自體脂肪來源干細(xì)胞治療慢性創(chuàng)面的研究進(jìn)展

黎文正，姚思琦綜述，汪 虹審校

0 引 言

慢性創(chuàng)面也叫慢性難愈合創(chuàng)面，臨床上一般將經(jīng)過1個(gè)月以上正規(guī)創(chuàng)面治療未愈合，也無愈合趨勢的創(chuàng)面叫慢性難愈合創(chuàng)面[1]。主要包括各種原因引起的潰瘍、壓力性損傷、糖尿病創(chuàng)面，而現(xiàn)今各類癌癥患者治療后不愈合的創(chuàng)面也在與日俱增。據(jù)估計(jì)，慢性創(chuàng)面大約損害了全球 1%～2% 的人口，僅僅在美國就有超過 650 萬例確診病例，慢性創(chuàng)面治療的過程中給患者和醫(yī)療系統(tǒng)都帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)壓力，每年支出醫(yī)療保健系統(tǒng)超過 200 億美元[2]。最近我國解放軍總醫(yī)院特色醫(yī)學(xué)中心創(chuàng)面修復(fù)科進(jìn)行的889例體表慢性創(chuàng)面住院患者臨床流行病學(xué)研究顯示僅僅第1次住院患者的人均住院費(fèi)用就高達(dá)10多萬元，后續(xù)多次治療的費(fèi)用對慢性創(chuàng)面患者來說也是一筆不小的開支[3-4]，故此研究和開發(fā)慢性創(chuàng)面的新型治療方法已經(jīng)成為國內(nèi)外亟待解決的重大醫(yī)學(xué)問題。近年來興起的干細(xì)胞療法在世界范圍內(nèi)引起了廣泛的興趣。特別是自體脂肪移植中的ADSCs易于獲得，它們可以通過吸脂抽吸或切除脂肪組織來分離，故此保證了干細(xì)胞的充足來源，它可以從人體腹部、腿部等處大量提取，而不需要受到倫理學(xué)的制約，并且它的供體部位并發(fā)癥的發(fā)病率低[5]。以上這些優(yōu)點(diǎn)可以最大限度地減少患者的不適并消除耗時(shí)的體外擴(kuò)增步驟。移植自體脂肪來源干細(xì)胞帶來的慢性傷口治療新策略將是加速慢性傷口愈合的新希望，值得我們關(guān)注。本綜述介紹近年來自體脂肪來源干細(xì)胞在慢性創(chuàng)面治療中的可能機(jī)制和臨床聯(lián)合應(yīng)用，旨在為進(jìn)一步突破慢性創(chuàng)面愈合提供另一種新的思路。

1 ADSCs的概念、來源及功能

自體脂肪移植為慢性創(chuàng)傷患者提供了一種簡單而有效的治療選擇，在于其可以輸送具有強(qiáng)大再生特性的脂肪干細(xì)胞。ADSCs是多能間充質(zhì)干細(xì)胞[6]，具有與其他間充質(zhì)干細(xì)胞相似的分化潛能 ，表現(xiàn)出明確的干細(xì)胞特征：在體外擴(kuò)增時(shí)保持多能性和自我更新能力，與骨髓造血干細(xì)胞相比，在分離時(shí)具有更高的增殖率和更高的產(chǎn)量，并且在長期培養(yǎng)中更具有遺傳穩(wěn)定性。它可以很容易地從任何一種白色脂肪組織中分離出來，或從吸脂獲得的脂肪組織中分離。ADSCs移植幾乎不會(huì)對人體造成傷害，此前從脂肪組織中分離ADSCs大多數(shù)借用了實(shí)驗(yàn)室或?qū)嶒?yàn)室衍生的方法，耗時(shí)費(fèi)力且純度不高， Raposio等[7]研究者描述了一種相對簡單和快速的分離方案，該方案所有步驟都在閉路中進(jìn)行，以確保最大程度的工藝無菌，一旦通過標(biāo)準(zhǔn)的吸脂程序獲得脂肪組織，它就會(huì)經(jīng)歷第一次離心，以去除油和漿液部分，再經(jīng)過兩次洗滌和離心，就可以單獨(dú)獲得ADSCs顆粒。將這種ADSCs顆粒移植到皮膚邊緣和慢性皮膚潰瘍的底部，對創(chuàng)面愈合產(chǎn)生了積極的促進(jìn)作用。此外，ADSCs的干細(xì)胞抗原和標(biāo)記類似于從臍帶和骨髓中分離的干細(xì)胞，但與其他來源的干細(xì)胞相比，ADSCs具有顯著的優(yōu)勢，主要是在于其豐富和易于獲取[8]。ADSCs具有多向分化潛能，不僅可以分化為骨細(xì)胞、肝細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和神經(jīng)元，還可以分化為多功能的血管內(nèi)皮細(xì)胞[9]。目前正在進(jìn)行越來越多的臨床研究，以測試它們在各個(gè)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的潛力。

