利用慢病毒包裝小窩蛋白-1過表達穩(wěn)定細胞株的構建

劉楊，許淑娟，李瓊毅，劉翊忠

1.西北民族大學生物醫(yī)學研究中心生物工程與技術國家民委重點實驗室，甘肅蘭州730030；

2.西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州730030

小窩結(jié)構（Caveolae）是位于細胞表面的穴樣內(nèi)陷結(jié)構，可介導多種生物大分子物質(zhì)進入細胞內(nèi)，其中小窩蛋白-1（Caveolin-1）是Caveolae最重要的組成蛋白，也是Caveolae發(fā)揮作用最重要的蛋白。Caveolin-1相對分子質(zhì)量為21 000～24 000，廣泛分布于上皮、內(nèi)皮、成纖維及平滑肌細胞中，主要序列包括中央高度保守的疏水區(qū)及兩側(cè)可變的N-端和C-端區(qū)域［1］。

Caveolin-1是內(nèi)吞途徑的重要蛋白，在病毒感染宿主細胞早期發(fā)揮重要的促進作用。另外，該蛋白還可參與多種細胞活動，包括細胞周期調(diào)節(jié)、膽固醇轉(zhuǎn)運排出及血管生成等［2-5］，Caveolin-1的腳手架結(jié)構域（Caveolin scaffolding domain，CSD）與一些細胞膜上的信號分子也存在相互作用，調(diào)控細胞的信號轉(zhuǎn)導及細胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)化和癌變等過程［6］。近年來，隨著病毒感染宿主細胞研究機制的不斷深入，多項研究提示，Caveolin-1與病毒感染細胞密切相關；其可促進大部分病毒如猿猴空泡病毒40、人冠狀病毒及口蹄疫病毒等感染宿主細胞［7-10］；同時對少量病毒如人類免疫缺陷病毒的感染過程又發(fā)揮抑制作用［11-12］。

本實驗從BHK-21細胞中擴增Caveolin-1基因，經(jīng)雙酶切、連接、轉(zhuǎn)化等過程構建重組質(zhì)粒pTRIPCav1；將其及對照質(zhì)粒pTRIP-EGFP分別轉(zhuǎn)染至HEK-293T細胞中，收集慢病毒并感染BHK-21細胞，構建Caveolin-1過表達穩(wěn)定細胞株BHK-Cav1及過表達綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protei，EGFP）的對照細胞株BHK-EGFP，并對兩種細胞株的穩(wěn)定性、過表達特性和細胞活力進行檢測。

1 材料與方法

1.1細胞及質(zhì)粒 倉鼠腎細胞BHK-21及人胚胎腎細胞HEK-293T均由西北民族大學生物醫(yī)學研究中心提供；E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細胞、載體pTRIPCMV及質(zhì)粒pTRIP-EGFP均由西北民族大學生物工程與技術國家民委重點實驗室提供；載體pMD18-T購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2主要試劑及儀器 TRIzol?Reagent試劑盒及LipofectamineTM2000 Reagent購自美國Invitrogen公司；Proliferation細胞活力檢測試劑盒購自美國Gromega公司；質(zhì)粒提取試劑盒及膠回收試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；TIANScript M-MLV及TaqDNA聚合酶均購自天根生化科技（北京）有限公司；BamHⅠ、XbaⅠ限制性內(nèi)切酶及T4 DNA連接酶均購自寶生物工程（大連）有限公司；ECL顯色試劑盒購自美國PerkinElmer公司；聚凝胺（Polybrene）、嘌呤霉素（Puromycin）及兔抗Caveolin-1單克隆抗體均購自上海碧云天生物技術有限公司；兔抗GAPDH抗體購自英國Abcam公司；熒光標記的山羊抗兔抗體購自美國Jackson ImmunoResearch公司；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染料購自美國Sigma公司；新生牛血清（NBS）、胎牛血清（FBS）及DMEM培養(yǎng)基購自蘭州民海生物工程有限公司；PCR儀購自德國Biometra公司；凝膠成像系統(tǒng)購自美國GE公司；酶標儀購自美國Thermo Fisher公司；生物熒光倒置顯微鏡購自日本Olympns公司。

