電針干預(yù)慢性炎性痛的杏仁核潛在蛋白篩選

陳月蓉,徐赟赟,倪雯沁,丁棋柯,戴瑋,許穎齡,朱希瀟,方劍喬*,吳媛媛*

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院康復(fù)醫(yī)學(xué)院,杭州 310053;2.浙江省針灸神經(jīng)病學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,杭州 310053;3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院,杭州 310053)

疼痛是一種多維的有意識(shí)體驗(yàn),包括感官成分(對(duì)疼痛的嚴(yán)重程度和位置的感知)和消極的情感-動(dòng)機(jī)成分[1]。慢性疼痛是一個(gè)常見且復(fù)雜的問題,對(duì)個(gè)人和社會(huì)都有深遠(yuǎn)的影響[2]。全球疾病負(fù)擔(dān)研究中,疼痛和疼痛相關(guān)疾病是全球殘疾和疾病負(fù)擔(dān)的主要原因[3]。研究表明杏仁核中多種細(xì)胞因子、受體和活性變化參與了疼痛的調(diào)節(jié)[4-14]。研究發(fā)現(xiàn),電針可緩解痛抑郁和痛記憶動(dòng)物模型的痛覺異常和情緒障礙,中樞邊緣系統(tǒng)中與杏仁核有密切聯(lián)系的前扣帶回皮層參與電針對(duì)痛感覺與痛情緒的調(diào)節(jié)過程[15-16];但其具體的分子生物學(xué)機(jī)制仍不明確。本部分實(shí)驗(yàn)以完全弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvant,CFA)誘導(dǎo)的慢性疼痛大鼠模型為載體,對(duì)慢性炎性痛大鼠進(jìn)行電針干預(yù),觀察模型大鼠的痛覺異常;篩選并探討杏仁核中參與電針干預(yù)慢性疼痛的差異蛋白;本研究將更深層次地說明慢性痛的發(fā)生以及電針干預(yù)的新機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6～8周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠共27只,體重為(250±20)g,購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK(滬)2018-0006】。于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SYXK(浙)2018-0012】飼養(yǎng)。飼養(yǎng)于40 cm×5 cm×25 cm(長(zhǎng)×寬×高)的獨(dú)立送回風(fēng)凈化籠具內(nèi),每籠4～5只大鼠。飼養(yǎng)期間給予嚙齒類動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料,均由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供及飼養(yǎng),12 h循環(huán)燈光,室溫為(25±1)℃,相對(duì)濕度為(50±5)%。本實(shí)驗(yàn)操作均遵循中華人民共和國(guó)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》的相關(guān)規(guī)定及人道主義精神。本實(shí)驗(yàn)操作均遵循浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與倫理委員會(huì)實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)要求(倫理審批號(hào):IACUC-20210118-07)。

1.1.2 主要試劑與儀器

CFA(F5881,美國(guó)Sigma);甘油、BSA(G0854、A0332-25G,中國(guó)上海生工);尿素、碘乙酰胺、十二烷基磺酸鈉、銀染試劑盒(161-0731、163-2109、161-0302、161-0450,美國(guó)Bio-Rad);KH2PO4、KCl、HCl(10017618、10016318、10011018,中 國(guó) 國(guó) 藥);NH4HCO3、三氟乙酸(A6141、T6508,美國(guó)Sigma);Trypsin(317107,美國(guó)Promega);甲酸(064450,美國(guó)Fluka);Tris(T8060-1 kg,中國(guó)索萊寶)。

von Frey絲(Aesthesio,美國(guó)Danmic);電子天平(AB135-S,美國(guó)METTLER TOLEDO);色譜系統(tǒng)、質(zhì)譜儀、酶標(biāo)儀、C18上樣柱、C18分析柱(Easy nLC、Q Exactive、Multiskcan FC、C18 μm,100?、10 cm,μmC18-A2,美國(guó)Thermo Scientific);超聲破碎儀(JY92-Ⅱ,中 國(guó) 寧 波 新 芝);SCX色 譜 柱(Polysulfoethyl,美國(guó)PolyLCInc)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)方案

