SIRT1通過(guò)調(diào)控TET2促進(jìn)小于胎齡兒下丘腦中星形膠質(zhì)細(xì)胞分化*

山 丹，時(shí)青云

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院 北京婦幼保健院產(chǎn)科，北京 100026)

小于胎齡兒(small for gestation age,SGA)是指出生體重在相同胎齡兒平均體重的第10個(gè)百分位以下，或胎齡滿37孕周出生體質(zhì)量低于2500g的嬰兒。流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，全球新生兒的SGA發(fā)生率為2.3%～10.0%，中國(guó)為3.4%～9.0%[1]。胎齡較小不僅增加新生兒的死亡風(fēng)險(xiǎn)，而且胎齡較小的嬰兒神經(jīng)發(fā)育遲緩、成年后肥胖的風(fēng)險(xiǎn)也高于正常嬰兒。研究報(bào)道，SGA下丘腦神經(jīng)發(fā)育調(diào)控異常，導(dǎo)致異常的食欲/生理飽足感和細(xì)胞信號(hào)反應(yīng)，出現(xiàn)青春期體重快速追趕以及成年后肥胖[2]。此外，SGA在學(xué)齡期的認(rèn)知能力、注意力集中能力、運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力、記憶功能以及反應(yīng)靈敏度等方面的表現(xiàn)均低于正常胎齡出生的兒童[3-4]。有研究證明，SGA因在宮內(nèi)處于營(yíng)養(yǎng)不良環(huán)境，發(fā)育潛力受限，對(duì)下丘腦神經(jīng)前體細(xì)胞(neural precursor cells，NPCs)的增殖分化產(chǎn)生不利影響，具體表現(xiàn)為增殖減少，優(yōu)先分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞[5]。

SIRT1(silent mating type information regulation 1)屬于依賴(lài)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的Ⅲ類(lèi)組蛋白脫乙酰基酶，可通過(guò)乙?；{(diào)控多種轉(zhuǎn)錄因子，具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用[6]。SIRT1作為“細(xì)胞能量傳感器”參與體內(nèi)多種生理功能的調(diào)節(jié)，包括胚胎時(shí)期的神經(jīng)發(fā)生[7-8]。大部分SGA的發(fā)生是由胎盤(pán)功能不全導(dǎo)致，存在缺氧，因此SGA在宮內(nèi)長(zhǎng)期處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。在SGA下丘腦中，氧化應(yīng)激可通過(guò)調(diào)節(jié)SIRT1的高表達(dá)，促使NPCs向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化[9]。DNA甲基化是主要的表觀遺傳機(jī)制之一，能夠調(diào)節(jié)NPCs的細(xì)胞命運(yùn)并控制神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的順序生成[10]。DNA甲基化也是星形膠質(zhì)細(xì)胞分化的內(nèi)在關(guān)鍵決定性因素，經(jīng)典星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物(GFAP)啟動(dòng)子的甲基化與GFAP的活性表達(dá)以及星形膠質(zhì)細(xì)胞的生成呈負(fù)相關(guān)[11-12]。TET甲基胞嘧啶雙加氧酶2(TET2)作為DNA去甲基化過(guò)程中的關(guān)鍵酶，能夠改變DNA甲基化狀態(tài)，從而觸發(fā)被動(dòng)的DNA去甲基化[13]。研究證明，TET2在星形膠質(zhì)細(xì)胞中高度表達(dá)，通過(guò)對(duì)星形膠質(zhì)譜系基因的去甲基化作用，促使神經(jīng)前體細(xì)胞分化趨勢(shì)由神經(jīng)元轉(zhuǎn)換為星形膠質(zhì)細(xì)胞[14]。SIRT1與DNA甲基化密切相關(guān)，TET2的活性表達(dá)受SIRT1調(diào)控[15]。Sun等[16]運(yùn)用RNA篩選和蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明，SIRT1使骨髓增生異常綜合征中干細(xì)胞的TET2催化域中保守的賴(lài)氨酸殘基處脫乙酰，增強(qiáng)了TET2的活性。鑒于SIRT1與TET2均對(duì)神經(jīng)前體細(xì)胞的分化產(chǎn)生影響，且SIRT1對(duì)TET2的活性具有調(diào)控作用，因此，推測(cè)在SGA下丘腦中，SIRT1可能通過(guò)影響TET2的活性來(lái)調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)記物(GFAP)啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平，從而介導(dǎo)SGA下丘腦神經(jīng)前體細(xì)胞向星形膠質(zhì)細(xì)胞的分化,促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的生成。本研究通過(guò)構(gòu)建SGA動(dòng)物模型，采用體外細(xì)胞培養(yǎng)的方法，探討SIRT1和TET2在NPCs向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化過(guò)程中的調(diào)控關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD孕鼠：購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，本研究已通過(guò)倫理審查，得到北京首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物研究委員會(huì)的批準(zhǔn)(倫理編號(hào)：AEEI-2019-111)，并按國(guó)家批準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物保護(hù)和使用機(jī)構(gòu)指南進(jìn)行。

