復(fù)方地黃顆粒對帕金森病模型大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞激活及神經(jīng)行為的干預(yù)研究

畢殿勇,王利,何竹青,楊玉芳,何建成

(上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,上海 201203)

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)屬中老年常見慢性、神經(jīng)退行性疾病,其主要病理特征為黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性丟失、大腦皮層神經(jīng)元內(nèi)α-突觸核蛋白(α-synuclein,α-syn)聚集及路易小體(lewy bodies,LBs)形成,伴有黑質(zhì)致密部酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)陽性神經(jīng)元及神經(jīng)纖維大量丟失[1-2]。

PD病因及發(fā)病機(jī)理尚不十分明確。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙及小膠質(zhì)細(xì)胞過度激活所致的黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)游離型鐵離子過度沉積與PD發(fā)病密切相關(guān)[3-4]。本課題組長期臨床實(shí)踐證實(shí),復(fù)方地黃顆粒在改善PD患者的抑郁、焦慮、睡眠障礙及開-關(guān)現(xiàn)象等方面療效確切[5-6]。前期研究表明,復(fù)方地黃顆?？赏ㄟ^抑制糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)基 因、蛋 白 表 達(dá),促 進(jìn)p-GSK-3β(phospho S9)蛋白表達(dá)等作用抑制因α-syn錯(cuò)誤聚集所致的黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元凋亡[7]。有研究證實(shí),模型小鼠黑質(zhì)致密部小膠質(zhì)細(xì)胞可被脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)大量激活,其激活標(biāo)志物離子化鈣結(jié)合適配分子1(ionized calcium binding adapter molecule 1,Iba1)及相關(guān)炎癥因子IL-1β、TNF-α表達(dá)水平顯著升高[8-9]。本研究分別制備LPS和6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ痛笫?探討復(fù)方地黃顆粒對兩種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ痛笫蠛谫|(zhì)紋狀體小膠質(zhì)細(xì)胞激活及神經(jīng)行為學(xué)的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

100只8周齡雄性SPF級SD大鼠,體重(180±20)g,購自上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心【SCXK(滬)2018-0006】。以上動物均飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心實(shí)驗(yàn)室【SYXK(滬)2018-0008】。本實(shí)驗(yàn)研究已通過上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理審查委員會批準(zhǔn)(PZSHUTCM200911001)。飼養(yǎng)條件:濕度60%～65%,溫度23～25℃,自動光-暗控制(LD12:12,即7:00～19:00),自由采食、飲水。實(shí)驗(yàn)操作地點(diǎn):上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.1.2 藥物

復(fù)方地黃顆粒由熟地黃、丹參、鉤藤、石菖蒲、全蝎、杭白芍、珍珠母7味藥物組方,委托國家中藥工程技術(shù)研究中心制作,按照既定的工藝流程制備浸膏粉,置于陰冷通風(fēng)處,藥物避光包裝。動物給藥劑量折算標(biāo)準(zhǔn)參照孫瑞元《定量藥理學(xué)》所述計(jì)算每只大鼠每日用藥劑量,即每只標(biāo)準(zhǔn)體重大鼠每日灌胃劑量公式DB=DA×KB/KA。DA為標(biāo)準(zhǔn)體重常人用藥劑量,KB為大鼠劑量折算系數(shù)(7),KA為標(biāo)準(zhǔn)體重成人劑量折算系數(shù)(388),即大鼠每日灌胃藥量DB=DA×7/388。

1.1.3 主要試劑與儀器

大鼠腦立體定位儀(型號SN-3N,成茂公司,日本);10 μL微量上樣器(上海高鴿);微型顱骨鉆(上海奧爾科特生物科技有限公司);多功能酶標(biāo)儀(型號DENLEY DRAGON Wellscan MK3,Thermo公司,美國);Western Blot電泳儀(型號043BR41664,Bio-Rad公司,美國)。