實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、電針組,每組9只。對(duì)照組大鼠于左后足跖掌面皮下注射100 μL的生理鹽水。模型組和電針組大鼠于左后足跖掌面皮下注射100 μL CFA以誘發(fā)慢性炎性痛模型。電針組電針治療時(shí)間為造模后第1～14天,每日治療1次。其余兩組不進(jìn)行電針干預(yù)。取材后對(duì)各組大鼠的右側(cè)杏仁核進(jìn)行同位素標(biāo)記的相對(duì)和絕對(duì)定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè),對(duì)差異蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析,以探討電針影響慢性疼痛的杏仁核潛在機(jī)制。實(shí)驗(yàn)流程圖如圖1所示。

1.2.2 造模

SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d,稱重后用3%戊巴比妥鈉注射液腹腔注射(1 mL/Kg)麻醉,對(duì)照組大鼠左后足跖掌面皮下注射生理鹽水0.1 mL,模型組和電針組大鼠左后足跖掌面皮下注射0.1 mL CFA。造模成功后,模型組和電針組大鼠左足可見明顯腫脹,對(duì)照組大鼠左足無明顯改變。對(duì)照組、模型組和電針組大鼠造模后24 h左足形態(tài)如圖2所示。

圖2 對(duì)照組(左)和模型組、電針組(右)左足形態(tài)Figure 2 Hind paw photographs revealed an obvious swelling in the guarding posture of CFA rats

1.2.3 機(jī)械痛閾檢測(cè)

將大鼠放置于金屬網(wǎng)上,再蓋以透明的有機(jī)玻璃罩,玻璃罩規(guī)格為20 cm×10 cm×15 cm,室溫為(25±1)℃,相對(duì)濕度為(50±5)%,首先讓大鼠進(jìn)行15min左右的環(huán)境適應(yīng),當(dāng)大鼠狀態(tài)為相對(duì)安靜后進(jìn)行檢測(cè)。用von Frey纖維絲對(duì)大鼠足底中部進(jìn)行刺激,使纖維絲彎曲成S形,刺激時(shí)長(zhǎng)為6～8 s(包括6、8 s),若在刺激期間,大鼠出現(xiàn)明顯的縮足或舔足反應(yīng),則記為陽(yáng)性。von Frey纖維絲的力度值共分為1.4、2、4、6、8、10、15和26 g。測(cè)試時(shí)從8 g力度值的纖維絲開始測(cè)試,若使用該力度值的纖維絲不能引起大鼠的縮足或者舔足反應(yīng)時(shí),記為陰性“O”,并使用力度值大一級(jí)的纖維絲繼續(xù)檢測(cè);若使用8 g力度值的纖維絲能引起大鼠的縮足或舔足反應(yīng)時(shí),記為陽(yáng)性“×”,并用小一級(jí)力度值的纖維絲繼續(xù)檢測(cè),直至出現(xiàn)陰性和陽(yáng)性(陽(yáng)性和陰性)反應(yīng)的騎跨。按相同標(biāo)準(zhǔn)連續(xù)測(cè)定4次。為消除每一次檢測(cè)帶來的影響,兩次檢測(cè)之間應(yīng)間隔30 s,若使用力度值為26 g的纖維絲仍不能引起大鼠的陽(yáng)性反應(yīng),則將50%縮足閾值記作26 g。50%縮足閾值計(jì)算公式為50% g PWT=(10[xf+kδ])/10 000,Xf為最后應(yīng)用的von Frey纖維的力度log值,δ為相鄰von Frey纖維力度log值之間差值的平均值(即0.184),k為陽(yáng)性和陰性反應(yīng)類型的查表值[17]。測(cè)試分別在第0天(基線)、第1、7、11和14天進(jìn)行。

