50 mL裂解液（PB+1%triton X100）中，冰上超聲破碎（600 W超聲3 s，間歇7 s，總工作時(shí)間30 min），4℃，30 000×g離心30 min，棄上清，沉淀用終濃度6 mol／L尿素溶液溶解，再次離心，收集上清，即為溶解的包涵體蛋白。

1.4重組N蛋白的純化

1.4.1Ni柱親和層析純化工藝 用含尿素平衡緩沖液（50 mmol／L PB，100 mmol／L NaCl，pH 9.0，6 mol／L尿素）平衡Ni-NTA親和柱；將6 mol／L尿素溶解的包涵體蛋白用上述平衡緩沖液稀釋1倍上樣，5 mL／min；上樣完成后，繼續(xù)用含尿素平衡緩沖液沖洗，直至280 nm紫外吸收峰回基線附近；分別用50、100、150、250、500 mmol／L咪唑緩沖液洗脫，分步收集樣品。

1.4.2SP強(qiáng)陽離子交換層析純化工藝 用含尿素平衡緩沖液（50 mmol／L PB，pH 9.0）+6 mol／L尿素平衡SP陽離子交換柱；將8 mol／L尿素溶解的包涵體蛋白用上述平衡緩沖液稀釋2倍后上樣，流速5 mL／min；上樣完成后，繼續(xù)用含尿素平衡緩沖液沖洗，直至280 nm紫外吸收峰回基線附近；用不含尿素平衡緩沖液（50 mmol／L PB，pH 9.0）緩慢置換含尿素平衡緩沖液，1 mL／min，使緩沖液中尿素含量逐步下降至0%，總時(shí)間800 min，使目的蛋白復(fù)性；分別用0.35 mol／L NaCl，50 mmol／L PB緩沖液洗除雜蛋白，0.45 mol／L NaCl，50 mmol／L PB緩沖液洗脫目的蛋白，收集樣品，進(jìn)行12%SDS-PAGE分析。1.4.3CM弱陽離子交換層析純化工藝 將SP強(qiáng)陽離子交換層析洗脫的目的蛋白用50 mmol／L PB緩沖液（pH 9.0）稀釋5倍，上CM柱，流速5 mL／min；上樣完成后，繼續(xù)用該緩沖液沖洗3倍柱體積；分別用緩沖液（50 mmol／L PB，0.25 mol／L NaCl，pH 9.0）洗除雜蛋白，緩沖液（50 mmol／L PB，0.3 mol／L NaCl，pH 9.0）洗脫目的蛋白，收集樣品，進(jìn)行12%SDS-PAGE分析。

1.5蛋白脫鹽 用緩沖液（20 mmol／L tris，50 mmol／L甘氨酸，pH 8.0）平衡G25葡聚糖凝膠柱；取20 mL純化后的重組N蛋白上柱，1 mL／min；用上述緩沖液沖洗，收集蛋白峰，加入終濃度為0.1%的SDS，-20℃保存。

1.6重組N蛋白鑒定 將純化的重組N蛋白進(jìn)行12%SDS-PAGE分離，300 mA恒流電轉(zhuǎn)60 min；5%脫脂牛奶室溫封閉1 h；加入兔抗SARS-CoV-2 N蛋白單抗（1∶2 000稀釋），4℃孵育過夜；TBST洗膜3次，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體（1∶10 000稀釋），室溫孵育1 h；加入TMB溶液顯色。

1.7膠體金免疫檢測試劑制備及性能測試 將膠體金標(biāo)記的SARS-CoV-2 N蛋白與膠體金標(biāo)記的雞IgY按比例（5∶1）混合，以5μL／cm的速度噴制樣品墊，在37℃干燥過夜。用鼠抗人IgM（2 mg／mL）、鼠抗人IgG（2 mg／mL）和羊抗雞IgY（1 mg／mL）在硝酸纖維素膜上以1μL／cm的速度劃線，分別標(biāo)記為M、G和C線，在45℃干燥過夜。貼板、切條、裝卡即得膠體金檢測試劑。

試劑盒性能測試：28例經(jīng)核酸檢測確診陽性的COVID-19患者滅活血清樣本和70例非相關(guān)疾病患者滅活血清樣本（由美國dAbImmunotech，lnc.公司提供），分別取10μL，滴入樣本墊中，快速加入100μL PBS稀釋液，15 min后通過IgM和／或IgG線及對(duì)照線的顯色定性試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判定，紅色為陽性。

2 結(jié)果

2.1N蛋白的表達(dá) 表達(dá)的重組N蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約為49 000，大小與理論值（48 850）相符，誘導(dǎo)后N蛋白以包涵體形式表達(dá)，表達(dá)量約占包涵體總蛋白的30%，見圖1。

圖1 表達(dá)的重組N蛋白的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGEprofile of expressed recombinant Nprotein

2.2蛋白純化

2.2.1Ni柱親和層析純化 用50、100、150、250和500 mmol／L咪唑緩沖液分離N蛋白與其他蛋白，雖然蛋白純度有一定提高，但整體純化效果不佳，收率低，不適用于重組N蛋白純化，見圖2。