1.2 主要試劑和材料 Neurobasal培養(yǎng)基、B27(50x)、肝素?zé)晒馑嘏悸?lián)物購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，GFAP抗體(GTX34756)和Tuj1抗體(GTX130245)(美國(guó)GeneTex公司)，TET2多克隆抗體(BS7804)(美國(guó)bioworld公司)，SIRT1抗體(DF6033)和Nestin抗體(DF7754)(Affinity公司)，SIRT1抑制劑(sirtinol)(ab141263)購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，SIRT1激活劑白藜蘆醇(ST1623)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，大鼠表皮生長(zhǎng)因子(美國(guó)Peprotech公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和RT-PCR熒光定量試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)，甲基化特異性PCR試劑盒和DNA重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑盒購(gòu)自天根公司，辣酸根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(bs-0295G-HRP)(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 構(gòu)建SGA大鼠模型 將12只無(wú)特定病原體級(jí)(specific pathogen free,SPF)的SD(Sprague-Dawley)孕鼠隨機(jī)分為SGA組和對(duì)照組,各6只，體質(zhì)量約200～300g，日齡90～120d,在室溫(18～25℃)、相對(duì)濕度為60%～70%的無(wú)菌屏障系統(tǒng)內(nèi)飼養(yǎng)。對(duì)照組給予繁殖飼料喂養(yǎng)，妊娠期間不限制飼料和飲水；SGA組給予8%低蛋白飼料喂養(yǎng)，自孕10天起，給予50%限制飲食(依據(jù)對(duì)照組前一天的正常平均飲食量)。

1.3.2 分離培養(yǎng)神經(jīng)前體細(xì)胞 分別在SGA組和對(duì)照組每只孕鼠生產(chǎn)的幼崽中隨機(jī)取4只子代鼠(均為雄性)，腹腔注射10%水合氯醛,按0.5mL/100g劑量處死，無(wú)菌條件下分離各組子代鼠腦組織，將大腦轉(zhuǎn)移至DMEM/F12培養(yǎng)基中，分離下丘腦。將分離好的下丘腦組織剪碎，用0.1%胰蛋白酶-EDTA在37℃的CO2培養(yǎng)箱中分解5min，用10%FBS溶液清洗，使胰蛋白酶失活，將分解后的細(xì)胞過(guò)濾,1000r/min離心5min，棄上清,置完全培養(yǎng)基(CM，5×104/mL，由Neurobasal培養(yǎng)基、1% 抗體、2% B27、20ng/mL FGF2、20ng/mL EGF、1μg/mL肝素和2.5μg/mL的L-谷氨酰胺配制而成)中，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8～9天，每三天更換一次培養(yǎng)基，收集P0代神經(jīng)球，相同過(guò)程再培養(yǎng)8～9天后，收集P1代細(xì)胞。各組P1代細(xì)胞解離后重懸于分化培養(yǎng)基(DM，不加FGF2、EGF、肝素)，隨機(jī)分為3組:第一組加入SIRT1抑制劑(sirtinol);第二組加入SIRT1激活劑(白藜蘆醇);第三組為空白對(duì)照組，培養(yǎng)8～9天后收集細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3 QT-PCR檢測(cè)SGA大鼠下丘腦神經(jīng)前體細(xì)胞中SIRT1、TET2、GFAP的mRNA表達(dá) 采用Trizol法提取樣本總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增。引物序列：SIRT1上游為5'-TGAGAGAAGTCAGCATCGCATTG-3'，下游為5'-ATGGAGGCTCACAGTGATAGG-3'；TET2上游為5'-GGAGGAGAAGAGTCAGGAGGTTAGTG-3'，下游為5'-CCGAAGTTGTGCTGTCATCTGTATCA-3'；GFAP上游為5'-TGAGGAAGATCCATGAGGAGGAAGTT-3'，下游為5'-AGTTGGCGGCGATAGTCATTAGC-3'；GAPDH上游為5'-GGCAAGTTCAACGGCACAG-3'，下游為5'-CGCCAGTAGACTCCACGACA-3'。反應(yīng)條件：95℃變性10s，60℃退火20s，72℃延伸20s，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行定量分析，計(jì)算SIRT1、TET2、GFAP的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4 Western blot法檢測(cè)SIRT1、TET2、GFAP蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，按10μL/孔的上樣量進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉，一抗4℃過(guò)夜孵育，TBST充分洗滌，加相應(yīng)HRP標(biāo)記二抗，室溫孵育1h，加化學(xué)發(fā)光劑，用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行曝光，以GAPDH為內(nèi)參，用Image J軟件分析灰度值。

