C an opy2對大鼠心肌缺血再灌注損傷心肌細胞凋亡的影響

宋麗茹，孫晨，馬佳樂，楊濱，郭睿，閆萍

1.山西醫(yī)科大學生物化學與分子生物學教研室，山西太原030001；

2.山西醫(yī)科大學第二臨床醫(yī)學院心內科，山西太原030002

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是一種致死率較高的心血管疾?。?］，再灌注能夠有效減少AMI梗死面積，但再灌注本身可加重心肌損傷，稱為心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemiareperfusion injury，MIRI）［2］。缺血組織快速恢復血流引起氧化應激損傷，導致細胞凋亡［3］。上述研究表明，減少AMI早期梗死邊緣區(qū)心肌細胞的凋亡可明顯降低MIRI的發(fā)生，是治療AMI的主要研究方向之一。

Canopy2（Canopy FGFsignalingregulator2，CNPY2）由182個氨基酸組成，相對分子質量約21 000［4］。課題組前期研究發(fā)現，降低CNPY2可導致腫瘤細胞凋亡增加［5］。同時，有報道表明，心臟特異性過表達CNPY2能降低擴心病小鼠模型心肌細胞凋亡［6］。因此，推測CNPY2可能也與心肌細胞凋亡有關，而CNPY2是否參與MIRI早期心肌細胞凋亡尚不明確。多聚ADP核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）是一種與細胞損傷密切相關的酶，可作為死亡底物參與細胞凋亡的過程。本研究通過大鼠MIRI模型分析MIRI后早期心肌組織中CNPY2的表達水平，且于大鼠體內體外分別過表達外源性CNPY2，初步探討CNPY2對MIRI誘導心肌細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1病毒及細胞 Ade-GFP、攜帶人CNPY2基因（hCNPY2）的腺病毒Ade-hCNPY2-Flag和陰性對照腺病毒Ade-NC-Flag由生工生物工程（上海）股份有限公司構建；H9c2細胞由山西醫(yī)科大學細胞庫提供。

1.2主要試劑 異氟烷購自深圳瑞沃德生命科技公司；Protease Inhibitor Cocktail及HRP標記的山羊抗兔IgG購自美國Thermo Scientific公司；小鼠抗GAPDH單克隆抗體、HRP標記的山羊抗小鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司；兔抗CNPY2多克隆抗體購自美國Novus公司；兔抗PARP單克隆抗體購自美國CST公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；FBS購自美國ScienCell公司；Hoechst染色試劑盒購自上海碧云天生物技術公司；TUNEL試劑盒購自德國Roche公司；蛋白激酶K工作液購自北京Solarbio公司；DAB工作液購自上海基因科技有限公司。

1.3實驗動物 普通級SD大鼠，雌性，6~8周齡，體重200~250 g，購自山西醫(yī)科大學動物實驗中心，動物合格證號為：SCXK（晉）2015-0001。本實驗對大鼠的所有處理均以科研為目的進行養(yǎng)殖和使用，且按照動物倫理相關規(guī)定進行。

1.4細胞培養(yǎng) 將H9c2細胞用含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，常規(guī)換液，0.25%胰酶消化，進行傳代，取第3代細胞進行后續(xù)試驗。

1.5腺病毒M OI及感染時間的確定 將Ade-GFP按不同MOI（40、50、80、100、150）感染H9c2細胞，37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，于倒置熒光顯微鏡下觀察GFP表達情況，確定最適病毒MOI。以最適MOI感染H9c2細胞，相同條件連續(xù)培養(yǎng)10 d，每天于熒光顯微鏡下觀察GFP的表達情況。

1.6CN P Y2蛋白的過表達 將Ade-hCNPY2-Flag和Ade-NC-Flag按最適MOI分別感染H9c2細胞，同時設空白對照組（未感染的H9c2細胞），于37℃感染48 h后，用0.5%NP-40蛋白裂解液提取細胞總蛋白，經12%SDS-PAGE分離后，轉移至PVDF膜，用10%脫脂牛奶于室溫封閉1 h；加入兔抗CNPY2多克隆抗體和小鼠抗GAPDH單克隆抗體（均1∶1 000稀釋），于4℃孵育過夜；用TBST洗滌3次，每次10 min，分別加入HRP標記的山羊抗兔IgG和HRP標記的山羊抗小鼠IgG（均1∶1 000稀釋），室溫孵育1 h；ECL法顯色。同時檢測Ade-hCNPY2-Flag和Ade-NC-Flag感染H9c2細胞2、4、6、8 d后，細胞中CNPY2蛋白的相對表達水平，方法同上。

