家族性腺瘤性息肉病家系的APC基因突變分析

陳春燕，魏 娟，蔣 康，劉 炯，萬海軍，康 穎，馮曉玥，姜 瓊，廖婉玉，蔣銘佐，劉 雨，汪芳裕

0 引 言

家族性腺瘤性息肉病(familial adenomatous polyposis, FAP)是一種常染色體顯性遺傳性疾病，屬于遺傳性結(jié)直腸癌綜合征的一種，發(fā)病率約為1/7000～1/30000[1]。典型臨床表現(xiàn)是結(jié)直腸數(shù)百到數(shù)千枚腺瘤性息肉。結(jié)直腸腺瘤性息肉在童年和青春期開始出現(xiàn)，15歲時大約50%的FAP患者有結(jié)直腸腺瘤，35歲時這一比例增加到95%，結(jié)直腸癌的終生風(fēng)險幾乎是100%，未經(jīng)治療，最終在40歲時進展為結(jié)直腸癌，且70%～80%的腫瘤發(fā)生在左半結(jié)腸[2]。常合并有其他腸內(nèi)及腸外表現(xiàn)，例如胃底腺息肉、十二指腸息肉、先天性視網(wǎng)膜色素上皮肥大、纖維瘤、纖維瘤病、鼻血管纖維瘤、甲狀腺癌、肝母細胞瘤、腦瘤和胰膽腫瘤[3- 4]。這些患者也可能出現(xiàn)十二指腸腺瘤，與整體人群相比，發(fā)生十二指腸腺癌的風(fēng)險增加了300倍[5]。

腺瘤性息肉病基因APC胚系突變是FAP的主要致病原因。常見的APC基因胚系突變形式為編碼序列的移碼突變、無義突變、剪接位點異常、錯義突變以及大片段的缺失，導(dǎo)致產(chǎn)生截短的或突變的APC蛋白[6-7]。有研究顯示臨床表現(xiàn)輕重與突變位點具有一定的相關(guān)性[8]。本研究旨在對3個家系FAP患者的突變類型進行篩查，指導(dǎo)臨床。

1 資料與方法

1.1 研究對象選取2017年1月至2021年12月東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院院消化科住院治療的3個FAP家系。先證者因腹痛、腹瀉、便血等癥狀就診，25-38歲，男1例，女2例。其中2例癌變，腸外表現(xiàn)為：胃、十二指腸多發(fā)腺瘤、胃底腺息肉；十二指腸乳頭腺瘤。納入標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)《遺傳學(xué)結(jié)直腸癌臨床診治和家系管理中國專家共識》，F(xiàn)AP診斷標(biāo)準(zhǔn)：結(jié)直腸內(nèi)彌漫性息肉數(shù)量≥100個或者腺瘤性息肉數(shù)量<100個伴有家族史或者先天性視網(wǎng)膜色素肥厚，均經(jīng)腸鏡及病理診斷明確。具體臨床資料及家系圖譜見圖1。先證者確診后對其進行家系調(diào)查，采集先證者及家系成員的外周靜脈血，EDTA抗凝，-20 ℃保存。本研究獲得東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號：2022DZGZR-097)，患者均簽署知情同意書。

■：男；●：女

1.2方法

1.2.1 提取外周血DNA采用QIAamp DNA Tissue Mini Kit(QIAGEN公司，USA)試劑盒，按照說明書分別提取外周血DNA，-20℃保存。

1.2.2二代測序取先證者外周血DNA3～5 μg，將其打斷并擴增，建立全基因組文庫，利用液相捕獲試劑盒與基因組文庫混合，捕獲目標(biāo)基因片段至探針，進而通過生物素和streptavidin的磁珠結(jié)合被吸附到磁珠上；通過洗脫處理將非目標(biāo)區(qū)域DNA片段洗掉，從而富集目標(biāo)基因片段，而后利用HiSeq2000高通量測序、生物信息學(xué)分析。

1.2.3Sanger測序先證者外周血二代測序檢測到的突變位點，對先證者及家系成員外周血DNA均對相應(yīng)位點設(shè)計引物PCR擴增，ABI 3130XL測序儀雙向測序后用Chromas軟件分析測序數(shù)據(jù)尋找變異位點。

2 結(jié) 果

家系1先證者及受累成員均檢測到APC基因第14外顯子c.1945C>T 雜合變異，第1945 號核苷酸由胞嘧啶變異為胸腺嘧啶,編碼的氨基酸由谷氨酰胺變成了一個終止密碼，翻譯提前停止從而形成截短的APC蛋白。HGMD數(shù)據(jù)庫已報到其與FAP相關(guān)。家系中未受累者未檢測到該位點突變。家系2先證者及受累成員APC基因第15外顯子3129_3130delAC雜合變異，兩個堿基的缺失會導(dǎo)致移碼突變，家族中未受累者未檢測到該突變。家系3先證者及受累成員的APC基因位于第10外顯子c.1363C>T雜合變異，第1363位核苷酸由胞嘧啶變異為胸腺嘧啶，導(dǎo)致455位的密碼子由編碼谷氨酰胺的變?yōu)閁AG，形成一個終止密碼p.Q455X(無義突變)，其余正常家系成員未見此突變位點。見圖2。