1.3.5 免疫熒光測(cè)定下丘腦神經(jīng)前體細(xì)胞中Tuj1/GFAP比例 將下丘腦組織用石蠟包埋，切片，用二甲基苯脫蠟兩次，每次10min，通過(guò)梯度滲透洗脫酒精；組織切片置于3%過(guò)氧化氫溶液中浸泡15min，PBS洗滌，檸檬酸鈉溶液進(jìn)行抗原回收;用PBS溶液洗滌3次，每次5min，山羊血清室溫封閉2h，棄血清，按1∶200比例加一抗GFAP，按1∶500比例加一抗Tuj1，4℃濕盒過(guò)夜，PBS洗滌，羊抗兔抗體(1∶200)室溫下避光孵育2h，PBS洗滌，加DAPI染料(1∶50稀釋)染色10min，PBS洗滌，抗熒光猝滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察，使用Image J軟件分析光密度值。

1.3.6 下丘腦神經(jīng)前體細(xì)胞中GFAP啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化測(cè)定 用動(dòng)物組織/細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒提取DNA，將獲取的DNA置于-20℃保存?zhèn)溆?。采用核酸定量?jī)x檢測(cè)DNA含量和純度。用甲基化特異性PCR試劑盒對(duì)DNA樣本進(jìn)行重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化，PCR反應(yīng)條件：95℃ 5min，1個(gè)循環(huán)；94℃ 20s,60℃ 30s，72℃ 20s，35個(gè)循環(huán)后72℃ 5min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。GFAP啟動(dòng)子甲基化上游引物：5'-ATATAGTGAATTTTAGGGGATACGA-3',下游引物：5'-CTCTACTCCATACCAAAAACACGAT-3'；未甲基化上游引物：5'-ATATAGTGAATTTTAGGGGATATGA-3'，下游引物：5'-CTCTACTCCATACCAAAAACACAAT-3'。MSP結(jié)果判讀：完全甲基化：甲基化特異引物擴(kuò)增出目的條帶，而非甲基化特異引物沒(méi)有擴(kuò)增出目的條帶；部分甲基化：甲基化特異引物和非甲基化特異引物均擴(kuò)增出目的條帶；非甲基化：非甲基化特異引物擴(kuò)增出目的條帶，而甲基化特異引物沒(méi)有擴(kuò)增出目的條帶。本研究將完全甲基化與部分甲基化均按甲基化統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié) 果

2.1 出生體重的比較 所有后代鼠的體重均為自然分娩后第一天立即測(cè)量所得。SGA組的所有后代鼠(不區(qū)分性別)體重均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明建模成功，見(jiàn)表1。

表1 SGA組和對(duì)照組不同孕周后代鼠體重對(duì)比

2.2 小于胎齡子代鼠下丘腦NPCs分化改變及SIRT1、TET2、GFAP的表達(dá)變化

2.2.1 SGA大鼠下丘腦中NPCs分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞的比例增加 GFAP為星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化標(biāo)記物，Tuj1為神經(jīng)元活化標(biāo)記物。免疫熒光結(jié)果顯示，SGA組子鼠下丘腦組織中GFAP表達(dá)增加，Tuj1表達(dá)減少，神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細(xì)胞的比例(Tuj1/GFAP)與對(duì)照組相比顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。兩組子鼠下丘腦熒光染色見(jiàn)圖1，Tuj1/GFAP熒光光密度值比值對(duì)比見(jiàn)圖2。