2 ADSC治療慢性創(chuàng)面的機(jī)制

自體脂肪移植由于其在創(chuàng)面治療中的有效性受到越來越多的關(guān)注，其中自體脂肪來源干細(xì)胞可能是影響創(chuàng)面愈合的最主要因素，其可能機(jī)制如下：

2.1多分化功能ADSCs 在促進(jìn)傷口愈合方面的一個(gè)優(yōu)勢是這些細(xì)胞具有很強(qiáng)的增值分化能力，可分化為創(chuàng)面愈合必須的內(nèi)皮細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞。以前的研究已經(jīng)報(bào)道，當(dāng) ADSCs 種植到支架上并應(yīng)用于創(chuàng)面時(shí)，顯示與成纖維細(xì)胞形態(tài)相似的結(jié)構(gòu) ，表明ADSCs 可以分化為成纖維細(xì)胞[3]。除此之外， ADSCs 還能分化為角質(zhì)細(xì)胞，Ebrahimian 在大鼠背側(cè)注射 綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP) 轉(zhuǎn)染的 ADSCs 后，經(jīng)過一段時(shí)間后發(fā)現(xiàn)表皮和真皮出現(xiàn) GFP 陽性細(xì)胞，并能夠表達(dá)兩種表皮角質(zhì)形成細(xì)胞標(biāo)志蛋白，細(xì)胞角蛋白 CK5 和 CK14，次實(shí)驗(yàn)證實(shí) ADSCs 分化為角質(zhì)形成細(xì)胞以增強(qiáng)創(chuàng)面再生[10]。另外Sivan等[11]還發(fā)現(xiàn)，通過在含有纖維蛋白復(fù)合物的仿生態(tài)環(huán)境中培養(yǎng)自體ADSCs，可以將 ADSCs分化為角質(zhì)形成細(xì)胞。

2.2促進(jìn)新生血管形成新生血管的形成在修復(fù)嚴(yán)重缺血和組織損傷的創(chuàng)面中起著重要的用,ADSCs 可不斷增殖分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，臨床上已經(jīng)用于治療缺血性血管疾病[12]。而難以愈合的原因主要在于慢性創(chuàng)面血管形成受阻，新血管形成網(wǎng)絡(luò)不足，造成傷口愈合過程中的細(xì)胞提供營養(yǎng)和氧氣支持不足[13]。因此，ADSCs 可誘導(dǎo)創(chuàng)面通過發(fā)芽的方式從先前存在的血管形成新血管，促進(jìn)慢性創(chuàng)面愈合。徐建文等將 ADSCs 與 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC)共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn) ADSCs 顯著促進(jìn)了 HUVECs 的增殖和遷移能力以及血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)mRNA 的表達(dá)，為ADSCs創(chuàng)面血管化的機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)[14]。Justyna等[15]在小鼠后肢缺血模型上進(jìn)行的生理或ADSC刺激的缺血組織新生血管過程，實(shí)驗(yàn)中觀察到當(dāng)ADSC注射到受傷的肌肉中時(shí)，新血管的形成速度更快，密度更高，表明ADSCs通過影響血管形成過程中每個(gè)步驟的新生細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)和比例，進(jìn)而促進(jìn)有效的缺血組織新生血管形成。

2.3再上皮化慢性創(chuàng)面暴露會(huì)使細(xì)菌在皮下組織繁殖，進(jìn)一步刺激創(chuàng)面部位的慢性炎癥，使慢性難愈合創(chuàng)面更難治療和加大組織修復(fù)難度[16]。如創(chuàng)面能適時(shí)再上皮化則會(huì)促進(jìn)創(chuàng)面愈合，Kim等[17]在理解ADSCs在組織再生和皮膚傷口愈合過程中的作用方面的突破已經(jīng)證明ADSCs促進(jìn)傷口邊緣的上皮再形成，促進(jìn)細(xì)胞增殖，并顯著減小傷口大小。最近的研究表明，ADSCs通過分泌誘導(dǎo)的旁分泌激活，包括下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-1和上調(diào)I型和III型膠原蛋白和纖連蛋白，以及通過細(xì)胞間的直接接觸，增強(qiáng)傷口愈合[18]。

