兩種UC小鼠模型的病理損傷和腸道菌群對比研究

諶雪梅,彭西,葉俏波,葉臻,鄧慶,王娟,溫昌琳,袁施彬*

(1.西華師范大學生命科學學院,四川 南充 637002;2.成都大學藥學院,成都 610106;3.成都中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院,成都 611137;4.四川揚克斯特科技有限公司,成都 611135)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)的一種,病因與遺傳、免疫和環(huán)境因素有關(guān),主要引起結(jié)腸和直腸黏膜及黏膜下層的非特異性慢性炎癥,臨床癥狀包括腹泄、腹痛、便血、嘔吐和體重減輕等[1]。UC發(fā)病時,可見腸道菌群失衡、腸道免疫反應過度,并兼有腸道黏膜損傷[2]。早在1958年,就有將健康人的糞便功能菌移植進患者體內(nèi)來治療UC的報道[3]。臨床應用顯示,腸道糞菌移植治療能修復腸道菌群、緩解過度免疫、減輕癥狀[4],但存在供體菌標準化和耐藥菌傳播等問題。UC動物模型是研究發(fā)病學、篩選藥物、評價藥效的必要手段,根據(jù)建模方法可分為化學性、免疫和基因修飾性兩大類[5]。其中,DSS(dextran sulfate sodium)模型和TNBS(2,4,6-trinitrobenzen sulfonic acid)乙醇模型是最常用的化學性動物模型[6-7]。至今尚未見有關(guān)于這兩種模型腸道菌群改變的對比研究。因此,本實驗分別用DSS自由飲法和TNBS乙醇混合物灌腸法,建立C57BL/6小鼠的UC模型,對比研究DSS模型和TNBS模型的結(jié)腸病理損傷和菌群構(gòu)成特征的差異性,豐富了UC動物模型的基礎(chǔ)研究資料。結(jié)果可為選擇不同UC動物模型提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

6～8周齡的SPF級雄性C57BL/6小鼠30只,由四川大學提供【SCXK(川)2018-026】,體重20～22 g。動物飼養(yǎng)于成都中醫(yī)藥大學【SYXK(川)2017-179】。造模前適應性喂養(yǎng)1周,室溫控制20～23℃,濕度控制50%～60%,自然光暗周期。所有實驗操作均通過西華師范大學倫理委員會的審查(審準號:CWNU2021D031)。

1.1.2 主要試劑與儀器

DSS(0216011090,MP Bio公司)、TNBS(P2297,西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司)、注射用鹽酸替他明鹽酸唑拉西泮(外獸藥證字43號,法國維克有限公司)、便隱血試劑(BA-2020B,珠海貝索生物技術(shù)有限公司)、無水乙醇(64-17-5,成都金山化學試劑有限公司)、蘇木素(420699,賽默飛世爾科技公司)、伊紅(392155,賽默飛世爾科技公司)。

RM2235石蠟切片機(萊卡,德國)、CX22光學顯微鏡(萊卡,日本)、DM1000徠卡顯微成像系統(tǒng)(萊卡,德國)、819切片刀(萊卡,德國)、KD-98-ⅡA恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司,中國)。

1.2 方法

1.2.1 分組和模型建立

將30只小鼠隨機分為對照組、DSS組和TNBS組,每組10只,5只/籠。對照組正常飼喂。DSS組小鼠自由飲用4% DSS藥液,每只小鼠藥液飲用量為0.04 mL/(g·d)。TNBS組小鼠造模前24 h禁食不禁水。舒泰(注射用鹽酸替他明鹽酸唑拉西泮)(0.1 mL/100 g)肌肉注射麻醉小鼠,用8號灌腸針從肛門處插入約3～4 cm,將TNBS/乙醇(5%TNBS:50%乙醇=1∶1)混合液按0.1 mL/20 g體重劑量緩慢注入腸腔內(nèi)。藥液注射完后再注入約0.2 mL空氣,保持倒立1 min后拔出灌腸針。小鼠蘇醒后正常飼喂。造模期7 d。