圖2 Ni-NTA親和層析純化的重組N蛋白的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE profile of recombinant N protein purified by Ni-NTA chromatography

2.2.2SP強(qiáng)陽離子交換層析純化 大部分雜蛋白位于穿透峰中，重組N蛋白獲得較好分離，見圖3，圖中2個(gè)箭頭分別指示尿素濃度從6 mol／L逐步下降為0 mol／L的時(shí)間，共約850 min，下降速度約7 mmol／min。

圖3 重組N蛋白的SP強(qiáng)陽離子交換層析圖Fig.3 SPstrong cation exchange chromatogram of recombinant N protein

2.2.3CM弱陽離子交換層析純化 有較多的雜蛋白得到分離，該純化工藝進(jìn)一步提高了N蛋白的純度，見圖4。

圖4 重組N蛋白的CM弱陽離子交換層析圖Fig.4 CM weak cation exchange chromatogram of recombinant N protein

2.3純化產(chǎn)物的鑒定 SP強(qiáng)陽離子交換層析和CM弱陽離子交換層析兩步純化后的N蛋白經(jīng)12%SDS-PAGE分析，純度在90%以上，比Ni柱親和層析純化效率高。Western blot分析顯示，該蛋白在相對(duì)分子質(zhì)量49 000處可見特異性反應(yīng)條帶。見圖5。重組N蛋白溶液在4℃保存1個(gè)月無明顯降解（數(shù)據(jù)省略）。

圖5 純化的重組N蛋白的SDS-PAGE（A）及Western blot（B）分析Fig.5 SDS-PAGE（A）and Western blot（B）profiles of purified recombinant N protein

2.4膠體金免疫試劑性能 70例非相關(guān)疾病患者滅活血清樣本的IgM和IgG抗體均為陰性，28例COVID-19患者滅活血清樣本中19例顯示IgM陽性，21例顯示IgG陽性，表明該試劑可初步用于檢測血清中的相應(yīng)抗體。

3 討論

SARS-CoV-2的N蛋白可用于血清學(xué)檢測，也可作為免疫原制備單克隆抗體。N蛋白能以包涵體和可溶性蛋白的形式在大腸埃希菌中表達(dá)，但可溶性N蛋白表達(dá)的效率不高。為了實(shí)現(xiàn)N蛋白的穩(wěn)定高產(chǎn)，包涵體是一種合適的表達(dá)形式，但包涵體在形成過程中包裹了大量的宿主蛋白和核酸，且包涵體蛋白是以一種無序的形式緊密折疊，無法提供正確的B細(xì)胞表位，降低了檢測靈敏度及特異性。本研究設(shè)計(jì)了以陽離子交換色譜為主的純化工藝，通過兩步離子交換層析，蛋白質(zhì)在層析柱上復(fù)性，使用非常柔和的復(fù)性條件，實(shí)現(xiàn)了包涵體蛋白的正確重折疊，保留了蛋白的天然活性。

包涵體中N蛋白以無序糾纏狀態(tài)存在，密度較高，強(qiáng)堿性的N蛋白往往與酸性蛋白和核酸緊密結(jié)合。在高濃度尿素溶液中，重組N蛋白以一級(jí)結(jié)構(gòu)形式存在，肽鏈得到充分舒展并與其他帶陰離子的雜質(zhì)因不同的電荷狀態(tài)在陽離子樹脂上獲得分離。如果快速降低緩沖液中的尿素濃度，N蛋白會(huì)再次形成不溶性包涵體。而在SP強(qiáng)陽離子交換柱中緩慢降低尿素濃度的條件下，N蛋白緩慢實(shí)現(xiàn)了正確的重折疊，從而恢復(fù)了正確的二級(jí)結(jié)構(gòu)，成為可溶性的活性蛋白，一步實(shí)現(xiàn)了重組N蛋白的純化及復(fù)性。SP柱洗脫液仍有一定量的雜蛋白與重組N蛋白同時(shí)存在，為了分離這部分蛋白，使用顆粒更加精細(xì)、分辨率更高的CM弱陰離子樹脂，利用兩者攜帶電荷的差異分離雜蛋白，最終N蛋白電泳純度大于90%，制備的膠體金免疫檢測試劑也可初步用于檢測血清中相應(yīng)抗體。

大腸埃希菌表達(dá)的重組蛋白約80%會(huì)形成包涵體，目前工業(yè)生產(chǎn)的生物制藥中也有30%仍然使用大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)［9］，利用包涵體實(shí)現(xiàn)重組蛋白的穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)具有重要意義，但沒有一種通用的方法能夠同時(shí)滿足所有蛋白的復(fù)性，研究者們也使用了多種多樣的手段和方法來實(shí)現(xiàn)包涵體的復(fù)性［10-15］。本研究采用兩步陽離子交換層析、柱上復(fù)性的方法純化N蛋白，效率高、操作簡單、易于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，對(duì)于其他包涵體蛋白的純化也具有借鑒價(jià)值。