固本健腦液對(duì)阿爾茨海默病大鼠學(xué)習(xí)記憶及睡眠時(shí)相的影響

毛劍琴 張譽(yù)丹 曾楚華 袁德培

(湖北中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，武漢，430065)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s Disease，AD)發(fā)病癥狀呈持續(xù)性的腦部神經(jīng)系統(tǒng)衰退，被普遍認(rèn)為是海馬型遺忘綜合征，屬于癡呆癥最常見的病因之一，在全球范圍內(nèi)占癡呆病例的50%～75%[1-2]。而全球人口老齡化發(fā)展也進(jìn)一步促進(jìn)了我國AD的患病率不斷上升，給家庭與社會(huì)帶來沉重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的同時(shí)，也成為廣泛關(guān)注的醫(yī)學(xué)性問題。研究表明，不同程度的晝夜節(jié)律紊亂在AD患者和相關(guān)AD動(dòng)物模型中均有體現(xiàn)，其中就包括行為學(xué)上的睡眠-覺醒節(jié)律紊亂、靜息-活動(dòng)節(jié)律紊亂，也存在機(jī)體的一些激素的晝夜節(jié)律紊亂，AD患者的長期晝夜節(jié)律紊亂也可導(dǎo)致AD的病理進(jìn)程加快，已證實(shí)約有44%的AD患者伴發(fā)有睡眠障礙[3-4]。而導(dǎo)致這一結(jié)果的發(fā)生正是由于在衰老過程中晝夜節(jié)律往往最先受累，因此在AD的發(fā)病過程中表現(xiàn)尤為突出[5]。國外學(xué)者也指出AD病情發(fā)展與睡眠障礙相關(guān)，并且睡眠障礙可能是導(dǎo)致AD的重要病因[6]。由AD導(dǎo)致機(jī)體靜息-活動(dòng)晝夜節(jié)律紊亂是AD患者經(jīng)常伴發(fā)的癥狀之一。因此，本實(shí)驗(yàn)建立AD大鼠模型，并通過中藥固本健腦液予以干預(yù)，以期探討固本健腦液改善AD模型大鼠的晝夜節(jié)律紊亂。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 40只無特定病原體(Specific Pathogen Free，SPF)級(jí)雄性SD大鼠[海南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(瓊)2019-0001]，體質(zhì)量220～250 g，在指定條件下，室內(nèi)溫度20～25 ℃；噪聲≤55 dB(A)；相對(duì)濕度：(55±15)%；光照強(qiáng)度：300 Lux，光照節(jié)律：07:00-19:00光照，19:00-07:00黑暗，明暗交替，于動(dòng)物籠中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)進(jìn)行，各實(shí)驗(yàn)操作均符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)要求(倫理審批號(hào)：2021-009)。

1.1.2 藥物 固本健腦液是由恩施板橋黨參15 g、枸杞子15 g、茯苓15 g、酸棗仁12 g、山楂12 g組成，購買于湖北民族大學(xué)附屬民大醫(yī)院，加入6倍量水后煎煮2次，濾出藥液(該過程重復(fù)2次)，將2次濾出來的藥液充分混勻，將其用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀高溫加熱濃縮成每毫升含生藥2 g的藥液，置于4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。褪黑素購于上海麥克林生化科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào):C13143553。超聲溶解混勻于純凈水中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按0.09 mg/(kg·d)標(biāo)準(zhǔn)灌胃。

