一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定枇杷葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑中3種綠原酸

李文兵， 邢 冷， 盧君蓉， 許 玲， 姜艷嬌， 劉 圓， 胡昌江3,*

(1.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，四川 成都 610041；2.四川省羌彝藥用資源保護(hù)與利用技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610225；3.國(guó)家中醫(yī)藥管理局“中藥配方顆粒質(zhì)量與臨床療效評(píng)價(jià)”重點(diǎn)研究室，四川 成都 611900；4.四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司，四川 成都 611900；5.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 611137；6.西南民族大學(xué)民族醫(yī)藥研究院，四川 成都 610041)

枇杷葉為薔薇科植物枇杷Eriobotryajaponica(Thunb.)Lindl.的干燥葉，是中醫(yī)臨床常用的一味中藥，具有清肺止咳，降逆止嘔之功效，臨床上常用于肺熱咳嗽、氣逆喘急、胃熱嘔逆、煩熱口渴等癥的治療[1]。現(xiàn)代研究表明，枇杷葉有止咳[2]、祛痰[3]、抗炎[4]、抗腫瘤[5]、抗腎衰竭[6]等藥理作用，其主要成分為三萜[7-8]、揮發(fā)油[9]、倍半萜[10]、黃酮[11]等。

枇杷葉在中醫(yī)臨床上多入湯劑，而2020年版《中國(guó)藥典》對(duì)其質(zhì)量控制指標(biāo)為三萜類(lèi)(齊墩果酸和熊果酸)，由于該類(lèi)成分極性較小，在湯劑中難以溶出和檢測(cè)。國(guó)家藥典委員會(huì)公示第一批中藥配方顆粒標(biāo)準(zhǔn)中，基于檢測(cè)成本的考慮，枇杷葉配方顆粒僅以綠原酸單一成分作為質(zhì)控指標(biāo)，導(dǎo)致其專(zhuān)屬性不強(qiáng)，難以全面控制產(chǎn)品質(zhì)量。因此，本文以綠原酸為參照物，建立枇杷葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑中一測(cè)多評(píng)方法，同時(shí)測(cè)定新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸的含量，不僅可以降低檢測(cè)成本，還能實(shí)現(xiàn)多成分同時(shí)檢測(cè)，增加專(zhuān)屬性，可為枇杷葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑及配方顆粒標(biāo)準(zhǔn)提升和修訂提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；Shimadzu LC-20A型高效液相色譜儀(日本島津公司)；Waters 2695-2996高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)；XP26型電子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；KQ5200DB型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；1810A摩爾原子型超純水器(上海摩勒科學(xué)儀器有限公司)；NCCO-300型全自動(dòng)切藥機(jī)(杭州金竺機(jī)械有限公司)；全自動(dòng)分體式陶瓷煎藥壺(潮州市永達(dá)基電器廠)；LGJ-100F型真空冷凍干燥機(jī)(北京松源華興科技發(fā)展有限公司)。

1.2 試劑與藥物 綠原酸(批號(hào)110753-201415，純度96.2%，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；新綠原酸(批號(hào)17062003，純度98%)、隱綠原酸(批號(hào)17061401，純度98%)對(duì)照品(成都普菲德生物技術(shù)有限公司)。枇杷葉20批，產(chǎn)地四川簡(jiǎn)陽(yáng)(3批)、金堂(4批)、仁壽(8批)、中江(1批)(批號(hào)BT01～BT16)，浙江紹興、麗水(各1批)(批號(hào)BT17～BT18)，福建南平(2批)(批號(hào)BT19～BT20)，經(jīng)專(zhuān)家鑒定為正品，按照2020年版《中國(guó)藥典》規(guī)定除去絨毛，用水噴潤(rùn)，切絲，干燥。乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent 5 HC C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相0.4%磷酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～5 min，95%A；5～35 min，95%～78%A；35～50 min，78%A)；體積流量1.0 mL/min；柱溫35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)327 nm；進(jìn)樣量10 μL。在此條件下，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸色譜峰與樣品中其他組分色譜峰達(dá)到基線分離，理論塔板數(shù)均大于5 000，見(jiàn)圖1。

1.新綠原酸 2. 綠原酸 3. 隱綠原酸圖1 各綠原酸HPLC色譜圖

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸對(duì)照品適量，置于量瓶中，50%甲醇溶解并稀釋至刻度，質(zhì)量濃度分別為1.077 2、0.581 5、0.348 1 mg/mL，精密量取適量，置于量瓶中，50%甲醇稀釋至刻度，即得(含綠原酸0.430 9、0.172 4、0.068 9、0.027 6、0.011 0 mg/mL，新綠原酸0.232 6、0.093 0、0.037 2、0.014 9、0.006 0 mg/mL，隱綠原酸0.139 2、0.055 7、0.022 3、0.008 9、0.003 6 mg/mL)。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備 取飲片適量，按枇杷葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑工藝制備[12]，即得。