ELISA試劑盒IL-1β(Lot:JL20884,上海將來實(shí)業(yè)股份有限公司);ELISA試劑盒IL-10(Lot:ER0135,上海威奧生物科技有限公司);ELISA試劑盒TNF-α(Lot:JL13202,上海將來實(shí)業(yè)股份有限公司);NF-κ Bp65 antibody Rabit(Lot:D14E12,CST公司,美國);phospho-NF-κ Bp65 antibody Rabit(Lot:GR3204852-19,Abcam公司,英國);酪氨酸羥化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)antibody Rabit(Lot:58844S,CST公司,美國);GAPDH Antibody(Lot:10011065,Proteintech公司);β-actin antibody(Lot:#0078629,Proteintech公司);辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(Lot:D110058-0100,上海生工);辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)(Lot:D110087-0100,上海生工);離子鈣接頭蛋白抗體1(ionized calcium binding adapter molecule antibody 1 Rabit,Iba1 antibody Rabit)(Lot:PTE0556,WAKQ公司,日本);BCA Reagent A(Lot:#A4801 A,碧云天公司);BCA Reagent B(Lot:#A1101B,碧云天公司);SDS-PAGE凝膠配備試劑盒(Lot:#102919191106,碧云天公司);PVDF Transfer Membranes(0.22 μmol/L&0.45 μmol/L,Immobilon-p Millipore,Bedford,MA,美國);ECL化學(xué)發(fā)光液(Lot:#1907702,Immobilon-p Millipore,Bedford,MA,美國);戊巴比妥鈉(Lot:WS20130112,上海中西藥業(yè)股份有限公司);6-羥基多巴胺(6-OHDA)(Lot:#MKCD0817,Sigma公 司,美 國);LPS(Lot:#068M4067 V,Sigma公司,美國);阿撲嗎啡(APO)(Lot:WKQ4315,WKQ公 司,日 本);抗 壞 血 酸(Vitamin C)(Lot:#311403,Selleck公司,美國)。

1.2 方法

所有實(shí)驗(yàn)大鼠術(shù)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,取無自發(fā)旋轉(zhuǎn)行為的健康大鼠納入研究范圍。

1.2.1 LPS模型大鼠構(gòu)建

采用黑質(zhì)兩點(diǎn)立體定位術(shù)將LPS(體積為每只2 μL,濃度為2.5 μg/μL,生理鹽水配制,現(xiàn)配現(xiàn)用)注射于右側(cè)黑質(zhì)致密部制備LPS大鼠模型。

1.2.2 6-OHDA模型大鼠構(gòu)建

采用黑質(zhì)兩點(diǎn)立體定位術(shù)將3 μL 6-OHDA溶液(濃度為2 μg/μL,0.2%的Vitamin C現(xiàn)配)注射于右側(cè)黑質(zhì)致密部,制備6-OHDA大鼠模型。

1.2.3 手術(shù)步驟

大鼠麻醉(1%戊巴比妥鈉,40 mg/kg,腹腔注射),頭部去毛備皮。將其頭部牢固固定于腦立體定位儀,使顱骨前后位于同一水平面,碘伏常規(guī)消毒術(shù)野皮膚。切開皮膚,暴露前囟至兩耳之間位置,仔細(xì)止血,剝離骨膜。

參照包新民主編《腦立體定位圖譜》尋找、標(biāo)記前囟中線位置。標(biāo)記右側(cè)黑質(zhì)注射位點(diǎn):(1)第一點(diǎn)坐標(biāo)在前囟后5.2 mm,顱頂中線右側(cè)1 mm,硬膜下9 mm;(2)第二點(diǎn)坐標(biāo)在前囟后5.2 mm,顱頂中線右側(cè)1.2 mm,硬膜下8.5 mm。

用顱骨鉆輕輕鉆透顱骨直至硬腦膜,微量上樣器吸取適量造模藥物,將其垂直固定于腦立體定位儀,緩慢勻速進(jìn)針。當(dāng)針頭到達(dá)預(yù)定位置后以1 μL/min的速度勻速推注藥物,注射完畢留針5 min,緩慢退針。假手術(shù)組大鼠按體重標(biāo)準(zhǔn)注射同體積生理鹽水,術(shù)畢消毒并縫合皮膚切口,將大鼠放回籠具。

1.2.4 分組及藥物干預(yù)

術(shù)后第2周,腹腔注射APO(0.5 mg/kg,0.1 mL/100 g)誘導(dǎo)、記錄大鼠自發(fā)旋轉(zhuǎn)行為,將旋轉(zhuǎn)圈數(shù)大于每分鐘7圈者視為為模型成功標(biāo)志。