1.7過表達CN P Y2對體外缺血再灌注心肌細胞凋亡影響的檢測 用腺病毒Ade-hCNPY2-Flag和Ade-NC-Flag感染第3代H9c2細胞，于37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h；將H9c2細胞接種至6孔板中，待細胞融合度達50%~80%時，將細胞置37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中用DMEM高糖培養(yǎng)基（含10%FBS）培養(yǎng)，待細胞貼壁，棄培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，加入H2O2（300μmol／L，2.5 h）氧化應激，誘導H9c2細胞凋亡；棄培養(yǎng)基，PBS沖洗，用固定液固定10 min；棄固定液，PBS洗滌2次，加入Hoechst 33258染色液，避光靜置5 min；棄染液，PBS洗滌2次，滴加抗熒光淬滅封片液進行封片，熒光顯微鏡下觀察，拍照。同時，采用Western blot法檢測PARP蛋白的表達水平，方法同1.6項，其中一抗為兔抗PARP單克隆抗體，稀釋度為1∶1 000。

1.8CN P Y2在大鼠心肌細胞中的定位 取大鼠心臟，將心臟組織置福爾馬林溶液固定，制備2μm石蠟組織切片，透明，脫水，檸檬酸鈉緩沖液修復，用20%山羊血清封閉，加入兔抗CNPY2多克隆抗體（1∶1 000稀釋），于4℃孵育過夜；PBST洗滌3次，每次10 min，加入HRP標記的山羊抗兔IgG（1∶1 000稀釋），室溫作用30 min；PBST洗滌3次，每次10 min，進行細胞核DAPI染色，封片，拍照，觀察CNPY2在細胞中的定位。同時設空白對照組（未滴加一抗）。

1.9大鼠M I R I心肌細胞中CN P Y2表達水平的檢測SD大鼠經異氟烷吸入麻醉，氣管插管，維持氣管通氣。左胸部第三四肋骨間打開胸腔，暴露心臟，用手術針線結扎左冠狀動脈前降支，打活結，即刻給予Adeh-CNPY2-Flag心肌注射（100μL／200 g體重），60 min后去除結扎，恢復血供，完成再灌注。同時設假手術組（不注射病毒，僅手術）。取大鼠假手術組及再灌注后1、4、7 d組心臟組織的梗死及邊緣區(qū)部分，采用Western blot法檢測細胞中CNPY2蛋白的表達水平，方法同1.6項，以確定再灌注的最適時間。

1.10CN P Y2對大鼠M I R I心肌細胞凋亡影響的檢測1.10.1TUNEL染色 按1.9項處理大鼠，分別給與Ade-hCNPY2-Flag和Ade-NC-Flag注射，于再灌注4 d，取兩組大鼠心臟，制備為4μm的石蠟組織切片，脫水，加入蛋白激酶K工作液（20μg／mL），于37℃孵育20 min；PBS洗滌2次，兩組均滴加反應液（TUNEL試劑盒中Enzyme Solution 5μL+Label Solution 45μL混合液），同時設相應對照組（滴加50μL Label Solution），37℃暗濕孵育60 min；PBS洗滌3次，滴加50μL converter-POD，37℃濕孵育30 min；PBS洗滌3次，滴加50μL DAB工作液，室溫放置1~5 min；染色后樹膠封片，顯微鏡下觀察，拍照。

1.10.2Western blot檢測 同1.10.1項處理小鼠，于再灌注4 d，取兩組大鼠心臟組織，迅速加入液氮，研磨成粉末，用蛋白裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白含量。取50μg蛋白，經12%SDS-PAGE分離后，Western blot法（同1.6項）檢測PARP蛋白表達水平。