1.1.3 試劑與儀器 β淀粉樣蛋白1-42(β-amyloid Protein，Aβ1-42)(武漢艾迪抗生物科技有限公司，批號(hào)：AD21893)；10%水合氯醛(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號(hào)：20190401)；牙科水泥(上海玉研科技有限公司，批號(hào)：191009)；牙科水泥自凝水(上海玉研科技有限公司，批號(hào)：190326)；注射用青霉素鈉(哈藥集團(tuán)制藥總廠，批號(hào)：A190403015)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海圣科儀器設(shè)備有限公司，型號(hào)：RE 2000A)；電子分析天平(梅特勒賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：BS110S型)；冰箱(深圳市寶安區(qū)沙井廣氏電器廠，型號(hào)：BCD-629WDEYU1)；動(dòng)物行為檢測系統(tǒng)(Clever Sys公司，美國，型號(hào)：HomeCageScan3.0)、睡眠生物解析系統(tǒng)(Biotex Kyoto公司，日本，型號(hào)：VitalRecorder3.0)、動(dòng)物睡眠分析軟件(Kissei Comtec株式會(huì)社，日本，版本號(hào)：Sleepsign3.0)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將40只SPF級(jí)雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組，即空白對(duì)照組、模型組、固本健腦液組、褪黑素組，每組10只。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后開始建立AD模型，除空白對(duì)照組外。具體操作如下：取大鼠稱取體質(zhì)量后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，取腦立體定向儀固定大鼠，刮掉頭頂毛發(fā)后碘伏(河南華凱生物科技有限公司，批號(hào)：20210302)消毒，沿顱骨正中切開，分離皮下組織和筋膜，參照腦立體定位儀，以前囟“十”字縫中心點(diǎn)為零點(diǎn)，正中線向后4 mm，矢狀線左右各3 mm，標(biāo)記位置，鉆孔后微量進(jìn)樣器吸取2 μL Aβ1-42，注射后停留針頭2 min，慢慢取出針頭，對(duì)側(cè)行同樣操作。大鼠注射結(jié)束后，縫合頭皮，傷口處用碘伏消毒，棉簽涂抹馬應(yīng)龍痔瘡膏(馬應(yīng)龍藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)：20210118)，每只肌內(nèi)注射4萬U青霉素鈉預(yù)防感染。待大鼠蘇醒后放回籠中，記錄造模日期?？瞻讓?duì)照組同上位置注射0.9%氯化鈉溶液(四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：L212062101)，其余操作相同。

1.2.2 給藥方法 固本健腦液組予以劑量為16 g/(kg·d)固本健腦液灌胃；褪黑素組予以給藥劑量0.09 mg/(kg·d)。共灌胃8周，空白對(duì)照組及模型組以等量0.9%氯化鈉溶液胃。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

1.2.3.1 Morris水迷宮行為學(xué)測定 用幾滴食用色素使池水變黑，然后將水深保持在31.5 cm，溫度保持在(23±1)℃，在水面以下設(shè)置1.5 cm圓形透明有機(jī)玻璃平臺(tái)，用虛線將池劃分為4個(gè)相等的象限，以進(jìn)行描述性數(shù)據(jù)收集，將隱藏平臺(tái)放置在水迷宮的第三象限(Q3)，提捏大鼠尾部將其面向池壁分別從4個(gè)象限的固定位置進(jìn)入水中，通過攝像機(jī)在連接到基于計(jì)算機(jī)的圖形分析軟件的水迷宮上捕捉大鼠的游泳行為，記錄大鼠尋找到第三象限平臺(tái)的逃潛伏期，并計(jì)算其平均隱藏潛伏期[7]。

1.2.3.2 大鼠晝夜節(jié)律檢測 采用HomecageScan 3.0實(shí)時(shí)監(jiān)測系統(tǒng)檢測各組大鼠在籠內(nèi)的所有周期性刻板樣行為并進(jìn)行分析，觀察時(shí)間為24 h。操作前先按該軟件系統(tǒng)的說明對(duì)大鼠的居家籠光照及黑暗背景進(jìn)行保存，對(duì)籠內(nèi)前后上下左右及邊框的高度進(jìn)行準(zhǔn)確的設(shè)置與描繪，并對(duì)墊料的高度以及飲食飲水等活動(dòng)區(qū)域皆進(jìn)行設(shè)置，然后將各組大鼠隨機(jī)放置籠內(nèi)允許自由活動(dòng)。系統(tǒng)通過紅外線熱成像探測及視頻軌跡追蹤，通過攝像頭識(shí)別記錄20多種復(fù)雜的行為如：睡、睡醒、理毛、吃、喝、嚼、跳、扭動(dòng)、嗅、撓、站、蹲、攀、走、跑、落地、轉(zhuǎn)圈、挖、掘、暫停、伸展身體、連續(xù)跳動(dòng)、小便等的次數(shù)來進(jìn)行時(shí)空序列分析，以此判定老年失眠大鼠模型復(fù)制成功，其中前12 h是日間模式，后12 h為夜間模式。