(1)LPS實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛣游锓纸M:隨機(jī)數(shù)字表法將LPS實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ痛笫蠓譃?組:LPS模型組(簡稱LPS組),復(fù)方地黃顆粒干預(yù)組(簡稱DH+LPS組)。另納入假手術(shù)組(簡稱sham組),每組大鼠8只。

(2)6-OHDA實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛣游锓纸M:隨機(jī)數(shù)字表法將6-OHDA實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ痛笫蠓譃?組:6-OHDA模型組(簡稱6-OHDA組)、復(fù)方地黃顆粒干預(yù)組(簡稱DH+6-OHDA組),另納入假手術(shù)組(sham組),每組大鼠8只。

(3)藥物干預(yù):假手術(shù)組、LPS、6-OHDA組模型大鼠用等量體積生理鹽水灌胃,其余各組大鼠以復(fù)方地黃顆粒灌胃(濃度1 g/mL,劑量7 g/kg),每日1次,共計(jì)6周。

1.2.5 神經(jīng)行為學(xué)檢測及取材

分別于造模成功時(shí)(簡稱0周)和灌胃干預(yù)的第2、4、6周觀察、記錄APO誘導(dǎo)的大鼠自發(fā)旋轉(zhuǎn)行為。取材前24 h大鼠禁食,不禁水,1%戊巴比妥鈉麻醉并脫臼處死大鼠,在冰上迅速斷頭取腦,分離其黑質(zhì)-紋狀體,液氮保存,迅速移至-80℃冰箱。

1.2.6 ELISA法檢測大鼠黑質(zhì)紋狀體組織勻漿液TNF-α、IL-1β、IL-10的含量表達(dá)

組織勻漿液制備:取100 mg黑質(zhì)紋狀體組織加入1 mL生理鹽水內(nèi),低溫超聲震蕩,4℃條件下以低溫高速離心機(jī)(12 000 r/min)離心,取其上清液-80℃冰箱保存。ELISA具體實(shí)驗(yàn)操作步驟參照生產(chǎn)商說明書。

1.2.7 Western Blot技術(shù)檢測各組大鼠黑質(zhì)紋狀體TH、NF-κ Bp65、p-NF-κ Bp65、Iba1的蛋白表達(dá)水平

RIPA法提取黑質(zhì)紋狀體組織蛋白,BCA法蛋白定量。根據(jù)分子量不同配置8%及10%的SDSPAGE凝膠。電泳、蛋白轉(zhuǎn)膜及抗體孵育:電泳,80 V 30 min,110 V 90 min;轉(zhuǎn)膜,200 mA,1 h;5% BSA封閉,室溫,搖床2 h;一抗孵育:GAPDH Antibody(1∶1000);NF-κ Bp65 Antibody溶液配制(1∶1000);p-NF-κ Bp65 Antibody溶 液 配 制(1∶1000);tyrosine hydroxylase Antibody(1∶1000);ionized calcium bindingadaptor molecule-1 Antibody(1∶500);β-actin Antibody(1∶2000);抗體孵育:4℃搖床過夜,1×TBST洗滌3次,每次5 min;二抗孵育:HRP*Goat anti-Rabbit IgG(H+L)溶液配制(1∶5000):HRP*Goat anti-Mouse IgG(H+L)(1∶5000);室溫,搖床2 h,1×TBST洗滌3次,每次5 min。

使用ECL化學(xué)發(fā)光劑于暗室內(nèi)曝光顯影,Imagej圖像分析軟件分析目的蛋白條帶灰度值,取樣本組織蛋白灰度值與GAPDH、β-actin灰度值比值作對比,求得樣本組織蛋白相對含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

GraphPad Prism 8軟件處理所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),所有數(shù)據(jù)服均從正態(tài)分布,計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。多組間實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA),組間兩兩比較采用LSD/Dunett/SNK法,統(tǒng)計(jì)結(jié)果以P值表示,P＜0.05表示組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P＜0.01表示組間存在顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)行為學(xué)