圖1 對(duì)照組和SGA組子鼠下丘腦GFAP、Tuj1免疫熒光染色(100×)紅色熒光為GFAP表達(dá)，綠色熒光為T(mén)uj1表達(dá)，藍(lán)色熒光為DAPI核染

2.2.2 SGA子鼠下丘腦中SIRT1、TET2、GFAP蛋白和mRNA表達(dá)增加 Western blot結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，SGA組子鼠下丘腦組織中SIRT1(P<0.01)、TET2(P<0.05)、GFAP(P<0.05)蛋白表達(dá)均顯著增加，見(jiàn)圖3。RT-PCR定量分析結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比，SGA組子鼠下丘腦組織中SIRT1(P<0.01)、TET2(P<0.01)、GFAP(P<0.05)mRNA表達(dá)增多，見(jiàn)圖4。

2.2.3 SGA組子鼠下丘腦GFAP啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平降低 SGA組子鼠GFAP啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平降低，非甲基化水平增高。電泳條帶灰度值分析結(jié)果見(jiàn)圖5A。甲基化/非甲基化灰度值比值分析見(jiàn)圖5B，結(jié)果表明，SGA組子鼠GFAP啟動(dòng)子區(qū)域甲基化/非甲基化水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 對(duì)照組和SGA組子鼠下丘腦Tuj1/GFAP雙重免疫熒光染色平均熒光光密度比值分析

圖3 對(duì)照組及SGA組子鼠下丘腦SIRT1(A)、TET2(B)、GFAP(C)蛋白表達(dá)

圖4 對(duì)照組及SGA組子鼠下丘腦SIRT1(A)、TET2(B)、GFAP(C)mRNA的表達(dá)

2.3 SIRT1介導(dǎo)的TET2活性變化促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞分化

2.3.1 SIRT1調(diào)控下丘腦神經(jīng)細(xì)胞中的TET2表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)GFAP表達(dá)水平 神經(jīng)前體細(xì)胞體外分化培養(yǎng)，收集細(xì)胞，Western blot法分析SIRT1、TET2、GFAP蛋白表達(dá)。SGA組子鼠的SIRT1表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.01)(圖6A、B)，分別在SGA組和對(duì)照組培養(yǎng)基中加SIRT1抑制劑sirtinol(50μmol/L)，培養(yǎng)8天后，收集細(xì)胞。相對(duì)于未添加抑制劑或激活劑組，SIRT1表達(dá)受明顯抑制(P<0.05)；同樣，加SIRT1激活劑白藜蘆醇(50μmol/L)培養(yǎng)8天后，SIRT1表達(dá)增加(P<0.05)。表明加入的相關(guān)酶試劑對(duì)SIRT1的抑制及激活有效。相比于對(duì)照組，SGA組子鼠的TET2、GFAP蛋白表達(dá)增加(圖6C、D)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在加sirtinol培養(yǎng)后，對(duì)照組和SGA組的TET2、GFAP表達(dá)均減少，低于各自未做處理的空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在加白藜蘆醇培養(yǎng)后，對(duì)照組和SGA組的TET2、GFAP表達(dá)均增加，高于各自未作處理的空白組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖6C、D)。RT-PCR法分析對(duì)照組、SGA組SIRT1、TET2、GFAP在不同處理?xiàng)l件下的mRNA表達(dá)，結(jié)果同Western blot(圖7)。

圖5 對(duì)照組及SGA組子鼠下丘腦GFAP啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平分析

圖6 對(duì)照組及SGA組子鼠下丘腦SIRT1、TET2、GFAP蛋白的表達(dá)

2.3.2 SIRT1介導(dǎo)的TET2活性改變、調(diào)節(jié)GFAP啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平 MSP法測(cè)定體外培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞中GFAP啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平，見(jiàn)圖8。與對(duì)照組相比，SGA組子鼠的GFAP啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平降低，非甲基化水平升高，加sirtinol干預(yù)后，SGA組和對(duì)照組的甲基化水平均升高，非甲基化水平均降低。用白藜蘆醇干預(yù)后，SGA組和對(duì)照組的甲基化水平均降低，非甲基化水平均增加。電泳條帶灰度值分析結(jié)果顯示，SGA組的甲基化水平低于對(duì)照組，加sirtinol的SGA組和對(duì)照組甲基化水平相對(duì)于各自的空白處理組均有所升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),加白藜蘆醇處理后SGA組和對(duì)照組甲基化水平均降低，低于各自的空白處理組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖7 control組及SGA組子鼠下丘腦SIRT1(A)、TET2(B)、GFAP(C)mRNA的表達(dá)