1.2.4 電針方法

電針組選取雙側(cè)足三里(ST36,脛骨前結(jié)節(jié)外側(cè)5 mm)和三陰交(SP6,內(nèi)踝隆起近10 mm)穴位將直徑0.25 mm、長(zhǎng)13 mm的不銹鋼針直刺入穴位,深度為5 mm。采用平補(bǔ)平泄法。同側(cè)的足三里和三陰交連接電針。電針參數(shù)設(shè)置如下:方波電流輸出(脈寬:0.2 ms),電針強(qiáng)度從1 mA開始,每隔10 min增加0.5 mA,治療時(shí)間為30 min。刺激頻率為2 Hz。所有的大鼠都被布罩松散地固定,沒有任何身體上的約束。電針時(shí)間為造模后第1～14天。每日治療1次,共治療14 d。對(duì)照組與模型組不予電針干預(yù)。

1.2.5 取材和蛋白提取

大鼠稱重后用3%戊巴比妥鈉注射液腹腔注射(1 mL/kg)麻醉,經(jīng)左心室、升主動(dòng)脈用生理鹽水快速灌注200 mL,置于冰袋上斷頭,開顱,取腦。根據(jù)Paxinnos & Watson腦立體定位圖譜,切取杏仁核(前囟向后0.36 mm至前囟向后5.04 mm;頂部向下7.4 mm至10.2 mm;正中線向右3 mm至5.4 mm,見圖3),置于-80℃凍存。

蛋白提取:每組9個(gè)樣本,每3個(gè)樣本混為1管,加入適量SDT裂解液(4%十二烷基磺酸鈉,100 mmol/L Tris-HCl,pH=7.6),轉(zhuǎn)移至預(yù)先裝有適量石英砂(組織樣品另外加入1顆1/4英寸陶瓷珠)的2 mL離心管中,進(jìn)行勻漿破碎,超聲(80 W,工作10 s,間歇15 s,循環(huán)10次),沸水15 min。17 500 rpm離心40 min,取上清及濾液通過0.22 μm濾紙完成過濾收集。進(jìn)行蛋白質(zhì)定量(BCA,bicinchoninic acid)。分裝樣品,-80℃保存。

1.2.6 iTRAQ技術(shù)繪制蛋白質(zhì)譜

用iTRAQ試劑(應(yīng)用生物系統(tǒng))標(biāo)記每個(gè)樣品的100 μg多肽混合物。然后使用AKTA凈化器系統(tǒng)通過SCX層析對(duì)iTRAQ標(biāo)記的肽進(jìn)行分級(jí)。以1 mL/min的流速以0%～8%緩沖液B(10 mmol/L KH2PO4,pH=3.0,25%乙腈,500 mmol/L KCl)的梯度洗脫22 min,然后在22～47 min內(nèi)洗脫8%～52%緩沖液B,在47～50 min內(nèi)洗脫52%～100%緩沖液B,在50～58 min內(nèi)洗脫100%緩沖液B,以及在58 min后洗脫0%緩沖液B。洗脫用214 nm處的吸光度監(jiān)測(cè),每1 min收集1次。收集的餾分在C18小柱上脫鹽,真空離心濃縮。流程圖見圖4。

圖4 iTRAQ實(shí)驗(yàn)流程Figure 4 Work flow of iTRAQ

1.2.7 質(zhì)譜分析

高效液相色譜:樣品的分離通過納升流速的高效液相色譜(high-performance liquid chromatography,HPLC)液相系統(tǒng)Easy nLC完成。質(zhì)譜鑒定:經(jīng)液相系統(tǒng)分離后的樣本通過Q-Exactive質(zhì)譜儀完成質(zhì)譜分析。采集多肽和多肽碎片的質(zhì)量電荷比的方式如下:每次全掃描后采集10個(gè)碎片圖譜,MS2 Activation Type為HCD,Isolation window為2 m/z,二級(jí)質(zhì)譜分辨率17 500 at 200 m/z,Microscans為1,二級(jí)Maximum IT為60 ms,Normalized Collision Energy為30 eV,Underfill為0.1%。數(shù)據(jù)分析:查庫(kù)鑒定與定量分析通過Mascot 2.2和Proteome Discoverer 1.4完成。