1.2.3.3 大鼠電極埋置術(shù) 手術(shù)埋置記錄電極前禁食24 h，10%水合氯醛(360 mg/kg)腹腔注射麻醉，將大鼠頭頸部毛發(fā)剃凈，將大鼠固定于腦立體定位儀，切開顱頂皮膚，露出顱骨前后囟并使用0.9%氯化鈉溶液沖洗。按照參考文獻(xiàn)[7]進(jìn)行定位，分別在顱骨上前/后囟前2 mm，中線右側(cè)旁開2～3 mm處以0.8 mm鉆頭鉆孔，在鉆通顱骨又未觸及腦組織后停止，安裝腦電記錄電極螺絲，將螺絲固定好后用來記錄腦電圖(Electroencephalograhpy，EEG)；在囟門前2 mm，以中間線左側(cè)2～3 mm處鉆孔，不直接進(jìn)入穿破顱骨，并安裝參考電極螺絲，將螺絲固定后，將用來記錄肌電圖(Electromyogram，EMG)的2根無菌導(dǎo)線直接插入頭后頸肌，用牙科水泥固定凝結(jié)后縫合傷口。術(shù)后將實(shí)驗(yàn)大鼠單籠置于睡眠生物分析系統(tǒng)中，肌內(nèi)注射青霉素鈉4萬U預(yù)防感染，連續(xù)注射3 d，大鼠恢復(fù)2周。在恢復(fù)期結(jié)束時(shí)，將大鼠頭部電極插座連接到腦電/肌電信號(hào)插頭，再連接到多通道萬向輪。通過記錄線將信號(hào)連接到放大器，對(duì)信號(hào)進(jìn)行濾波(EEG,0.5～30 Hz；EMG,20～30 Hz)經(jīng)放大后輸入計(jì)算機(jī)，經(jīng)模數(shù)轉(zhuǎn)換成最終的數(shù)字信號(hào)。訓(xùn)練結(jié)束后在實(shí)驗(yàn)環(huán)境實(shí)行明暗(L/D:12 h/12 h)光照周期處理，隨后描記腦電和肌電，記錄時(shí)間為7：00至次日7：00，連續(xù)記錄24 h。

1.3 腦電肌電記錄及分析 固本健腦液治療后記錄大鼠EEG/EMG，大鼠的腦電及肌電信號(hào)由記錄導(dǎo)線接入放大器，由睡眠生物解析系統(tǒng)放大、濾波至電腦數(shù)模轉(zhuǎn)換后，用Sleepsign軟件進(jìn)行獨(dú)立記錄和分析，記錄后，每10秒作為分析單元進(jìn)行自動(dòng)掃描，以統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)區(qū)分覺醒(Wake)、快速眼球運(yùn)動(dòng)(Rapid Eye Movement，REM)和非快速眼動(dòng)(Non-rapid Eye Movement，NREM)睡眠，一旦分析和掃描完成，就需要人工檢查，并在必要時(shí)進(jìn)行適當(dāng)?shù)募m正。

圖1 睡眠時(shí)相的解析原理

2 結(jié)果

2.1 固本健腦液對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響 與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠逃避潛伏期顯著延長，目標(biāo)象限游泳時(shí)間百分比顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，所有觀察組逃避潛伏期顯著縮短，目標(biāo)象限游泳時(shí)間百分比顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠逃避潛伏期及目標(biāo)象限游泳時(shí)間百分比比較

2.2 HomeCage監(jiān)測睡眠情況 與空白對(duì)照組比較，模型組睡眠覺醒次數(shù)多(P<0.05)，睡眠持續(xù)時(shí)間顯著性降低(P<0.05)且晝夜節(jié)律顛倒；與模型組比較，固本健腦液組睡眠覺醒次數(shù)減少(P<0.05)，睡眠持續(xù)時(shí)間較長(P<0.05)且睡眠晝夜節(jié)律正常；而褪黑素組則表現(xiàn)為雖有覺醒次數(shù)減少(P<0.05)，但睡眠總時(shí)長延長(P<0.05)，失去晝夜節(jié)律。見圖2～3。

圖2 各組大鼠生物節(jié)律行為次數(shù)

圖3 大鼠睡眠持續(xù)時(shí)間

2.3 Sleepsign腦電肌電描記結(jié)果 與空白組比較，模型組白天覺醒累積量明顯增高(P<0.05)，覺醒次數(shù)顯著增多(P<0.05)，REM睡眠累積量明顯降低(P<0.05)，夜間NREM睡眠顯著降低(P<0.05)；褪黑素組白天睡眠累積量無顯著差異，睡眠持續(xù)時(shí)間顯著升高(P<0.05)，REM睡眠累積量明顯降低(P<0.05)，夜間NREM睡眠累積量明顯增多(P<0.05)；固本健腦液組與空白組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖4～5。