圖8 control組及SGA組子鼠GFAP啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平分析

3 討 論

SGA一直以來(lái)都受到廣泛關(guān)注。SGA不僅會(huì)導(dǎo)致圍產(chǎn)期的死亡率和患病率增加，還會(huì)引起兒童生長(zhǎng)時(shí)期甚至成年后發(fā)育和代謝異常。目前國(guó)內(nèi)外建立SGA動(dòng)物模型主要有外科手術(shù)法、被動(dòng)吸煙法、母體營(yíng)養(yǎng)不良法、饑餓(限制飲食)法[17],其中限制飲食法的應(yīng)用較為廣泛且成熟。本研究運(yùn)用限制飲食法，具體采用8%低蛋白飲食喂養(yǎng)、孕10天起50%限制飲食進(jìn)行建模，以SGA組子鼠出生體重低于對(duì)照組出生體重2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差為建模成功標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果顯示對(duì)照組后代鼠體重明顯大于SGA組后代鼠，SGA模型建立成功。SGA由于神經(jīng)發(fā)育遲緩，在嬰兒期、學(xué)齡期的認(rèn)知能力和學(xué)習(xí)能力低下，青春期出現(xiàn)體重追趕性增長(zhǎng)以及成年后肥胖的風(fēng)險(xiǎn)增加[18]。在哺乳動(dòng)物大腦中，NPCs分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)維持大腦功能、保證其正常發(fā)育具有重要意義，NPCs是一種終生具有自我更新能力的細(xì)胞，誘導(dǎo)后可分化為特定類(lèi)型的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞[19]。在大腦皮層的正常發(fā)育過(guò)程中，NPCs首先分化為神經(jīng)元，隨后逐漸分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞[20]。研究發(fā)現(xiàn)，SGA下丘腦NPCs增殖分化受損，提前且傾向于分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞，導(dǎo)致下丘腦中調(diào)控食欲的神經(jīng)元發(fā)育異常[21]。本實(shí)驗(yàn)研究中，利用雙重免疫熒光染色對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化標(biāo)記物(GFAP)以及神經(jīng)元的標(biāo)記物(Tuj1)在新生大鼠下丘腦中的表達(dá)進(jìn)行了分析，結(jié)果表明SGA新生大鼠下丘腦中的GFAP表達(dá)高于正常組，而Tuj1表達(dá)降低，提示SGA子鼠下丘腦NPCs存在分化異常，分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞的比例增多。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外越來(lái)越多的研究表明，異常的DNA甲基化會(huì)影響胎兒的宮內(nèi)發(fā)育，與小于胎齡兒的發(fā)生有關(guān)[22-24]。DNA甲基化在神經(jīng)發(fā)生的過(guò)程中起多種作用，NPCs早期分化為神經(jīng)元時(shí)，神經(jīng)膠質(zhì)譜系基因被DNA甲基化作用所抑制[25]，因此，DNA甲基化的異常變化能影響NPCs的分化命運(yùn)，對(duì)神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞的存活至關(guān)重要。目前普遍認(rèn)為，DNA甲基化水平與基因表達(dá)成反比，高甲基化水平會(huì)抑制基因的表達(dá)[26]。GFAP啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平是胚胎神經(jīng)發(fā)生過(guò)程中星形膠質(zhì)細(xì)胞分化的關(guān)鍵決定因素，GFAP的活性表達(dá)以及星形膠質(zhì)細(xì)胞的生成與GFAP啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平呈負(fù)相關(guān)[11-12]。我們利用甲基化特異性PCR(MSP)方法測(cè)定SGA和正常新生大鼠下丘腦組織中GFAP啟動(dòng)子區(qū)域的的甲基化水平。結(jié)果顯示SGA子鼠的GFAP甲基化水平明顯低于正常對(duì)照組，與GFAP的蛋白及mRNA表達(dá)增加這一結(jié)果相符，證明了SGA下丘腦中GFAP的活性增加可能與其啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平降低相關(guān)。DNA去甲基化依賴(lài)于去甲基化酶，TET2(ten-eleven translocation)蛋白是一種α-酮戊二酸和Fe2+依賴(lài)的雙加氧酶，是DNA去甲基化過(guò)程中的一種重要的酶，將5-甲基胞嘧啶(5mc)氧化為5-羥甲基胞嘧啶(5hmc)，而5hmc的沉積觸發(fā)被動(dòng)的DNA去甲基化[27]。He等[14]發(fā)現(xiàn)，TET2的過(guò)表達(dá)促進(jìn)NPCs向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化，使用shRNA敲低TET2的表達(dá)后，明顯降低了NPCs向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化的比例，這一結(jié)果也說(shuō)明了TET2是星形膠質(zhì)細(xì)胞譜系分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。本研究結(jié)果顯示，SGA大鼠下丘腦組織中TET2、GFAP表達(dá)均高于對(duì)照組，且GFAP的DNA甲基化水平降低，提示在SGA子鼠的下丘腦中，GFAP啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平的降低可能是被TET2活性的變化所調(diào)控。