2.4分泌多種生物活性因子研究表明[19]，ADSCs通過分泌生長因子和細(xì)胞因子來促進(jìn)皮膚修復(fù)和再生，并分化為其他譜系和細(xì)胞類型，從而參與傷口愈合過程，ADSCs可以分泌多種生長因子，如堿性成纖維細(xì)胞生長因子、VEGF、肝細(xì)胞生長因子和血小板衍生生長因子，調(diào)節(jié)創(chuàng)面炎癥微環(huán)境，加速創(chuàng)面局部微-血管化[20]。這些因子被認(rèn)為加速了正常和慢性傷口的愈合過程。

2.5調(diào)節(jié)炎癥健康皮膚創(chuàng)面愈合是一個(gè)復(fù)雜且高度調(diào)控的過程，包括炎癥、增殖、基質(zhì)形成和重構(gòu)，當(dāng)這個(gè)過程被打斷時(shí)，就會(huì)形成慢性不可愈合的創(chuàng)面，導(dǎo)致不同嚴(yán)重程度的開放性撕裂[21]。在身體受到損傷和感染時(shí)，炎癥會(huì)立即產(chǎn)生，這對于創(chuàng)面愈合至關(guān)重要，隨著愈合的進(jìn)展，炎癥會(huì)慢慢消失，介導(dǎo)修復(fù)和增殖的途徑開始[22]。有研究使用 siRNA 消耗 生長抑制特異性基因5(Growth Arrest-specific Transcripts5， GAS5)，結(jié)果表明 Toll 樣受體 7 表達(dá)水平受 GAS5 的調(diào)節(jié)，進(jìn)一步確定了受 GAS5 調(diào)節(jié)的炎癥通路[8]。體外研究表明，ADSCs通過分泌可溶性細(xì)胞因子和生長因子對傷口愈合有積極作用，且ADSCs的分泌特性特別適用于慢性傷口的病理生理環(huán)境，通過分泌旁分泌因子，ADSC可以調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，從而下調(diào)慢性炎癥活動(dòng)[23]。

3 ADSCs與其他方法聯(lián)合治療慢性創(chuàng)面

3.1 ADSCs聯(lián)合富含血小板血漿 (Platelet-rich plasma，PRP)促進(jìn)創(chuàng)面愈合以往的研究表明Notch 信號(hào)通路是一種進(jìn)化保守的信號(hào)機(jī)制，具有極強(qiáng)的多效性作用，此外，它還在調(diào)節(jié)增殖、血管生成和細(xì)胞凋亡/存活等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，但這些過程卻在糖尿病這類慢性難愈合創(chuàng)面中受到嚴(yán)重干擾[24]。Ebrahim 等[25]發(fā)現(xiàn)PRP 和 ADSCs 聯(lián)合治療在于通過調(diào)節(jié) Notch 通路，促進(jìn)血管生成，觸發(fā)表皮細(xì)胞增殖和募集，此聯(lián)合顯著加速了大鼠實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)的糖尿病創(chuàng)面愈合。有趣的是，最近的研究表明，PRP可能為ADSCs提供了一個(gè)適宜的促增殖分化微環(huán)境[26]。事實(shí)上，PRP中存在的生長因子在增強(qiáng)安全、自然的組織愈合方面發(fā)揮著基礎(chǔ)性作用，臨床上一直被用于慢性潰瘍、軟組織缺損和生長修復(fù)[27]。此外，聯(lián)合臍帶血源-ADSCs和PRP治療在聯(lián)合放療和創(chuàng)面損傷模型中可改善再生，增強(qiáng)血管生成[28]。