1.3Caveolin-1基因的擴增 根據(jù)GenBank中登錄的Caveolin-1基因序列（NM_GU075958.1）應用Primer5軟件設計引物。上游引物：5′-GCTCTAGAATGTCTGGGGGCAAATACGTGGACTC-3′，下游引物：5′-CGGGATCCTCATATCTCTTTCTGCGTGCTGATGC-3′，擴增片段大小為537 bp。引物由北京擎科新業(yè)生物技術有限公司合成。取對數(shù)生長期的BHK-21細胞，按TRIzol?Reagent試劑盒說明書提取細胞RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以其為模板，PCR擴增Caveolin-1基因。反應體系為：LA Taq 0.5μL，dNTP 8.0μL，10×PCR BufferⅡ5.0μL，cDNA 5.0μL，Caveolin-1-F 1.0μL，Caveolin-1-R 1.0μL，DEPC H2O 29.5μL。反應條件為：94℃預變性5 min；94℃30 s，65.6℃45 s，72℃1 min；72℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，用膠回收試劑盒說回收目的條帶。

1.4pMD18T-Cav1克隆質(zhì)粒的構建 將PCR產(chǎn)物與載體pMD18-T于22℃用T4 DNA連接酶連接過夜，構建克隆質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化至E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細胞中，均勻涂布于含0.005 mg／mL Amp的瓊脂平板上，于37℃孵育箱中倒置培養(yǎng)過夜；挑取單個菌落，接種于含0.005 mg／mL Amp的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，用質(zhì)粒提取試劑盒提取克隆質(zhì)粒，將其命名為pMD18T-Cav1。

1.5pTRIP-Cav1重組表達質(zhì)粒的構建 將pMD-18TCav1及pTRIP-CMV載體于37℃水浴中分別用XbaⅠ和BamHⅠ雙酶切2 h，回收的目的片段與載體片段于16℃用T4 DNA連接酶連接過夜，構建重組質(zhì)粒。按1.4項進行轉(zhuǎn)化及提取質(zhì)粒。重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，陽性質(zhì)粒送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將鑒定正確的重組表達質(zhì)粒命名為pTRIP-Cav1。

1.6B H K-C a v1及B H K-EG F P細胞株的構建

1.6.1攜帶Caveolin-1及EGFP目的基因慢病毒的包裝構建 取對數(shù)生長期的HEK-293T細胞，接種于6孔板中，37℃培養(yǎng)24 h；待細胞密度達80%時，按LipofectamineTM2000 Reagent說明書分別將0.75μg的pTRIP-Cav1及對照質(zhì)粒pTRIP-EGFP轉(zhuǎn)染至HEK-293T細胞中，置37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10 h，更換為含10%NBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集含慢病毒的上清。

1.6.2慢病毒感染及BHK-Cav1和BHK-EGFP細胞株篩選 將對數(shù)生長期的BHK-21細胞接種至96孔板中37℃培養(yǎng)24 h；待細胞密度達80%時，棄去含10%NBS的DMEM培養(yǎng)基，分別加入1.6.1項構建的慢病毒混合液［500μL慢病毒上清+500μL DMEM（含20%FBS）+8μL Polybrene］［13］，混均后加入96孔板中，200μL／孔，轉(zhuǎn)導12 h；更換為含10%FBS的DMEM細胞培養(yǎng)液，用10μg／mL Puromycin對陽性細胞篩選14 d，期間不斷去除未轉(zhuǎn)導成功的死細胞，余下的活細胞即為轉(zhuǎn)導成功的細胞。最終獲得過表達Caveolin-1細胞株BHK-Cav1及過表達EGFP的細胞株BHK-EGFP。均培養(yǎng)7代。

1.7B H K-C a v1和B H K-EG F P細胞株穩(wěn)定性驗證

1.7.1BHK-EGFP細胞中EGFP表達的檢測 取培養(yǎng)過程中第10（P10）、20（P20）及30代（P30）BHK-EGFP細胞，以BHK-21細胞為對照，熒光顯微鏡下觀察蛋白表達。