TET2的活性受乙?；饔玫恼{(diào)節(jié)[28]。SIRT1屬于依賴(lài)NAD+的Ⅲ類(lèi)組蛋白脫乙酰酶，與組蛋白乙?；腹餐S持細(xì)胞核的乙?；胶?。最近一項(xiàng)關(guān)于骨髓增生異常綜合征中造血干細(xì)胞的研究表明，SIRT1與TET2催化域中的保守賴(lài)氨酸殘基融合，從而增強(qiáng)了TET2的活性，抑制造血干細(xì)胞的異常增殖[29]。Simeoni等[30]研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1對(duì)TET2催化域內(nèi)的K1472、K1473和K1478等保守賴(lài)氨酸殘基位點(diǎn)進(jìn)行脫乙?；稍鰪?qiáng)TET2與DNA的相互作用，提高TET2的催化活性。此外，SIRT1參與體內(nèi)許多生理功能的調(diào)節(jié)，在胚胎發(fā)育時(shí)期，SIRT1在腦部高度表達(dá)，影響神經(jīng)元和腦發(fā)育[31]。Desai等[9]對(duì)SGA動(dòng)物模型進(jìn)行體外神經(jīng)球培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，研究表明，SGA新生兒和成年后代的下丘腦中NPCs增殖減少，神經(jīng)元標(biāo)記物Tuj1降低，SIRT1表達(dá)增加。沉默SIRT1后，NPCs增殖恢復(fù)正常水平，Tuj1表達(dá)增加。證明了SGA下丘腦中SIRT1高表達(dá)誘導(dǎo)了NPCs的過(guò)早分化，減少其增殖，使NPCs向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化增加，分化為神經(jīng)元的數(shù)目變少。

為進(jìn)一步驗(yàn)證SGA下丘腦中SIRT1與TET2之間是否存在調(diào)控關(guān)系以及對(duì)NPCs向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化的影響，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)的方式，通過(guò)在培養(yǎng)基中加入SIRT1抑制劑(sirtinol)或SIRT1激活劑(白藜蘆醇)對(duì)SIRT1的活性進(jìn)行干預(yù)處理，各組SIRT1表達(dá)均被有效干預(yù)。與不做處理的空白組相比，加入sirtinol組的TET2及GFAP活性降低，加入白藜蘆醇組的TET2、GFAP活性增加。表明在SGA下丘腦NPCs分化時(shí)，SIRT1的高表達(dá)增加了TET2的活性，使GFAP表達(dá)增加，星形膠質(zhì)細(xì)胞分化增加。為明確這一調(diào)控過(guò)程是否是通過(guò)影響GFAP啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平而實(shí)現(xiàn)，采用MSP方法測(cè)定不同干預(yù)條件下各組的GFAP啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平，結(jié)果表明，加入sirtinol的SGA組GFAP啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平增加，非甲基化水平降低，加入白藜蘆醇后，SGA組GFAP啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平降低，非甲基化水平增加。提示SGA下丘腦中SIRT1可能通過(guò)介導(dǎo)TET2的活性改變，調(diào)節(jié)GFAP啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平，從而影響星形膠質(zhì)細(xì)胞的分化。

綜上所述，在SGA下丘腦中，SIRT1的高表達(dá)可能增強(qiáng)了TET2的活性，繼而改變TET2的功能，使GFAP啟動(dòng)子區(qū)域的DNA去甲基化水平增加，從而增加GFAP表達(dá)，促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的分化。