1.2.8 生物信息學(xué)分析

進(jìn)行聚類分析時(shí),首先對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)集合的定量信息進(jìn)行歸一化處理(歸一化到(-1,1)區(qū)間)。樣本的分類及蛋白量的分析通過軟件Graphpad Prism 8.0完成,并將分析結(jié)果展示為層次聚類熱圖。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,Graphpad Prism 8.0軟件整理生成統(tǒng)計(jì)圖;所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,組間比較采用單因素重復(fù)測(cè)量方差分析(ANOVA);多重比較中,方差齊時(shí)采用最低顯著性差異(LSD),方差不齊時(shí)采用Dunnett檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 電針對(duì)CFA誘導(dǎo)的慢性炎性痛大鼠機(jī)械痛閾的影響

如圖5所示,CFA注射前,各組大鼠左后足機(jī)械縮痛閾差異無顯著性(P＞0.05)。CFA注射后,模型組與電針組大鼠的機(jī)械縮痛閾顯著下調(diào)(P＜0.01);電針治療后,電針組大鼠痛閾上調(diào),與模型組相比差異具有顯著性。

2.2 對(duì)照組大鼠和模型組大鼠杏仁核差異蛋白表達(dá)

每組9只大鼠,每3只大鼠的杏仁核蛋白作為一個(gè)蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)樣本,每個(gè)樣本做3次方法學(xué)重復(fù)。iTRAQ鑒定到的蛋白中符合表達(dá)差異倍數(shù)大于1.2倍(上下調(diào))且P值小于0.05篩選標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)視為差異表達(dá)蛋白質(zhì),其數(shù)量如表1所示。其中,對(duì)照組與模型組相比,共檢測(cè)到58個(gè)差異蛋白,其差異倍數(shù)和差異顯著性如圖6A所示。對(duì)照組與模型組相比表現(xiàn)出有顯著性差異的蛋白質(zhì)層次聚類分析圖見圖6B。

注:與模型組相比,##P＜0.01;與對(duì)照組相比,**P＜0.01。圖5 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)PWTs變化Note.Compared with model group,##P＜0.01.Compared with Con group,**P＜0.01.Figure 5 Comparisons of PWTs among groups of rats at different timepoints

表1 兩組間的差異蛋白數(shù)量Table 1 Number of differential proteins between two groups

對(duì)照組與電針組相比,共檢測(cè)到37個(gè)差異蛋白,其差異倍數(shù)和差異顯著性如圖7A所示。對(duì)照組與電針組相比表現(xiàn)出顯著性差異的蛋白質(zhì)層次聚類分析圖見圖7B。

通過進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)模型組相較于對(duì)照組變化有顯著性差異且電針組相較于模型組有顯著性差異且有意義的有F盒蛋白6(F-box only protein 6,FBXO6)、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(SET and MYND domain-containing protein,Smyd5)、突觸黏附蛋白(extracellular leucine-rich repeat fibronectin type III domain containing 1,Elfn1)共3個(gè)蛋白(見圖8)。

在本研究中,蛋白質(zhì)組學(xué)揭示了電針治療慢性痛時(shí)影響杏仁核FBXO6、Smyd5、Elfn1表達(dá)的作用。其中3個(gè)蛋白的作用見表2。