2.1.1 復(fù)方地黃顆粒對LPS模型大鼠神經(jīng)行為學(xué)的影響

由圖1可見,與sham組比較,LPS模型大鼠造模后成功后(圖1所示0周)出現(xiàn)APO誘導(dǎo)的首尾銜接自發(fā)旋轉(zhuǎn)行為,組間有顯著性差異(P＜0.001);與LPS組比較,DH+LPS組大鼠在2、4、6周時(shí)的自發(fā)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)明顯減少,組間有顯著性差異(P＜0.001)。

注:與 假 手 術(shù) 組 比 較,ΔP＜0.001;與LPS模 型 組 比較,#P＜0.001。圖1 復(fù)方地黃顆粒對脂多糖模型大鼠神經(jīng)行為學(xué)的影響Note.Compared with sham group,ΔP＜0.001.Compared with LPS model group,#P＜0.001.Figure 1 Effect of compound Rehmannia granules on neurobehavior of lipopolysaccharide model rats

2.1.2 復(fù)方地黃顆粒對6-OHDA模型大鼠神經(jīng)行為學(xué)的影響

由圖2可見,與sham組比較,6-OHDA模型大鼠造模成功后(圖2所示0周)出現(xiàn)APO誘導(dǎo)的首尾銜接自發(fā)旋轉(zhuǎn)行為,組間有顯著性差異(P＜0.001);與6-OHDA組比較,DH+6-OHDA組在2、4、6周時(shí)的自發(fā)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)明顯減少,組間有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.001)。

注:與 假 手 術(shù) 組 相 比,ΔP＜0.001;與6-OHDA模 型 組 相比,▲P＜0.05,#P＜0.001。圖2 復(fù)方地黃顆粒對6-羥基多巴胺模型大鼠神經(jīng)行為學(xué)的影響Note.Compared with sham group,ΔP＜0.001.Compared with 6-OHDA model group,▲P＜0.05,#P＜0.001.Figure 2 Effect of compound Rehmannia granules on neurobehavior of 6-hydroxydopamine model rats

2.2 復(fù)方地黃顆粒對各組大鼠黑質(zhì)紋狀體炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-10含量表達(dá)的影響

2.2.1 復(fù)方地黃顆粒對LPS模型大鼠黑質(zhì)紋狀體炎癥因子含量表達(dá)的影響

由表1可見,與sham組比較,LPS組IL-1β、TNF-α表達(dá)水平顯著升高,IL-10表達(dá)水平顯著降低,組間有顯著性差異(P＜0.001);與LPS組比較,DH+LPS組IL-1β、TNF-α表達(dá)水平顯著降低,IL-10的表達(dá)水平顯著升高,組間有顯著性差異(P＜0.01或P＜0.001)。

表1 復(fù)方地黃顆粒對LPS模型大鼠黑質(zhì)紋狀體炎癥因子含量表達(dá)的影響(,n=8)Table 1 Effect of compound Rehmannia granule on expression of inflammatory factors in substantia nigra and striatum of LPS model rats(,n=8)

表1 復(fù)方地黃顆粒對LPS模型大鼠黑質(zhì)紋狀體炎癥因子含量表達(dá)的影響(,n=8)Table 1 Effect of compound Rehmannia granule on expression of inflammatory factors in substantia nigra and striatum of LPS model rats(,n=8)

注:與假手術(shù)組相比,ΔP＜0.001;與LPS模型組相比,▲P＜0.01,▲▲P＜0.001。(下表同)Note.Compared with sham group,ΔP＜0.001.Compared with LPS model group,▲P＜0.01,▲▲P＜0.001.(The same in the following tables)

組別Groups IL-1β(pg/mL) TNF-α(pg/mL) IL-10(pg/mL)假手術(shù)組Sham group 177.48±7.38 845.58±7.12 467.33±6.57脂多糖模型組LPS model group 212.06±4.58Δ 893.34±5.02Δ 374.31±9.17Δ復(fù)方地黃顆粒+脂多糖組DH+LPS group 197.79±10.11▲ 858.02±8.80▲▲ 453.87±13.45▲▲

2.2.2 復(fù)方地黃顆粒對6-OHDA模型大鼠黑質(zhì)紋狀體炎癥因子含量表達(dá)的影響

由表2可見,與sham組比較,6-OHDA組IL-1β、TNF-α表達(dá)量顯著升高,IL-10表達(dá)水平顯著降低,組間有顯著性差異(P＜0.001);與6-OHDA組比,DH+6-OHDA組IL-1β、TNF-α顯著降低,IL-10表達(dá)水平顯著升高,組間有顯著性差異(P＜0.001)。