圖 2 3個FAP家系先證者APC測序圖

3 討 論

結(jié)腸癌是男性第三大腫瘤、女性第二常見腫瘤，約70%結(jié)腸癌都是散發(fā)病例。家族易感性病例占10%～30%，而其中5%～7%是遺傳性疾病[9]，約1%的結(jié)直腸癌病例是FAP患者。常見的遺傳性結(jié)直腸癌家族性腺瘤性息肉病有三種表型，分別是經(jīng)典型FAP，衰減型FAP以及常染色體隱性遺傳型息肉病。典型FAP特點是青春期開始發(fā)病，結(jié)直腸成百上千枚枚腺瘤型息肉，隨著時間進展，息肉數(shù)量和大小也逐漸增多增大病最終發(fā)展為結(jié)腸癌，癥狀常常在40歲前出現(xiàn)并與腫瘤發(fā)展有關(guān)。衰減型FAP則侵襲性較經(jīng)典型低，結(jié)直腸息肉數(shù)量較少，一般不超過100枚，并且癌變率也較低，如果左半結(jié)腸息肉未曾治療，結(jié)直腸癌常常發(fā)生于50或60歲。APC基因的雜合性胚系突變是FAP的發(fā)病原因，約80～95%的FAP患者外周血檢測到APC基因的突變[10]。

APC是一種抑癌基因，位于人類常染色體5q21-22，全長108kb，包含15個外顯子，編碼的蛋白由2843氨基酸殘基組成。第15號外顯子全長6571bp，占編碼區(qū)77%，是已知人類基因組中最大的外顯子，也是突變發(fā)生最多的外顯子[11]。APC蛋白在上皮細胞中廣泛表達，包含多個功能域，與β連環(huán)蛋白結(jié)合形成復(fù)合物并使其降解，在細胞黏附、轉(zhuǎn)錄激活、細胞遷移及凋亡過程中發(fā)揮重要作用。功能缺失的截短APC蛋白影響β連環(huán)蛋白降解，使其在細胞質(zhì)大量堆積，并轉(zhuǎn)移至核內(nèi)與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活Wnt通路下游靶基因(如C-MYC, cyclin D、ephrins、caspase)，從而影響細胞的遷移、粘附、激活與轉(zhuǎn)錄、凋亡，從而介導(dǎo)腫瘤發(fā)生[12]。

目前已發(fā)現(xiàn)3000余種APC基因胚系突變類型，約15-20%的FAP患者被檢測到新的突變，最常見的突變方式是堿基的替換和小的堿基缺失，分別占36%和43%?；蛐秃捅硇脱芯匡@示，結(jié)腸癌患者中約60%的突變位點集中在APC的中央?yún)^(qū)域(1284-1580),被稱為突變集群區(qū)域(MCR),該區(qū)域突變導(dǎo)致APC蛋白截斷，缺乏所有靶蛋白的結(jié)合區(qū)除了一個或兩個由20個氨基酸組成的β連環(huán)蛋白結(jié)合位點[13]。密碼子1061和1309是APC生殖系突變的兩個熱點，而體細胞突變熱點為密碼子1309和1450[14]，MCR突變的患者發(fā)病年齡更早[15]。APC基因型與表型的相關(guān)研究可以幫助提高診斷及隨訪?；驒z測是有利的，因為APC基因的一些突變可能與遺傳異質(zhì)性和疾病的嚴重程度密切相關(guān)[16]。FAP基因型和表型分析表明大于5000枚息肉的息肉病患者APC突變常發(fā)生在密碼子1250和1464。位于外顯子15的密碼子1104、1309突變者發(fā)病年齡更早并且表型更嚴重,結(jié)腸癌變年齡更早并且易合并甲狀腺腫瘤[17]。相反，腺瘤少于100枚的AFAP患者，突變位點常位于5′或3′端或者外顯子9的剪接位點[18]。

本研究的家系1先證者33歲時因結(jié)腸癌接受手術(shù)治療，胃及十二指腸多發(fā)腺瘤多次行內(nèi)鏡下治療，基因檢測顯示的APC突變位點為位于外顯子14的無義突變，提前產(chǎn)生了終止密碼子，其父母均未檢測到該突變，其子攜帶該突變，經(jīng)建議后行結(jié)腸鏡檢查發(fā)現(xiàn)胃及結(jié)直腸多發(fā)腺瘤性息肉，目前規(guī)律行內(nèi)鏡下治療。家系2患者檢測到APC基因的3129、3130位點堿基缺失，導(dǎo)致移碼突變，兩種突變均會導(dǎo)致截短的APC蛋白最終影響APC功能。家系2的突變類型均為第一次報道。家系3的突變?yōu)榈?0外顯子的無義突變，該突變位點既往CWalon等人報道過[21]，先證者母親同樣檢測到該變異，早期因為認識不足未重視，后復(fù)查腸鏡提示結(jié)腸腺瘤癌變而行手術(shù)治療。家系3及家系1的家系成員的臨床表現(xiàn)均較重且有腸外表現(xiàn)，突變位點均位于15外顯子以外的非突變熱點區(qū)域。臨床上對于年輕的結(jié)腸多發(fā)腺瘤患者，應(yīng)仔細詢問家族史，基因檢測可以幫助明確診斷，及時行相應(yīng)治療降低腫瘤發(fā)病率，并對家庭成員進行篩查，可根據(jù)基因檢測結(jié)果，對家庭高危成員盡早完善腸鏡檢查，對于未攜帶變異的家庭成員可按正常人群篩查。隨著FAP臨床表型和基因型相關(guān)性的進一步研究，臨床工作者可以對更準(zhǔn)確的為患者及家系成員提供診療及篩查意見，并可以用于產(chǎn)前篩查。