3.2ADSCs聯(lián)合內(nèi)皮細(xì)胞分泌體促進(jìn)創(chuàng)面愈合隨著全球糖尿病患病率的增加，預(yù)計(jì)無法愈合創(chuàng)面的患者數(shù)量將會(huì)顯著增加，然而，現(xiàn)有的治療方法，如血管重建術(shù)和足部護(hù)理教育，往往不足以確保令人滿意的傷口愈合。自體ADSCs療法在糖尿病患者中的作用也有限，原因在于干細(xì)胞表型受到糖尿病高糖環(huán)境的負(fù)面影響[29]。不過，Marc 科研團(tuán)隊(duì)的工作發(fā)現(xiàn)了糖尿病環(huán)境中ADSCs功能障礙的潛在病理過程，并確定了用分泌蛋白或HUVECs的分泌體啟動(dòng)ADSCs可以逆轉(zhuǎn)高糖濃度對ADSCs的有害影響，從而增強(qiáng)ADSCs參與血管生成和傷口愈合的能力，該方法顯著增強(qiáng)了糖尿病患者因糖尿病足或手術(shù)部位感染而產(chǎn)生的慢性創(chuàng)面的愈合率[30]。

3.3ADSCs 聯(lián)合各種生物敷貼促進(jìn)創(chuàng)面愈合隨著我國人口老齡化進(jìn)一步發(fā)展，因壓瘡、糖尿病足引起的慢性創(chuàng)面發(fā)生率逐年增高，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。目前，外膜敷貼已經(jīng)在慢性創(chuàng)面治療中被廣泛應(yīng)用，外膜敷貼為半透明生物薄膜，主要材料為豬內(nèi)臟器官膜，通過除抗原、消毒等處理后制作而成，但有研究表明針對慢性創(chuàng)面者單純給予外膜敷料一種治療方案，效果欠佳[31]?；诩?xì)胞療法在改善傷口愈合方面有很大的潛力，且不需要進(jìn)行大的手術(shù)程序和造成供區(qū)部位愈合后瘢痕增生[32]。鑒于此揚(yáng)州大學(xué)整形外科選用了新型治療方式，即在常規(guī)外膜敷貼基礎(chǔ)上采用自體ADSCs治療，結(jié)果提示該方案能顯著提高愈合效果，并上調(diào)多種創(chuàng)面生長因子水平，包括成纖維細(xì)胞生長因子b(fibroblast growth factorb,FGFb)、表皮細(xì)胞生長因子(Epidermal Growth Factor)、VEGF等[33]。另外，透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid,HA)作為一種天然存在于人體各種組織中的多糖，如關(guān)節(jié)、軟骨、眼睛和皮膚[34]。 Pak等[35]研究了HA貼片與脂肪來源的ADSCs在糖尿病鼠(diabetes mouse，db)模型中的效果，對組織中CD31和vWF進(jìn)行了染色，結(jié)果顯示ADSCs單獨(dú)或聯(lián)合HA貼片組均可觀察到CD31陽性的小血管，但HA貼片組CD31陽性血管數(shù)顯著高于ADSCs組。與這些觀察結(jié)果一致的是，接受HA貼片聯(lián)合ADSCs治療的小鼠顯示出最多的vWF陽性血管。以上兩種生物敷料和ADSCs的結(jié)合都進(jìn)一步說明了聯(lián)合利用可促進(jìn)慢性創(chuàng)面上皮化、肉芽組織形成和毛細(xì)血管形成。

4 展 望

綜上所述，慢性創(chuàng)面除了給患者和治療專家?guī)沓林刎?fù)擔(dān)外，還對全球醫(yī)療體系構(gòu)成了財(cái)務(wù)挑戰(zhàn)。然而，在某些情況下，慢性創(chuàng)面似乎對治療具有高度抵抗力，治療無效或進(jìn)展緩慢。因此，開發(fā)更有效的新的治療方法是必要的。自體脂肪移植在這方面提供了創(chuàng)新的方法，因?yàn)樗萌梭w自身的資源來修復(fù)組織損傷。脂肪組織易于獲取，ADSCs產(chǎn)量高，且其修復(fù)能力迄今被大大低估，因此該領(lǐng)域的發(fā)展前景看好[36]。雖然目前ADSCs的基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)踐還處于探索階段，但無論是單一進(jìn)行ADSCs富集脂肪移植到慢性傷口或者作為一種細(xì)胞療法輔助其它創(chuàng)面治療方法，其產(chǎn)生的創(chuàng)面治療效果和縮減醫(yī)療支出的前景，都值得廣大醫(yī)療科研人員在此領(lǐng)域深耕。