表2 復(fù)方地黃顆粒對6-OHDA模型大鼠黑質(zhì)紋狀體炎癥因子含量表達(dá)的影響(n=8)Table 2 Effect of compound Rehmannia granule on the expression of inflammatory factors in substantia nigra and striatum of 6-OHDA model rats(,n=8)

表2 復(fù)方地黃顆粒對6-OHDA模型大鼠黑質(zhì)紋狀體炎癥因子含量表達(dá)的影響(n=8)Table 2 Effect of compound Rehmannia granule on the expression of inflammatory factors in substantia nigra and striatum of 6-OHDA model rats(,n=8)

組別Groups IL-1β(pg/mL) TNF-α(pg/mL) IL-10(pg/mL)假手術(shù)組Sham group 187.80±7.74 793.40±11.62 438.32±13.56 6-羥基多巴胺模型組6-OHDA model group 223.21±8.62Δ 981.80±6.33Δ 375.94±10.76Δ復(fù)方地黃顆粒+6-羥基多巴胺組DH+6-OHDA group 203.02±1.55▲▲ 862.35±12.74▲▲ 403.13±7.78▲▲

2.3 復(fù)方地黃顆粒對模型大鼠黑質(zhì)紋狀NF-κ Bp65、p-NF-κ Bp65蛋白表達(dá)的影響

由表3、圖3見,與sham組比較,6-OHDA組及LPS組大鼠NF-κ Bp65、p-NF-κ Bp65表達(dá)水平顯著升高,組間有顯著性差異(P＜0.05,P＜0.001);與6-OHDA組及LPS組相比較,DH+6-OHDA及DH+LPS組NF-κ Bp65、p-NF-κ Bp65表達(dá)水平顯著降低,組間有顯著性差異(P＜0.05,P＜0.001)。

圖3 復(fù)方地黃顆粒對模型大鼠黑質(zhì)紋狀體NF-κ Bp65和p-NF-κ Bp65蛋白表達(dá)的影響Figure 3 Effect of compound Rehmannia granule on NF-κ Bp65 and p-NF-κ Bp65 protein expression in substantia nigra and striatum of model rats

表3 復(fù)方地黃顆粒大鼠黑質(zhì)紋狀體NF-κ Bp65、p-NF-κ Bp65蛋白表達(dá)的影響(,n=8)Table 3 Effect of compound Rehmannia granule on NF-κ Bp65 and p-NF-κ Bp65 protein expression in substantia nigra and striatum of model rats(,n=8)

表3 復(fù)方地黃顆粒大鼠黑質(zhì)紋狀體NF-κ Bp65、p-NF-κ Bp65蛋白表達(dá)的影響(,n=8)Table 3 Effect of compound Rehmannia granule on NF-κ Bp65 and p-NF-κ Bp65 protein expression in substantia nigra and striatum of model rats(,n=8)

注:與假手術(shù)組比較,▲P＜0.05,▲▲P＜0.001;與LPS模型組比較,ΔΔP＜0.001;與6-OHDA模型組比較,■P＜0.05,■■P＜0.001。(下表同)Note.Compared with sham group,▲P＜0.05,▲▲P＜0.001.Compared with LPS model group,ΔΔP＜0.001.Compared with 6-OHDA model group,■P＜0.05,■■P＜0.001.(The same in the following tables)

組別Groups NF-κ Bp65 p-NF-κ Bp65假手術(shù)組Sham group 0.53±0.16 0.29±0.11 6-羥基多巴胺模型組6-OHDA model group 1.44±0.15▲▲ 0.54±0.04▲復(fù)方地黃顆粒+6-羥基多巴胺組DH+6-OHDA group 0.64±0.13■■ 0.30±0.10■脂多糖模型組LPS model group 1.21±0.14▲▲ 0.74±0.25▲▲復(fù)方地黃顆粒+脂多糖組DH+LPS group 0.69±0.13ΔΔ 0.28±0.02ΔΔ