2.4 供試品溶液制備 取標(biāo)準(zhǔn)湯劑粉末約0.2 g，精密稱(chēng)定，置于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 50%甲醇，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲(600 W、40 kHz)處理30 min，放冷，50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣10 μL測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各綠原酸線性關(guān)系

2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液10 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸峰面積RSD分別為0.08%、0.12%、0.09%，表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批本品(批號(hào)BT01)6份，按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣10 μL測(cè)定，測(cè)得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸含量RSD分別為0.78%、0.89%、1.01%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液(批號(hào)BT01)適量，于0、1、2、4、8、16、24 h在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣10 μL測(cè)定，測(cè)得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸含量RSD分別為1.24%、1.03%、1.51%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取各成分含量已知的標(biāo)準(zhǔn)湯劑(批號(hào)BT01)6份，每份0.10 g，加入1 mL對(duì)照品溶液(含綠原酸0.404 1 mg/mL、新綠原酸0.352 0 mg/mL、隱綠原酸0.503 2 mg/mL)，按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣10 μL測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各綠原酸加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.10 相對(duì)校正因子、相對(duì)保留時(shí)間測(cè)定及耐用性考察

2.10.1 相對(duì)校正因子 以綠原酸為內(nèi)標(biāo)，采用多點(diǎn)校正法[13-15]計(jì)算新綠原酸和隱綠原酸的相對(duì)校正因子、相對(duì)保留時(shí)間，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.10.2 不同儀器對(duì)相對(duì)校正因子的影響 考察Agilent 1260、Shimadzu LC-20A、Waters 2695-2996色譜儀對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果見(jiàn)表4，可知均無(wú)明顯影響(RSD<3%)。

2.10.3 不同色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響 在Agilent 1260 HPLC色譜儀上，考察Agilent 5 HC、Phenomenex、Diamonsil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果見(jiàn)表5，可知均無(wú)明顯影響(RSD<3%)。

表3 各綠原酸相對(duì)校正因子、相對(duì)保留時(shí)間測(cè)定結(jié)果

表4 不同儀器對(duì)相對(duì)校正因子的影響(n=3)

表5 不同色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響(n=3)

2.11 樣品含量測(cè)定 取不同產(chǎn)地、批次標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉，按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下分別采用外標(biāo)法、一測(cè)多評(píng)法測(cè)定含量，結(jié)果見(jiàn)表6，可知2種方法無(wú)明顯差異，表明一測(cè)多評(píng)法具有較高的可信度。

3 討論

中藥標(biāo)準(zhǔn)湯劑是在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，參考現(xiàn)代提取方法，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化工藝制備而成的單味或復(fù)方中藥水煎劑[16-17]，主要用于中藥新型飲片及成方制劑的工藝規(guī)范、質(zhì)量控制及一致性評(píng)價(jià)等[18]?！皹?biāo)準(zhǔn)湯劑”概念最早由日本提出，作為漢方藥制劑的化學(xué)和生物學(xué)基準(zhǔn)。國(guó)內(nèi)在1998年魏剛[19]首次提出中藥復(fù)方的研究應(yīng)建立在標(biāo)準(zhǔn)湯劑的基礎(chǔ)之上，但直到2016年陳士林等[20]系統(tǒng)闡述中藥標(biāo)準(zhǔn)湯劑的內(nèi)涵和外延，才引起相關(guān)監(jiān)管部門(mén)的重視，并逐漸成為評(píng)價(jià)中藥配方顆粒及經(jīng)典名方制劑工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是否合理的基準(zhǔn)物質(zhì)。

表6 各綠原酸含量測(cè)定結(jié)果(n=2)

2020年版《中國(guó)藥典》枇杷葉質(zhì)量控制指標(biāo)為熊果酸和齊墩果酸，前期對(duì)20批次枇杷葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑中熊果酸和齊墩果酸含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)湯劑中熊果酸和齊墩果酸含量極微，總量?jī)H為0.002%～0.072%；進(jìn)一步通過(guò)UPLC-Q-TOF-MS對(duì)枇杷葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑中化學(xué)成分進(jìn)行鑒定，并參照文獻(xiàn)[21]用標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)，確認(rèn)含有新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸等3種苯丙素類(lèi)成分，且含量較高。該類(lèi)成分有抗菌[22]、抗炎[23]等藥理作用，與枇杷葉清肺止咳傳統(tǒng)功效有一定關(guān)聯(lián)性，因此，選擇3種綠原酸類(lèi)成分作為標(biāo)準(zhǔn)湯劑的含測(cè)指標(biāo)，并建立一測(cè)多評(píng)含量測(cè)定方法，不僅可節(jié)約檢測(cè)成本，還能提高質(zhì)量控制專(zhuān)屬性，可為枇杷葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑及配方顆粒標(biāo)準(zhǔn)的修訂提供參考。