1.2.2 臨床觀察

造模期間每日定時稱重,觀察精神狀況和糞便性狀,并采用匹拉米洞半定量法測定便隱血。隱血/血便分數(shù)評分標準:加顯色劑后立即呈紫藍色(4分);10 s內(nèi)呈紫藍色(3分);1 min內(nèi)呈紫紅色(2分);1～2 min內(nèi)逐漸產(chǎn)生紫紅色(1 min);判讀時間內(nèi)無顏色反應(0分)。

1.2.3 樣品采集

結(jié)腸內(nèi)容物樣品:造模7 d后,用舒泰麻醉處死小鼠,取出結(jié)腸組織,置冰盒上,縱向剖開結(jié)腸,取結(jié)腸內(nèi)容物放入2 mL無菌防凍管中,液氮速凍后,轉(zhuǎn)移于-80℃冰箱,用于腸道菌群檢測。將同組的每3只小鼠的糞便混合成1個樣,取3個樣進行菌群檢測。

結(jié)腸組織樣品:觀察結(jié)腸的大體病變并拍照記錄,測量結(jié)腸的長度和重量后,將結(jié)腸組織置4%多聚甲醛液中固定24 h以上,用于組織病理診斷。

1.2.4 組織病理學觀察

將固定好的結(jié)腸進行梯度乙醇脫水、透明、浸蠟和包埋,制成5 μm厚的石蠟切片,并進行蘇木精-伊紅(HE)染色,顯微鏡下觀察組織病理損傷情況。

1.2.5 結(jié)腸內(nèi)容物的16S rDNA測序

使用MN NucleoSpin 96 Soi DNA試劑盒提取結(jié)腸內(nèi)容物的細菌總DNA,再用1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢驗DNA的濃度和純度;使用特異性引物(338F-806R)進行PCR擴增;再使用Monarch DNA膠試劑盒回收擴增產(chǎn)物。引物序列為F:5’-ACTCCTACG GGAGGCAGCA-3’;R:5’-GGACTACHVGGGTWTC TAAT-3’。PCR產(chǎn)物經(jīng)定量和文庫構(gòu)建后,利用Illumina HiSeq 2500平臺進行16S rDNA V3+V4測序。

使 用Trimmomatic v0.33、cutadapt 1.9.1、FLASH v1.2.7和UCHIME v4.2軟件分析測序所得Raw Reads,經(jīng)過濾與識別,得到最終有效數(shù)據(jù)(effective reads)。將有效序列聚類為分類單元(OTUs),對OUTs進行物種注釋,在門和屬水平繪制物種分布柱狀圖和聚類樹圖。使用Mothur軟件測算結(jié)腸微生物的Alpha多樣性指數(shù)(包括Ace指數(shù)和Shannon指數(shù)),進行菌群豐度和多樣性評估。用QIIME軟件進行非度量多維標定法(Non-MetricMulti-Dimensional Scaling,NMDS)分析。最后通過LefSe(Line Discriminant Analysis(LDA)Effect Size)分析組間Biomarker的統(tǒng)計學差異。

1.3 統(tǒng)計學分析

用SPSS 26.0軟件分析實驗數(shù)據(jù),用平均值±標準差()表示數(shù)據(jù)結(jié)果,用單因素方差法分析組間差異性。P＜0.05表示差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 臨床觀察、結(jié)腸長度和重量變化結(jié)果

對照組小鼠精神狀況良好,無腹瀉、軟便和便血。DSS組小鼠從造模第3天糞便松軟,隨后軟便現(xiàn)象日趨嚴重,至第7天排稀溏血便;小鼠精神逐漸萎靡、活動能力下降、毛發(fā)失去光澤。TNBS組在造模第1天即有部分小鼠排軟便,至第3天,糞便稀軟不成形,隨后漸趨正常(圖1A)。DSS組從造模后第5天體重逐漸下降,TNBS組從第2天急劇下降,隨后逐漸上升(圖1C)。對照組糞便隱血檢測結(jié)果均呈陰性;DSS組第5天開始糞便隱血分數(shù)顯著升高;TNBS組部分小鼠在造模第1天檢出糞便隱血陽性,第4天達最高,隨后降低(圖1D)。