1.7.2BHK-Cav1細胞中Caveolin-1蛋白表達及基因mRNA水平的檢測

1.7.2.1Western blot 取培養(yǎng)過程中P10、P20及P30 BHK-Cav1細胞，以BHK-21細胞為對照。細胞用RIPA裂解，產(chǎn)物經(jīng)12%SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用0.25 g／L脫脂奶粉于室溫封閉1 h；加入兔抗Caveolin-1抗體（1∶1 000稀釋），室溫孵育2 h；PBST洗滌5次，每次5 min，加入HRP標記的山羊抗兔抗體（1∶5 000稀釋），室溫孵育1 h；PBST洗滌5次，ECL顯色。

1.7.2.2qRT-PCRCaveolin-1基因上游引物：5′-AACCAGAAGGGACACACAG-3′，下游引物：5′-AAGGAGAGAATGGCAAAGT-3′，產(chǎn)物大小為151 bp。按1.7.2.1項收集各生長代次的BHK-Cav1細胞，以BHK-21細胞為對照。提取各組細胞RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以其為模板，進行qRT-PCR擴增。反應條件為：95℃預變性3 min；95℃15 s，60℃15 s，72℃20 s，共40個循環(huán)。記錄CT值。

1.8B H K-C a v1、B H K-EG F P及B H K-21細胞中Caveolin-1過表達的檢測

1.8.1Westernblot及qRT-PCR法 檢測BHK-EGFP及BHK-Cav1細胞中Caveolin-1蛋白表達及基因mRNA水平，方法同1.7.2項。

1.8.2免疫熒光法 將P10 BHK-Cav1及P10 BHK-21細胞分別接種至24孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h，待細胞融合度達40%～50%時，PBS洗滌3次，棄去PBS，加入70%乙醇，4℃過夜；次日吸去乙醇，PBS洗滌3次，加入兔抗Caveolin-1抗體（1∶200稀釋），37℃孵育1 h；100 r／min搖床上PBS洗滌4次，每次5 min，加入熒光標記的山羊抗兔抗體（1∶200稀釋），37℃孵育1 h；PBS洗滌4次，加入細胞核染料DAPI，室溫孵育5 min；蒸餾水洗滌10 min，熒光封固劑固定，靜置10 min后觀察熒光。

1.9B H K-C a v1及B H K-EG F P細胞活力的檢測 分別將對數(shù)生長期BHK-21、BHK-EGFP和BHK-Cav1細胞接種至96孔板中傳代培養(yǎng)至P10代，待細胞貼壁后的0、24及48 h時，用Proliferation細胞活力檢測試劑盒進行檢測，重復3次。以BHK-21的細胞活力記為100%，比較3組細胞的相對活力變化。

1.10統(tǒng)計學分析 應用GraphPad Prism 5.0軟件進行統(tǒng)計學分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，獨立樣本間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1Caveolin-1基因擴增產(chǎn)物的鑒定 目的基因PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見537 bp的特異性條帶，大小與預期一致，見圖1。

圖1 Caveolin-1基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretic profile of PCR product of Caveolin-1 gene

2.2重組表達質(zhì)粒的鑒定 重組表達質(zhì)粒pTRIPCav1的雙酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見537 bp的目的基因片段，大小與預期一致，見圖2。測序結(jié)果表明重組質(zhì)?；蛐蛄姓_。

圖2 重組表達質(zhì)粒pTRIP-Cav1的雙酶切（XbaⅠ／BamHⅠ）鑒定Fig.2 Restriction map of recombinant plasmid pTRIP-Cav1（XbaⅠ／BamHⅠ）

2.3 B H K-C a v1及B H K-EG F P細胞株的穩(wěn)定性

2.3.1BHK-EGFP細胞中EGFP的表達 與BHK-21細胞比較，P10、P20及P30 BHK-EGFP細胞熒光明顯，見圖3。表明EGFP可穩(wěn)定表達，BHK-EGFP細胞株構建成功。2.3.2BHK-Cav1細胞中Caveolin-1蛋白表達及mRNA水平 與BHK-21細胞比較，P10、P20及P30 BHK-Cav1細胞中Caveolin-1蛋白表達水平增加；基因RNA水平顯著增加（t分別為5.103、7.545和5.243，P均＜0.01）。同時Caveolin-1蛋白表達及基因RNA水平不隨細胞代次的增長而改變，具有較好的穩(wěn)定性。見圖4和圖5。