1.11統計學分析 應用ImageJ 2軟件分析圖像，Graphpad Prism 6.0軟件進行統計學分析，所有數據均采用均值±標準差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1最適M OI及感染時間 MOI=50時，熒光顯微鏡下綠色熒光最多，見圖1，因此確定H9c2細胞的最佳MOI為50。以MOI=50進行細胞感染，感染6 d時還可見部分細胞存在綠色熒光，感染8 d時綠色熒光明顯減少，見圖2。因此確定感染后1周內為最適感染時間。

圖1 不同MOI感染H9c2細胞的鏡下觀察（×100）Fig.1 Microscopy of H9c2 cells infected at various MOIs（×100）

圖2 不同感染時間H9c2細胞的鏡下觀察（×100）Fig.2 Microscopy of H9c2 cells infected for various days（×100）

2.2CN P Y2蛋白的過表達 以MOI=50感染，空白對照組、Ade-hCNPY2-Flag組和Ade-NC-Flag組H9c2細胞中CNPY2蛋白表達水平分別為0.050、2.271、0.057，Ade-hCNPY2-Flag組明顯高于空白對照組及Ade-NC-Flag組（t分別為6.232和5.717，P<0.05），見圖3。Ade-hCNPY2-Flag感染細胞后CNPY2蛋白表達水平逐漸升高，感染后4 d達最高，隨后逐漸下降，但與Ade-NC-Flag比較，感染后2、4、6、8 d時，Ade-hCNPY2-Flag組中CNPY2蛋白表達水平明顯升高（t分別為16.26、15.69、8.334、5.508，P分別為<0.01、0.01、0.05、0.05），見圖4和圖5。

圖3 Western blot法檢測各組H9c2細胞中CNPY2蛋白的表達情況Fig.3 Western blotting of CNPY2 expressed in H9c2 cells of various groups

圖4 Western blot法檢測不同感染時間H9c2細胞中CNPY2蛋白的表達情況Fig.4 Western blotting of CNPY2 protein expressed in H9c2 cells infected for various days

圖5 不同感染時間H9c2細胞中CNPY2蛋白的表達水平Fig.5 Expression levels of CNPY2 protein in H9c2 cells infected for various days

2.3過表達CN P Y2對體外缺血再灌注心肌細胞凋亡的影響 Ade-NC-Flag+H2O2組和Ade-hCNPY2-Flag+H2O2組在一個視野下平均細胞凋亡率分別為17.61和7.250，表明過表達CNPY2可顯著降低細胞凋亡率（t=5.147，P<0.05），見圖6。Ade-NCFlag+H2O2組和Ade-hCNPY2-Flag+H2O2組細胞凋亡蛋白PARP的活性分別為0.583和0.269，表明過表達CNPY2蛋白可顯著降低細胞凋亡蛋白PARP的表達水平（t=6.325，P<0.01），見圖7。

圖6 Hoechst33258染色法檢測過表達CNPY2后H9c2細胞的凋亡情況（×200）Fig.6 Determination of apoptosis of H9c2 cells after CNPY2 overexpression by Hoechst33258 staining（×200）

圖7 過表達CNPY2對H9c2細胞中PARP蛋白表達水平的影響Fig.7 Effectof CNPY2 overexpression on PARPprotein expression level in H9c2 cells

2.4CN P Y2的定位 CNPY2在心肌細胞的胞漿中表達，見圖8。

圖8 CNPY2在心肌細胞中的表達（×400）Fig.8 Expression of CNPY2 in cardiomyocytes（×400）

2.5大鼠M I R I心肌細胞中CN P Y2的蛋白表達水平假手術組及再灌注后1、4、7 d過表達組大鼠心肌細胞中CNPY2蛋白的表達水平分別為0.726、0.304、0.220、0.618。與假手術組比較，再灌注后過表達組1、4、7 d大鼠心臟梗死及邊緣區(qū)組織中CNPY2的表達水平均明顯降低（t分別為11.57、25.06、3.639，P分別<0.01、<0.001、<0.05），CNPY2的表達水平在再灌注1周內顯著降低，第4天時尤為明顯。見圖9。

圖9 Western blot法檢測大鼠MIRI心肌細胞中CNPY2蛋白的表達Fig.9 Determination of CNPY2 expression in cardiomyocytes of rats with MIRIby Western blot