2.4 復(fù)方地黃顆粒對模型大鼠黑質(zhì)紋狀體TH、Iba1蛋白表達(dá)的影響

由表4、圖4可見,與sham組比較,LPS組及6-OHDA組Iba1表達(dá)水平顯著升高,TH表達(dá)水平顯著降低,組間有顯著性差異(P＜0.05,P＜0.001);與6-OHDA組及LPS組相比較,DH+6-OHDA組及DH+LPS組Iba1表達(dá)水平顯著降低,TH表達(dá)水平顯著升高,組間有顯著性差異(P＜0.05,P＜0.001)。

圖4 復(fù)方地黃顆粒對模型大鼠黑質(zhì)紋狀體Iba1和TH蛋白表達(dá)的影響Figure 4 Effect of compound Rehmanniagranule on Iba1 and TH protein expression in substantia nigra and striatum of model rats

表4 復(fù)方地黃顆粒對模型大鼠黑質(zhì)紋狀體TH、Iba1蛋白表達(dá)的影響(,n=8)Table 4 Effect of compound Rehmannia granule on TH and Iba1 protein expression in substantia nigra and striatum of model rats(n=8)

表4 復(fù)方地黃顆粒對模型大鼠黑質(zhì)紋狀體TH、Iba1蛋白表達(dá)的影響(,n=8)Table 4 Effect of compound Rehmannia granule on TH and Iba1 protein expression in substantia nigra and striatum of model rats(n=8)

組別Groups Iba1 TH假手術(shù)組Sham group 0.64±0.09 0.85±0.06 6-羥基多巴胺模型組6-OHDA model group 0.96±0.10▲ 0.50±0.06▲▲復(fù)方地黃顆粒+6-羥基多巴胺組DH+6-OHDA group 0.42±0.28■■ 0.64±0.05■脂多糖模型組LPS model group 0.86±0.06▲▲ 0.61±0.08▲▲復(fù)方地黃顆粒+脂多糖組DH+LPS group 0.49±0.07ΔΔ 0.89±0.13ΔΔ

3 討論

PD屬中醫(yī)學(xué)“顫振”“振掉”范疇?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明[10-12],PD發(fā)病是衰老、基因突變、環(huán)境神經(jīng)毒素(重金屬及殺蟲劑)及腦外傷等多重因素共同作用的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)研究表明,復(fù)方地黃顆?？赏ㄟ^抑制氧化應(yīng)激、調(diào)控黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元凋亡等機(jī)制發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[13-14],但復(fù)方地黃顆粒的神經(jīng)保護(hù)作用是否與抗炎作用相關(guān)尚待進(jìn)一步研究證實(shí)。

小膠質(zhì)細(xì)胞屬中樞神經(jīng)系統(tǒng)固有免疫監(jiān)視細(xì)胞,參與神經(jīng)元的發(fā)育及神經(jīng)突觸的重塑等多種病理、生理過程[15]。有研究表明,過度激活的小膠質(zhì)細(xì)胞可釋放多種致炎因子或細(xì)胞毒性因子導(dǎo)致神經(jīng)元損傷,誘發(fā)或加速PD、阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)等神經(jīng)退行性疾病的病變進(jìn)程[16]。

LPS為革蘭氏陰性菌胞壁的主要成分,廣泛應(yīng)用于炎癥相關(guān)PD動物模型的制備[17]。LPS用于制備PD模型動物多采用腹腔注射方式,其不足之處為不能通過血腦屏障,且外周給藥其刺激作用持續(xù)時(shí)間較短,故不宜于長期實(shí)驗(yàn)動物模型的研究。本研究采用黑質(zhì)立體定位注射術(shù)將LPS直接注射于中腦黑質(zhì)部,藥物直接透過血腦屏障被注入黑質(zhì)致密部。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,該造模方法具有造模成功率高、癥狀持續(xù)較為持久的特征。

6-OHDA為兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺的羥基化衍生物,采用腦立體定位注射術(shù)可透過血腦屏障直接將其注射于中腦黑質(zhì)區(qū),在多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(dopamine transporter,DAT)作用下進(jìn)入多巴胺能神經(jīng)元,在神經(jīng)元內(nèi)被氧化產(chǎn)生過氧化氫、羥自由基等神經(jīng)毒性物質(zhì),誘導(dǎo)氧化應(yīng)激及線粒體功能障礙,加速黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元變性、丟失[18],該造模方法多用于長期慢性PD實(shí)驗(yàn)動物模型的研究。本研究采用LPS、6-OHDA動物模型為研究對象,深入探討復(fù)方地黃顆粒對模型大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞激活、炎癥因子表達(dá)及神經(jīng)行為學(xué)的干預(yù)作用。