圖3 各組細胞的熒光顯微鏡觀察（×20）Fig.3 Fluorescence microscopy of cells in various groups（×20）

圖4 各組細胞中Caveolin-1蛋白表達的Western blot分析Fig.4 Western blotting of Caveolin-1 protein expressed in various groups

圖5 各組細胞中Caveolin-1基因mRNA相對水平Fig.5 Relative mRNA levels of Caveolin-1 in various groups

2.4C a v eolin-1過表達B H K-C a v1及B H K-EG F P細胞中C a v eolin-1檢測結(jié)果 與BHK-EGFP和BHK-21細胞比較，BHK-Cav1細胞中Caveolin-1蛋白表達水平增加；基因mRNA水平顯著升高（t=6.081，P<0.01）。見圖6和圖7。

圖6 各組細胞中Caveolin-1蛋白表達的Western blot分析Fig.6 Western blotting of Caveolin-1 protein expressed in cells of various groups

2.5C a v eolin-1過表達B H K-C a v1細胞中C a v eolin-1熒光觀察 結(jié)果顯示，與BHK-21細胞比較，BHKCav1細胞中Caveolin-1散發(fā)的紅光明顯增強，見圖8。表明BHK-Cav1細胞構建成功。

圖8 免疫熒光檢測各組細胞中Caveolin-1的表達（×40）Fig.8 IFA of expression of Caveolin-1 in cells of various groups（×40）

注：aa表示P<0.01。

2.6B H K-EG F P及B H K-C a v1細胞的活力 結(jié)果顯示，與同時間培養(yǎng)的BHK-21細胞比較，BHK-EGFP及BHK-Cav1細胞在0、24及48 h的細胞活力差異無統(tǒng)計學意義（t分別為32.33、33.94和41.00，P均＞0.05），見圖9。表明構建的BHK-Cav1和BHKEGFP細胞的活力與BHK-21細胞無顯著性差異。

圖9 不同時間各組細胞的活力Fig.9 Determination of cell vitalities in various groups at different time

3 討論

根據(jù)相關文獻報道，Caveolin-1在一些人源細胞中表達量較低，但在數(shù)種鼠源細胞中均可穩(wěn)定表達，且在不同代次的倉鼠腎細胞BHK-21中均可穩(wěn)定表達［6-7］。因此，本實驗選擇從BHK-21細胞中擴增Caveolin-1基因為目的片段，構建pTRIP-Cav1重組表達質(zhì)粒及BHK-Cav1細胞株。

本研究在預實驗中篩選了慢病毒上清與含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基的不同配比，選取BHK-21細胞不病變的最大慢病毒上清含量，即按1∶1體積比配置慢病毒上清與含20%FBS的DMEM的轉(zhuǎn)導混合液，對BHK-21細胞進行感染。本文以BHK-21細胞為對照，對BHK-Cav1及BHK-EGFP細胞株中蛋白表達的穩(wěn)定性，Caveolin-1過表達及細胞活力進行檢測，結(jié)果提示，BHK-Cav1細胞可穩(wěn)定過表達Caveolin-1，BHK-EGFP可穩(wěn)定過表達EGFP，且兩種細胞活力良好，證明穩(wěn)定細胞株構建成功。

本實驗成功構建了pTRIP-Cav1重組表達質(zhì)粒和BHK-Cav1穩(wěn)定細胞株，同時驗證了細胞株具有可穩(wěn)定過表達的特性，并保證了細胞株的活力；使穩(wěn)定過表達Caveolin-1的BHK-Cav1細胞和穩(wěn)定過表達無關蛋白EGFP的BHK-EGFP細胞更有應用價值。本實驗為下一步研究病毒通過Caveolin依賴型內(nèi)吞途徑感染BHK-21細胞奠定了基礎。