剖檢觀察:對照組結(jié)腸黏膜層的顏色和厚度正常;DSS組結(jié)腸明顯縮短、腸壁增厚、黏膜層顏色暗沉,局部見深褐色、隆起、點狀或圓形或不規(guī)則形病灶(三角形區(qū)域);TNBS組結(jié)腸顏色變紅,見少量淺灰褐色,略高于黏膜表面的小病灶(紅圈內(nèi),圖1B)。

結(jié)腸重量:DSS組和TNBS組的結(jié)腸重量較對照組顯著增加(P＜0.05),DSS組和TNBS組間無顯著差異(P＞0.05)(圖1E)。結(jié)腸長度:DSS組結(jié)腸長度較對照組和TNBS組顯著變短(P＜0.05),對照組和TNBS組之間無顯著性差異(P＞0.05)(圖1F)。

2.2 小鼠結(jié)腸組織病理診斷結(jié)果

如圖2所示,對照組結(jié)腸的組織結(jié)構(gòu)層次清晰,黏膜層、黏膜下層和肌肉層清晰可見,隱窩和杯狀細胞排列整齊。DSS組結(jié)腸黏膜層形成潰瘍灶,壞死波及黏膜全層致固有結(jié)構(gòu)消失,結(jié)締組織增生,其間見數(shù)量不等的炎癥細胞浸潤(三角形);潰瘍灶附近的隱窩擴張(星號)。TNBS組結(jié)腸黏膜層的隱窩上皮細胞和杯狀細胞增生,局部細胞層次增厚,偶見分支結(jié)構(gòu)形成(箭頭);隱窩間結(jié)締組織增生并伴有數(shù)量不等的炎性細胞浸潤(方框),致隱窩間隙增寬。

注:A:糞便性狀變化;B:剖檢病變;C:體重變化;D:糞隱血分數(shù)變化;E:結(jié)腸重量變化;F:結(jié)腸長度變;與正常組比較,*P＜0.05;與DSS組比較,#P＜0.05。(下圖同)圖1 各實驗組小鼠體重、隱血分數(shù)、結(jié)腸長度和重量比較Note.A.Changes of fecal traits.B.Anatomic appearance.C.Weight change.D.Fecal occult blood fraction changes.E.Changes in colonic weight.F.Changes in colonic length.Compared with the normal group,*P＜0.05.Compared with the DSS group,#P＜0.05.(The same in the following figures)Figure 1 Comparison of body weight,fecal occult blood fraction,colonic length and weight of mice in different experimental groups

圖2 各組小鼠結(jié)腸的組織病理變化Figure 2 Histopathological changes of mice colon in each group

2.3 小鼠腸道菌群測序結(jié)果

2.3.1 結(jié)腸內(nèi)容物測序結(jié)果評估

此次測序共獲得1 185 788對Reads,1 185 631條Clean Reads,每個樣品平均有79 042條Clean Reads。各組樣品的GC含量均在54%左右。

測序量與OTUs的相關(guān)曲線圖3A顯示,測序量達一定數(shù)值后,OUT數(shù)量值穩(wěn)定,樣本曲線趨于平緩,表明此次實驗的測序數(shù)據(jù)量能全面反映樣本中總的OTUs量。用OTU數(shù)量繪制Venn圖3B:三組共有283個OTU,對照組和DSS組分別特有OTU為1個和25個。DSS組(329個)顯著高于對照組(309個)和TNBS組(311個)(P＜0.05)。

2.3.2 結(jié)腸內(nèi)容物的菌群多樣性分析

用Alpha多樣性分析來反映菌群的豐度和多樣性,其中shannon指數(shù)用來估算樣品中微生物的多樣性,shannon指數(shù)越大,菌群多樣性越大。本實驗中各組間的shannon指數(shù)無顯著差異(P＞0.05)。Ace指數(shù)代表菌群豐富度,Ace指數(shù)越大,樣品中菌群的豐富度越高。與TNBS組(293.38)和對照組(294.79)相比,DSS組(314.95)小鼠菌群的Ace指數(shù)最大(P＜0.05)(圖3C)。經(jīng)NMDS分析:各組內(nèi)樣品距離接近,菌群差異較小;反之,菌群差異較大(圖3D)。UPGMA聚類樹圖表明,對照組和TNBS組菌群的親緣關(guān)系更近(圖3E)。