表2 差異蛋白功能Table 2 Differential protein function

注:A:綠點(diǎn)為模型組相比對(duì)照組下降且差異有顯著性;紅點(diǎn)為模型組相比對(duì)照組上升且差異有顯著性;B:與對(duì)照組相比的差異倍數(shù),取其以10為底的對(duì)數(shù)值。圖6 對(duì)照組與模型組相比差異有顯著性的蛋白分布火山圖和層次聚類分析圖Note.A.The green dot is the decrease in the model group compared to the control group and there is a significant difference.The red dot is the increase in the model group than the control group and there is a significant difference.B.The multiple of the difference compared with the control group,which is the logarithmic value with the base 10 as the value.Figure 6 Volcano plot and heat map of differential proteins between Con group and model group

注:A:綠點(diǎn)為電針組比對(duì)照組下降且差異有顯著性;紅點(diǎn)為電針組比對(duì)照組上升且差異有顯著性;B:與對(duì)照組相比的差異倍數(shù),取其以10為底的對(duì)數(shù)值。圖7 電針組與對(duì)照組相比差異有顯著性的蛋白分布火山圖和層次聚類分析圖Note.A.The green dot is the decrease in the EA group compared to the control group and there is a significant difference.The red dot is the increase in the EA group than the control group and there is a significant difference.B.The multiple of the difference compared with the control group,which is the logarithmic value with the base 10 as the value.Figure 7 Volcano plot and heat map of differential proteins between EA group and Con group

注:與對(duì)照組相比,1)P＜0.01;與模型組相比,2)P＜0.05;與對(duì)照組相比,3)P＜0.05;與模型組相比,4)P＜0.05。圖8 電針誘導(dǎo)大鼠杏仁核FBXO6、Smyd5和Elfn1的表達(dá)變化Note.Compared with Con group,1)P＜0.01.Compared with model group,2)P＜0.05.Compared with Con group,3)P＜0.05.Compared with model group,4)P＜0.05.Figure 8 Electroacupuncture induces changes in the expression of FBXO6,Smyd5 and Elfn1 in the amygdala of rats

3 討論

在本研究中,電針對(duì)慢性炎性痛模型大鼠的痛閾有明顯的上調(diào)作用。疼痛和情緒的調(diào)控涉及到中樞與外周的多個(gè)環(huán)節(jié)、多種因子,針灸的調(diào)節(jié)同樣涉及多靶點(diǎn)。在針灸和疼痛研究中,基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)到代謝組學(xué)的研究方法的應(yīng)用開始逐漸增多[30-31]。因此,研究了電針對(duì)杏仁核蛋白表達(dá)的影響?；趇TRAQ的蛋白質(zhì)組學(xué)分析,模型組與對(duì)照組相比共發(fā)現(xiàn)58個(gè)顯著改變的蛋白質(zhì),其中17個(gè)在杏仁核中表達(dá)上調(diào),41個(gè)表達(dá)下調(diào)。同時(shí),電針組與對(duì)照組相比杏仁核中共有37個(gè)蛋白發(fā)生顯著變化,其中17個(gè)蛋白在杏仁核中表達(dá)上調(diào),20個(gè)表達(dá)下調(diào)。最后,對(duì)照組對(duì)比模型組且電針組對(duì)比模型組差異有顯著性且有意義的蛋白為FBXO6、Smyd5、Elfn1。

FBXO6是一種參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解(ERassociated protein degradation,ERAD)的泛素連接酶系統(tǒng),負(fù)責(zé)N-糖蛋白的泛素化[32]。FBXO6能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)復(fù)制應(yīng)激的敏感性[33]。此外有研究發(fā)現(xiàn)FBXO6對(duì)I型干擾素(interferon-I,IFN-I)介導(dǎo)的抗病毒免疫反應(yīng)的普遍作用[34]。FBXO6還能通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和抑制cJun氨基末端激酶(c-Jun Nterminal kinase,JNK)的活性以減輕鎘對(duì)人胚腎293細(xì)胞(human embryonic kidney cells,HEK293)細(xì)胞的毒性[35]。但在疼痛領(lǐng)域中還沒有關(guān)于FBXO6的文獻(xiàn)報(bào)道。