圖4 各組睡眠-覺醒時(shí)辰變化示意圖

圖5 各組大鼠NREM,REM和覺醒量的比較圖

3 討論

大量研究發(fā)現(xiàn)睡眠節(jié)律障礙與AD存在密切的相互作用[8-10]。有研究表明，通過對(duì)AD模型鼠進(jìn)行慢性睡眠剝奪可加速AD鼠腦內(nèi)的Aβ異常沉積，從而使得學(xué)習(xí)記憶障礙加重[11]。由此推測睡眠節(jié)律紊亂可能造成腦組織內(nèi)Aβ異常沉積，促進(jìn)AD的發(fā)病進(jìn)程。AD患者腦組織內(nèi)存在大量的炎癥反應(yīng)，腦組織內(nèi)炎癥反應(yīng)能夠抑制神經(jīng)元新生、加速神經(jīng)元丟失，進(jìn)一步加重腦組織損傷[12]，這種睡眠障礙與AD之間的關(guān)聯(lián)性也為研究AD的發(fā)病機(jī)制提供了新的思路。另外有研究表明，睡眠是調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)記憶和情緒調(diào)節(jié)的重要腦部活動(dòng)[13]，而睡眠障礙則會(huì)導(dǎo)致記憶功能減退、認(rèn)知能力降低，從而增加AD患病的可能性[14]，并且大部分AD患者均存在不同程度的睡眠節(jié)律紊亂情況。固本健腦液是具有健腦安神功效的一種方劑，能補(bǔ)脾腎之虛，固人體精氣血之本，從而健腦安神，結(jié)合古今醫(yī)家對(duì)失眠發(fā)生病因病機(jī)的認(rèn)識(shí)，認(rèn)為老年失眠主要是脾腎等臟腑虛衰，氣血不足所致，所以其治療也當(dāng)以補(bǔ)腎健脾，以養(yǎng)精氣血之本，使腦健神安為主，故用本方以達(dá)固本健腦之功。亦有早期研究提示湯劑能夠明顯改善AD模型鼠的睡眠障礙及學(xué)習(xí)記憶能力[15]，本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行分析。

AD是一種不可逆轉(zhuǎn)的認(rèn)知損害，也是最常見的癡呆癥類型。在進(jìn)行性認(rèn)知障礙的同時(shí)，晝夜節(jié)律紊亂也在AD的進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用[16]。這種晝夜節(jié)律的紊亂可發(fā)生在AD的早期階段，也可隨著疾病的發(fā)展，在AD晚期發(fā)生更加嚴(yán)重的睡眠-覺醒周期紊亂[17]。研究發(fā)現(xiàn)，AD小鼠存在不同程度的睡眠異常：8周齡Tg2576小鼠睡眠正常，但發(fā)現(xiàn)其24周齡時(shí)存在快速眼動(dòng)睡眠時(shí)長減少的現(xiàn)象，且隨著月齡的增長加重[18-19]。APP/PS1小鼠也可表現(xiàn)出睡眠腦電圖以及睡眠-覺醒周期異常[20]。另一方面，睡眠障礙也可成為導(dǎo)致或加重AD的危險(xiǎn)因素[21]，已有研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)AD小鼠的慢性睡眠剝奪，不僅導(dǎo)致了Aβ沉積的加快，也可使突觸損傷導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力下降更為嚴(yán)重[22]。以上都是晝夜節(jié)律系統(tǒng)的紊亂和AD發(fā)病機(jī)制中具有的共同的特征及致病因素，這也揭示了將它們作為一條相互依賴的途徑進(jìn)行研究的前景。

綜上所述，可以得知固本健腦液對(duì)于晝夜節(jié)律與AD的交互作用研究具有一定意義，有望為AD相關(guān)晝夜節(jié)律紊亂機(jī)制的深入研究提供新的治療思路。改善睡眠質(zhì)量恢復(fù)晝夜節(jié)律對(duì)于AD患者來說可能不再僅僅是對(duì)癥治療，而極有可能成為針對(duì)AD病因進(jìn)行防治的有效方法。