注:A:樣本稀釋曲線;B:OTU分析,數(shù)值代表OTU數(shù)量;C:Ace指數(shù)箱型圖;D:NMDS分析圖,同組樣品使用同種顏色表示;E:聚類樹圖。圖3 結(jié)腸內(nèi)容物的菌群豐度和多樣性變化Note.A.Sample dilution curve.B.The result of OTU analysis,the number represents the number of OTU.C.ACE index box chart.D.NMDS analysis diagram,in which each point represents a sample,and the samples in same group is represented by the same color.E.UPGMA Cluster tree diagram.Figure 3 Changes in abundance and diversity of bacteria in colonic contents

2.3.3 腸道菌群物種注釋和差異性分析

對門水平豐度前10的菌群進行統(tǒng)計,其中擬桿菌門(Bacteroidia)和厚壁菌門(Firmicutes)占比最大(＞75%)。與對照組相比,DSS組擬桿菌門、變形菌門(Proteobacteria)、Patescibacteria、放 線 菌 門(Actinobacteria)和脫鐵桿菌門(Deferribacteres)相對豐富度降低(P＜0.05);厚壁菌門、疣微菌門(Verrucomicrobia)相對豐度增高(P＜0.05)。TNBS組擬桿菌門、變形菌門、Patescibacteria、脫鐵桿菌門和酸桿菌門(Acidobacteria)相對豐度降低(P＜0.05),厚壁菌門、疣微菌門、軟壁菌門(Tenericutes)和藍藻菌門(Cyanobacteria)相對豐度升高(P＜0.05)(見圖4A,4B,4C,4D,4E)。

對屬水平豐度前10的菌群進行統(tǒng)計分析。與對照 組 相 比,DSS組uncultured_bacterium_f_Muribaculaceae、乳桿菌屬(Lactobacillus)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、Alistipes和Candidatus_Saccharimonas相對豐度降低(P＜0.05),uncultured_bacterium_f_Lachnospiraceae、Akkermansia和擬桿菌屬(Bacteroides)相對 豐度 上 升(P＜0.05);TNBS組uncultured_bacterium_f_Muribaculaceae、脫硫弧菌屬、Alistipes、擬桿菌屬和Candidatus_Saccharimonas相對豐度降低(P＜0.05),Lachnospiraceae_NK4A136_group、uncultured_bacterium_f_Lachnospiraceae和Akkermansia相對豐度升高(P＜0.05)(見圖4F,4G,4H,4I,4J)。

通過LefSe分析比較各組間顯著性差異物種,3組共有28個豐度靠前的顯著性差異物種,以LDA值大于3.5為篩選標準,確定各個組中豐度較高的微生物。通過LefSe分析顯示,DSS組顯著性最高的 是Clostridium_sensu_stricto_1、梭 菌 目(Clostridiales)、梭菌科(Clostridiaceae)、uncultured_bacterium_f_Lachnospiraceae和梭菌屬(Clostridia);TNBS組顯著性最高的是Eubacterium__xylanophilum_group(見圖5A,5B)。

注:A:門水平豐度前10的物種豐度柱狀圖;B、C、D、E:各組門水平豐度前10的物種顯著性;F:各組屬水平豐度前10的物種豐度柱狀圖;G、H、I、J:各組屬水平豐度前10存在顯著性差異物種。圖4 各組小鼠菌群組成和差異分析Note.A.Bar chart of the top 10 species in horizontal abundance of each phyla.B,C,D,E.The top 10 species with significant differences in the level abundance of phyla.F.Bar charts of the top 10 species in horizontal abundance of each genus.G,H,I,J.The first 10 species showed significant differences in horizontal abundance among each group.Figure 4 Microflora composition and difference analysis of each group