2.6CN P Y2對大鼠M I R I心肌細胞凋亡的影響

2.6.1TUNEL染色 Ade-hCNPY2-Flag和Ade-NCFlag組的細胞凋亡率分別為0.570和1.442，前者明顯低于后者（t=9.947，P<0.01），見圖10。表明對大鼠缺血心臟給予外源性CNPY2后，可明顯抑制MIRI的發(fā)生。

圖10 各組大鼠MIRI早期心肌凋亡情況的鏡下觀察（×400）Fig.10 Microscopy of myocardium apoptosis at early stage of MIRI（×400）

2.6.2Western blot檢測 Ade-hCNPY2-Flag和Ade-NC-Flag組PARP蛋白表達水平分別為0.570和1.442，前者明顯低于后者（t=9.947，P<0.01），見圖11。表明缺血后過表達CNPY2對MIRI誘導的早期心肌凋亡可發(fā)揮顯著保護作用。

圖11 大鼠MIRI心肌細胞中PARP蛋白的表達水平Fig.11 Expression level of PARP in cardiomyocytes of rats with MIRI

3 討論

MIRI的發(fā)生機制涉及多種病理生理行為，包括氧自由基的大量產生、鈣超載、細胞凋亡、心肌能量代謝障礙等因素共同參與［7］。其中氧化應激損傷和細胞凋亡是MIRI中的重要環(huán)節(jié)。心肌由終末分化的心肌細胞組成，其負責心臟泵功能，成年哺乳動物心肌細胞幾乎無再生能力，而過度的心肌細胞死亡，心臟會出現嚴重且持久的病理學效應［8］。細胞凋亡是一種高度調節(jié)的程序性細胞死亡過程，其中Caspase 3是細胞凋亡的關鍵執(zhí)行者，一旦被激活，立即發(fā)生下游的級聯反應，導致細胞凋亡［9］。當細胞內接受到凋亡信號時，在多種蛋白水解酶的作用下，激活后裂解成活性亞單位，激活的Caspase 3繼續(xù)切割其不同底物，其中PARP是最重要作用底物之一［10］，激活的Caspase 3切割為兩個裂解片段而失去其正常功能，從而導致細胞凋亡［11］。

PARP是一種與細胞損傷密切相關的酶，也叫DNA修復酶，大量存在于真核細胞中。其中，PARP-1的含量最為豐富，是家族重要成員之一，相對分子質量約為116 000，約占細胞內酶活性的90%，PARP主要參與DNA轉錄、復制、修復、信號傳導、細胞凋亡和基因調控等過程［12］。全長PARP識別凋亡信號，可將PARP羧基端的催化結構域（相對分子質量89 000）和氨基端的sbDNA結合結構域（相對分子質量24 000）分離，因此，PARP蛋白的Western blot檢測可見2條蛋白條帶，分離的越多表明凋亡越嚴重。PARP剪切是細胞凋亡的重要指標之一，通常認為是Caspase 3激活的指標。

本研究結果表明，MOI=50時，H9c2細胞感染效果最佳，感染1周內為最適感染時效，外源CNPY2-F LAG均高表達。同時建立過H2O2誘導H9c2細胞凋亡條件，通過細胞核Hoechst33258染色和West-ern blot檢測凋亡蛋白PARP，明確CNPY2抗氧化應激誘導的心肌細胞H9c2凋亡，提示外源給予CNPY2對降低心肌細胞氧化應激損傷后的凋亡具有積極作用。因此，在缺血再灌注早期給予外源CNPY2，可能會降低MIRI和改善后期心功能。本研究在體內進行動物MIRI的模型制備，經免疫熒光追蹤顯示，心肌細胞是心臟CNPY2主要來源。與假手術組比較，給予Ade-hCNPY2-Flag的小鼠再灌注7 d內心臟梗死及邊緣區(qū)CNPY2的蛋白水平顯著降低（P<0.05），再灌注4 d時降低最明顯（P<0.001）。在此基礎上，通過腺病毒Ade-hCNPY2-Flag及Ade-NC-Flag分別注射來干預MIRI心肌早期CNPY2水平，TUNEL染色和Western blot檢測表明，缺血早期過表達CNPY2可有效抑制活體大鼠MIRI早期的心肌凋亡。本研究為臨床治療AMI提供了新的靶點和思路，后續(xù)將對CNPY2保護心肌MIRI的分子機制進行進一步深入研究。