Smyd5在維持染色體完整性方面發(fā)揮著重要作用[36]。Smyd5參與調(diào)節(jié)了巨噬細(xì)胞中的組蛋白甲基化,Smyd5使賴氨酸20上的組蛋白H4三甲基化,從而抑制炎癥反應(yīng)基因包括腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、巨 噬 細(xì) 胞 炎 性 蛋 白1β(macrophage inflammatory protein-1β,MIP-1β)和白介素1(interleukin 1,IL-1)的表達(dá)[37]。這可能與電針緩解CFA誘發(fā)的慢性炎性痛相關(guān)。

Elfn1是一種突觸黏附蛋白,也是一種假定的I型跨膜蛋白,含有一個(gè)富含亮氨酸重復(fù)型受體激酶(leucine-rich repeat receptor kinase,LRR)結(jié)構(gòu)域、一個(gè)纖維連接蛋白III型結(jié)構(gòu)域和一個(gè)跨膜域[38]。Elfn1是III組代謝性谷氨酸受體的變構(gòu)調(diào)節(jié)器,也是一種跨突觸支架蛋白,它是招募突觸前谷氨酸受體7(glutamate metabotropic receptor 7,GRM7)和離子型谷氨酸海人藻酸受體(glutamate ionotropic receptor kainate,GRIK2)以形成突觸所必需的[28,39]。代謝性谷氨酸受體(metabotropic glutamate receptors,MGluRs)構(gòu)成一個(gè)內(nèi)源性調(diào)節(jié)系統(tǒng),它沿整個(gè)痛神經(jīng)軸表達(dá)并調(diào)節(jié)痛覺[40]。有研究表明第七亞型代謝型谷氨酸受體(metabotropic glutamate receptor 7,mGluR7)對(duì)疼痛有易化作用[41]。因此,電針可能通過Elfn1對(duì)mGluR7的相關(guān)作用從而起到鎮(zhèn)痛效應(yīng)。

杏仁核是疼痛情緒-情感維度和疼痛調(diào)節(jié)的重要大腦中心[42]。有研究指出中央杏仁核(central amygdala nucleus,CeA)中的谷氨酸(glutamic acid,Glu)傳遞與疼痛有關(guān)[43-44]炎性痛大鼠CeA中過度表達(dá)的mGluR8可抑制傷害性行為,而這種效應(yīng)的產(chǎn)生與Glu釋放的增加、GABA的減少等因素相關(guān)[45]。Glu是中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳遞疼痛相關(guān)信號(hào)的主要神經(jīng)遞質(zhì)。興奮性谷氨酸能和抑制性γ-氨基丁酸能傳遞的失衡被認(rèn)為是中樞敏感化發(fā)展的基礎(chǔ),而中樞敏感化能引起慢性疼痛患者的臨床癥狀[46]。Elfn1在杏仁核中、Glu能神經(jīng)元上表達(dá)[27]。因此,電針對(duì)慢性炎性痛大鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)可能是通過Elfn1對(duì)杏仁核上的Glu能神經(jīng)元的相關(guān)作用產(chǎn)生的,但確切機(jī)制仍不清楚。

綜上所述,數(shù)據(jù)表明,CFA誘導(dǎo)的慢性炎性疼痛會(huì)導(dǎo)致杏仁核的蛋白變化,共有3個(gè)蛋白質(zhì)在模型組和電針組的大鼠杏仁核中差異表達(dá)。由此可見,電針“足三里”“三陰交”可明顯改善CFA誘發(fā)的慢性炎性痛。其機(jī)制可能與改變杏仁核中FBXO6、Smyd5、Elfn1表達(dá)相關(guān)。后期,將對(duì)3個(gè)差異蛋白中重要蛋白進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。我們的研究為進(jìn)一步探討電針影響慢性疼痛的杏仁核機(jī)制鋪平了道路。