注:A:LDA值分布柱狀圖;B:進化分支圖。由內(nèi)至外輻射的圓圈代表了由門至種的分類級別;在不同分類級別上的每一個小圓圈代表該水平下的一個分類,小圓圈直徑大小與相對豐度大小呈正比;著色原則為將無顯著差異的物種統(tǒng)一著色為黃色,紅色、綠色和藍色分別代表對照組、DSS組和TNBS組。圖5 LefSe顯著性分析Note.A.Histogram of LDA value distribution.B.Evolutionary branching.The circles radiating from the inside to the outside represent classification levels from phylum to species.Each small circle at different taxonomic levels represents a taxon at that level,and the diameter of the small circle is proportional to the relative abundance.The coloring principle was that the species without significant differences were uniformly colored yellow,red,green and blue represented the control group,DSS model group and TNBS model group,respectively.Figure 5 Significance analysis of LEFSE

3 討論

UC動物模型是研究發(fā)病機制和藥物篩選的重要手段,其中DSS和TNBS誘導的UC模型最為常用。已有研究報道,這兩種模型均表現(xiàn)為腸道粘膜屏障功能降低、腸道免疫功能紊亂并觸發(fā)炎癥反應、腸道菌群失衡、腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)受損,與人體患者的損傷特征相似[8-9]。但很少有文獻資料系統(tǒng)研究兩種模型的差異性。本研究重點關(guān)注DSS和TNBS誘導的UC小鼠模型在臨床癥狀、病理變化特征和腸道菌群構(gòu)成上的差異。

臨床癥狀顯示,DSS組和TNBS組小鼠均表現(xiàn)為稀便、血便和體重波動,但各有自身特征。DSS組從造模第3天,稀便和血便癥狀逐漸加重;TNBS組造模當天血便,第3天時稀便和血便最嚴重,隨后逐漸恢復。本實驗DSS組臨床癥狀與已有研究較一致,僅糞便性狀改變的時間存在差異,原因可能與不同的藥液濃度、實驗動物種屬、造模周期等因素有關(guān)[10]。也有研究報道TNBS小鼠血便癥狀先加重再恢復[11-12]。兩種模型病程進展的差異性與成模機制密切相關(guān)。DSS不直接腐蝕腸壁,而是緩慢漸進性損傷腸上皮細胞,致細菌、腸內(nèi)抗原等促炎物質(zhì)進入黏膜層而引發(fā)炎癥[13];TNBS造模時,乙醇灼傷腸黏膜后,TNBS與組織內(nèi)賴氨酸的ε基團結(jié)合形成完全抗原,引起免疫應答性炎癥反應[14]。

剖檢顯示,兩種模型的結(jié)腸均表現(xiàn)為重量增加和潰瘍灶形成。病理組織變化的共同特征為結(jié)腸黏膜上皮細胞和杯狀細胞壞死、結(jié)締組織增生和炎性細胞浸潤。不同之處有二:一是結(jié)腸潰瘍灶結(jié)構(gòu)不同,DSS組潰瘍灶部位固有層消失,而TNBS組潰瘍灶內(nèi)殘留隱窩結(jié)構(gòu);二是隱窩病變特征不同,DSS組隱窩擴張更明顯,胞核成分減少,而TNBS組隱窩壁上的細胞核成分致密。已有研究顯示,DSS模型[15-16]和TNBS模型[17-18]的病理損傷特征相似,包括結(jié)腸縮短、黏膜層結(jié)構(gòu)受損、炎性水腫和炎性浸潤。對人UC的研究顯示,結(jié)腸的組織病理變化包括上皮損傷、隱窩擴張、細胞增生和炎癥反應[8]。本實驗中TNBS組發(fā)生明顯的隱窩細胞增生,與人UC的病變特征更接近,提示TNBS模型可能更適用于人UC的發(fā)病機理和藥物篩選研究。