NF-κ B信號通路由NF-κ B1(p50)、NF-κ B(p52)、RelA(p65)、Rel B和Rel(c-Re1)5種家族成員構(gòu)成[19]。生理狀態(tài)下,該蛋白家族成員以異二聚體的形式(以p65/p50異二聚體為主)與其抑制因子Iκ B(inhibitors of NF-κB)結(jié)合呈穩(wěn)態(tài)形式存在于胞漿中。病理狀態(tài)下,激活的NF-κ B信號通路通過正負(fù)反饋機(jī)制參與機(jī)體免疫炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖及凋亡等病理生理過程[20]。Muhammad等[21]研究表明,LPS預(yù)處理的C57BL/6小鼠海馬區(qū)細(xì)胞及BV2模型細(xì)胞其激活標(biāo)志物Iba1及p-NF-κ B及IL-1β等炎性因子表達(dá)水平顯著升高,故抑制小膠質(zhì)細(xì)胞NF-κ B信號通路激活及促炎因子過度表達(dá)將有助于PD的臨床治療。

復(fù)方地黃顆粒由熟地黃、丹參、鉤藤、石菖蒲、全蝎、杭白芍、珍珠母7味藥物組成。熟地黃味甘微溫,入肝、腎經(jīng),長于滋陰養(yǎng)血、補(bǔ)腎填精?！堕L沙藥解》曰其可“涼肝滋血,清風(fēng)潤木,……滋風(fēng)木……,血脫甚良”。丹參味苦,微寒,歸心、肝經(jīng),長于活血祛瘀,通絡(luò)止痛。全蝎,味辛性平,入肝經(jīng),長于息風(fēng)通絡(luò),解毒散結(jié),鎮(zhèn)驚止痛?！夺t(yī)宗必讀卷十·痹》曰:“治風(fēng)先治血,血行風(fēng)自滅”,臨床實(shí)踐證實(shí),丹參、全蝎合用共奏活血通絡(luò)、養(yǎng)血息風(fēng)之效,二藥合用則息風(fēng)之力倍增[22]。石菖蒲味辛苦,性溫,歸心、胃經(jīng),長于化濕開胃、豁痰開竅、醒神益智?！侗静輦湟吩黄淇芍鳌把a(bǔ)肝益心,去濕逐風(fēng),……,風(fēng)痹驚癇?！敝T疾。鉤藤甘苦,微寒,歸肝、心包經(jīng),長于清熱平肝,息風(fēng)定驚。白芍味苦,性平,歸肝、脾經(jīng),長于補(bǔ)血調(diào)經(jīng)藥,《神農(nóng)本草經(jīng)》曰:“主邪氣腹痛,除血痹,……,利小便,益氣”。鉤藤、合用白芍共奏養(yǎng)血柔肝、息風(fēng)止顫之功。珍珠母,咸、寒,歸心,肝經(jīng),長于平肝潛陽,息風(fēng)定驚。臨床實(shí)踐表明,復(fù)方地黃顆粒功效以補(bǔ)益肝腎,祛瘀通絡(luò)、息風(fēng)見長,該方對PD患者失眠、抑郁及便秘等非運(yùn)動癥狀有顯著改善。

現(xiàn)代藥理研究證實(shí),熟地黃含有毛蕊花糖苷、玉葉金花苷酸、海膽苷等13種抗氧化活性成分[23]。周艷等[24]等研究表明,熟地黃多糖可提高亞急性衰老模型大鼠血肝、腦、腎臟器指數(shù),降低肝、腦、腎組織丙二醛(MDA)含量表達(dá)。劉培建等[25]研究表明,中、高劑量熟地黃多糖能夠促進(jìn)氣血虧虛模型小鼠血清粒-巨噬細(xì)胞集落集落刺激因子含量,提升小鼠紅細(xì)胞及血紅蛋白表達(dá)水平。全蝎含有蝎毒、多糖、氨基酸及三甲胺、甜菜堿等活性成分,相關(guān)研究表明,全蝎對腫瘤、心腦血管疾病等臨床各科疾病療效顯著[26]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明,丹參所含丹參酮、丹參酚酸等主要成分可通過多靶點(diǎn)、多途徑顯著改善微循環(huán)功能障礙,調(diào)節(jié)由抗動脈粥樣硬化所致的心腦血管功能障礙,保護(hù)器官免受炎癥損[27-28]?，F(xiàn)代藥理研究表明,石菖蒲含α-細(xì)辛醚(α-Asarone)、β-細(xì) 辛 醚(β-Asarone)、丁 香 烯(caryophyllene)等藥理活性揮發(fā)油,通過抗炎、調(diào)節(jié)免疫等藥理作用對中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能發(fā)揮正、負(fù)雙向調(diào)節(jié)作用,調(diào)節(jié)血腦屏障通透功能,抑制大腦神經(jīng)元凋亡[29-30]?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí),鉤藤含黃酮、萜類、皂苷異、去氫鉤藤堿(isocorynoxeine)等藥理成分,具有抗炎、降壓、神經(jīng)保護(hù)及平喘等功效[31]。白芍含沒食子酸、兒茶素、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷等藥理活性成分,現(xiàn)代藥理研究證實(shí),白芍具有抗炎、抗氧化、養(yǎng)血保肝及神經(jīng)保護(hù)等功效[32]。王成龍[33]研究證實(shí),芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷通過調(diào)控腦組織cAMP/PKA信號通路環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)、蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)含量發(fā)揮養(yǎng)血柔肝作用。珍珠母含大量碳酸鈣、碳酸鎂及絲氨酸等有機(jī)或無機(jī)成分,現(xiàn)代研究表明,其功效以鎮(zhèn)靜、抗炎、抗氧化應(yīng)激等為主[34]。臨床研究表明,珍珠母對心腦血管、胃腸消化系統(tǒng)及精神類疾病均顯示出較佳的療效[35-37]。

實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明,6-OHDA、LPS模型大鼠在造模后第2周經(jīng)腹腔注射阿撲嗎啡誘導(dǎo)出自患側(cè)向健側(cè)發(fā)起的首尾銜接的持續(xù)的自發(fā)性旋轉(zhuǎn)行為,其證候表現(xiàn)與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道相符。與6-OHDA及LPS組比較,復(fù)方地黃顆粒灌胃后DH+6-OHDA組及DH+LPS組大鼠黑質(zhì)紋狀體IL-1β、TNF-α含量表達(dá)顯著降低,IL-10含量表達(dá)顯著升高,復(fù)方地黃顆粒對模型大鼠神經(jīng)行為學(xué)的干預(yù)作用與其抑制模型大鼠黑質(zhì)紋狀體促炎因子含量表達(dá)相關(guān)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與sham組比較,6-OHDA、LPS模型組大鼠黑質(zhì)紋狀體Iba1、NF-κ Bp65、p-NF-κ Bp65表達(dá)水平顯著升高,TH表達(dá)水平顯著降低。復(fù)方地黃顆粒灌胃后大鼠黑質(zhì)紋狀體Iba1、NF-κ Bp65、p-NF-κ Bp65表達(dá)水平顯著降低,TH表達(dá)水平顯著升高。復(fù)方地黃顆粒通過抑制黑質(zhì)紋狀體小膠質(zhì)細(xì)胞NF-κ B信號通路激活,下調(diào)IL-1β、TNF-α等炎癥因子表達(dá),顯著改善模型大鼠神經(jīng)行為學(xué)障礙。

綜上所述,小膠質(zhì)細(xì)胞激活及促炎因子高水平表達(dá)與PD的發(fā)病密切相關(guān)。復(fù)方地黃顆粒通過抑制模型大鼠黑質(zhì)紋狀體小膠質(zhì)細(xì)胞激活,下調(diào)炎癥因子TNF-α、IL-1β含量表達(dá)調(diào)節(jié)模型大鼠神經(jīng)行為學(xué)障礙。復(fù)方地黃顆粒對PD模型大鼠神經(jīng)行為學(xué)異常的干預(yù)作用與其抗炎機(jī)制相關(guān),本研究進(jìn)一步豐富了復(fù)方地黃顆粒治療PD的理論基礎(chǔ)。