門水平豐度的菌群測序結(jié)果顯示兩種模型的相同之處是:DSS組和TNBS組擬桿菌門、變形菌門、Patescibacteria和脫鐵桿菌門的相對豐度都降低,厚壁菌門和疣微菌門的相對豐度均升高;不同之處是:軟壁菌門和藍藻菌門的豐度在TNBS組增加而在DSS組無顯著性變化;放線菌門豐度僅在DSS組顯著降低,酸桿菌門豐度僅在TNBS組顯著降低。屬水平豐度的測序結(jié)果顯示,DSS組和TNBS組uncultured_bacterium_f_Muribaculaceae、脫硫弧菌屬、Alistipes和Candidatus_Saccharimonas的相對豐度降低,uncultured_bacterium_f_Lachnospiraceae和Akkermansia的相對豐度升高;區(qū)別在于乳桿菌屬僅在DSS組豐度降低,擬桿菌屬在DSS組豐度上升而在TNBS組顯著下降。結(jié)果表明,兩種UC模型的腸道菌群在門水平和屬水平上均與對照組顯著不同,發(fā)生了明顯的菌群結(jié)構(gòu)紊亂。已有研究表明,UC患者或UC模型動物不同門和屬細菌的相對豐度改變,均反映出腸道菌群結(jié)構(gòu)紊亂[19-22]。腸道菌群是腸道微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分,參與營養(yǎng)和能量供應、保護腸道粘膜屏障、調(diào)節(jié)宿主免疫[3,23-24]。本實驗中,腸道菌群結(jié)構(gòu)紊亂可能加重結(jié)腸的組織病理損傷和功能紊亂。在DSS和TNBS模型中菌群變化,會對結(jié)腸上皮屏障和免疫功能產(chǎn)生特定的干擾作用。因此本實驗進一步分析了3種常見菌群變化對UC潛在的損傷機制。

在屬水平上,與對照組相比,疣微菌門中的Akkermansia的相對豐度在兩個模型組中都異常升高,其中DSS組最高。部分研究認為,Akkermansia相對豐度與結(jié)腸炎小鼠的組織病理損傷和炎癥呈正相關(guān)[25-26]。也有研究觀察到它的豐度與腸道炎癥呈負相關(guān),原因是Akkermansia中的艾克曼菌在人體腸道中定植,有維持腸道菌群、保護腸粘膜、減輕腸道炎癥和調(diào)節(jié)糖脂代等作用[27-29]。因此,艾克曼菌異常增多對機體是否有益存在爭議,還需進一步探究。

擬桿菌屬是與炎癥性腸病高度有關(guān)的微生物群[30]。與對照組比較,DSS組擬桿菌屬相對豐度顯著升高;TNBS組相對豐度降低,與已有研究結(jié)果一致[31-32]。擬桿菌是一種中性菌,若發(fā)生不穩(wěn)定增殖則為致病菌,呂志堂等[33]發(fā)現(xiàn)擬桿菌屬中的脆弱擬桿菌與結(jié)直腸癌和炎癥性腸病密切相關(guān)。脆弱擬桿菌分為產(chǎn)腸毒素脆弱擬桿菌(enterotoxigenicBacterodies friagilis,ETBF)和非產(chǎn)腸毒素脆弱擬桿菌(nontoxigenicBacterodies friagilis,NTBF)[34-35]。有研究發(fā)現(xiàn)[36-37]結(jié)直腸癌患者腸道中的ETBF數(shù)量明顯升高,其可能的致癌機制包括干擾粘膜免疫反應、誘導上皮細胞變化等[38];而NTBF通過產(chǎn)生胞外多糖保護結(jié)腸黏膜免受致炎因子侵害[39],抑制結(jié)腸炎和結(jié)直腸癌的發(fā)展[40]。本實驗DSS組中擬桿菌屬的豐度升高是否與致病性ETBF增多有關(guān),TNBS組中擬桿菌屬豐度降低是否與NTBF減少有關(guān),尚需進一步研究。

與對照組相比,DSS組中乳桿菌屬豐度顯著降低,TNBS組無差異。乳桿菌屬中乳酸菌是厚壁菌門中的有益菌,具有抗致病菌、增強上皮屏障、調(diào)節(jié)免疫等作用,主要通過分泌短鏈脂肪酸阻止致病菌入侵和增殖,恢復腸道菌群平衡,減少腸道炎癥的產(chǎn)生[41-42]。因此,本實驗中,乳酸菌減少與DSS組小鼠的結(jié)腸上皮損傷和炎癥反應的活躍密切相關(guān)。

綜上所述,DSS和TNBS建立的UC小鼠模型在臨床癥狀、結(jié)腸組織病理損傷和腸道菌群組成上均有異同,實驗結(jié)果不僅為UC發(fā)病機理的研究提供理論依據(jù),也可為篩選UC治療藥物及藥效研究時選擇不同動物模型提供參考。