NOD2促進(jìn)二乙基亞硝胺誘導(dǎo)小鼠肝組織炎癥的機(jī)制研究

許智玲,張斌*,張順財(cái)

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院感染科,上海 201700;2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院消化科,上海 200032)

肝做為人體最大的消化器官,受各種有害因素的影響可造成肝損傷。肝損傷早期多表現(xiàn)為肝組織的炎癥,若早期肝細(xì)胞炎癥得不到及時(shí)診治,會逐步發(fā)展為肝纖維化,嚴(yán)重會進(jìn)展為肝硬化,甚至肝癌[1-2]。因而在肝病防治方面,積極探索肝早期炎癥反應(yīng)的機(jī)制具有非常重要的臨床意義。有研究發(fā)現(xiàn),機(jī)體天然免疫系統(tǒng)主要通過各種模式識別受體(pattern recognition receptors,PRRs)識別病原成分,進(jìn)一步啟動宿主應(yīng)答免疫防御反應(yīng)。其中,NOD2是PRRs家族的重要成員,它主要識別細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌肽聚糖的降解產(chǎn)物胞壁酰二肽(muramyl dipeptide,MDP),是一種存在于所有革蘭陽性菌和陰性菌細(xì)胞壁的成分,可以介導(dǎo)宿主抵抗入侵細(xì)菌的免疫和炎癥反應(yīng)[3],因此,NOD2與炎癥反應(yīng)關(guān)系密切。既往有學(xué)者發(fā)現(xiàn),NOD2表達(dá)除了與克羅恩病的炎癥發(fā)生密切相關(guān)外,腸源性MDP的刺激可激活肝細(xì)胞NOD2受體并增加其表達(dá),與肝病發(fā)生自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎密切有關(guān)[4-6],但NOD2在肝炎癥性疾病中的具體作用及機(jī)制仍不明確。為進(jìn)一步探索其機(jī)制,本研究應(yīng)用NOD2肝特異性敲除小鼠,使用DEN構(gòu)建急性肝損傷模型[7],以探討肝細(xì)胞NOD2受體在肝炎癥反應(yīng)中的作用及可能機(jī)制,為肝炎癥的診治提供重要的作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

20只6周 齡 的SPF級 雄 性B6/JNju-Nod2em1Cflox/Gpt(Nod2f/f)小鼠,體重19～21 g,由南京大學(xué)模式動物公司提供【SCXK(蘇)2018-0008】,隨機(jī)選擇其中10只與Albumin-Cre小鼠雜交,獲得NOD2肝特異性敲除小鼠(Nod2△hep):基因敲除的過程按照文獻(xiàn)的方法操作[8],由南京大學(xué)模式動物公司執(zhí)行)。飼養(yǎng)于復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物部【SYXK(滬)2020-0032】,飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)過程遵守動物的3R原則,小鼠均分籠飼養(yǎng),每籠5只,采用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng),自由飲水,光照與黑暗各12 h交替處理,濕度為50%～60%,溫度為20～22℃,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.1.2 主要試劑與儀器

DEN和三辛酸甘油酯由美國Sigma公司提供?？俁NA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。PCR試劑購自上海生工,ALT、AST測定試劑盒及病理染色試劑購自南京建成公司。P38/p-P38、ERK/p-ERK、JNK/p-JNK、p65/p-p65、JAK2/p-JAK2、STAT3/p-STAT3等抗體購自美國Abcam公司。

超低溫冰箱(Thermo公司,美國);熒光顯微鏡(Nikon公司,日本);高速低溫離心機(jī)(Sigma公司,美國);實(shí)時(shí)熒光PCR儀(Eppendorf公司,德國);凝膠掃描成像系統(tǒng)(Bio-Bod公司,美國)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組

使用DEN構(gòu)建急性肝損傷模型,以DEN注射的NOD2基因敲除小鼠為Nod2△hep模型組,DEN注射的B6/JNju-Nod2em1Cflox/Gpt(Nod2f/f)小 鼠 為Nod2f/f模型組,未注射DEN的NOD2基因敲除小鼠為Nod2△hep組,未注射DEN的Nod2f/f小鼠為Nod2f/f組,每組5只。DEN具體使用方法如下:75%乙醇消毒小鼠腹部后,單次腹腔注射DEN(100 mg/kg,三辛酸甘油酯溶解)后1周處死小鼠,取材進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。全部實(shí)驗(yàn)過程未出現(xiàn)小鼠死亡。

1.2.2 組織病理學(xué)觀察

新鮮肝組織用4%多聚甲醛固定后石蠟包埋。石蠟切片厚5 μm,蘇木精-伊紅(HE)以及TUNEL染色。為進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,石蠟切片在進(jìn)行脫臘、抗原修復(fù)及封閉后,分別孵育Ki67(1∶500,Abcam,英國)、F4/80(1∶100,CST,美國)抗體,顯微鏡下拍照并應(yīng)用ImageJ軟件(NIH,美國)統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.3 血清ALT和AST水平檢測

小鼠麻醉后取靜脈血至1.5 mL離心管中,室溫靜置離心收集血清,根據(jù)ALT和AST試劑盒說明書檢測血清中ALT和AST水平變化。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)

NCBI網(wǎng)站搜索GenBank中已有的大鼠IL-6、TNF-α、IL-1β、IFN-γ及NOD2基因序列設(shè)計(jì)相應(yīng)引物,以GAPDH為內(nèi)參基因,由上海捷瑞生物設(shè)計(jì)合成,序列見表1。應(yīng)用TRIzol試劑盒裂解提取小鼠肝組織中的總RNA,應(yīng)用PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒(日本TaKaRa)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。根據(jù)SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說明書(日本TaKaRa),冰上配制20 μL反應(yīng)體系,隨后使用ABI7500儀器進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。

1.2.5 免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn)(Western Blot)

肝組織使用含有蛋白酶抑制劑PMSF(碧云天,上海)和磷酸酶抑制劑(Roche公司)的RIPA裂解液進(jìn)行裂解提取總蛋白。配置SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳分離蛋白、轉(zhuǎn)膜、封閉隨后一抗孵育過夜:P38/p-P38(1∶1000,CST)、ERK/p-ERK(1∶1000,CST)、JNK/p-JNK(1∶1000,CST)、p65/p-p65(1∶1000,CST)、JAK2/p-JAK2(1∶1000,CST)、STAT3/p-STAT3(1∶1000,CST)和GAPDH(1∶1000,碧云天),對應(yīng)二抗室溫孵育1 h后ECL發(fā)光檢測結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用單因素方差分析,兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NOD2肝特異性敲除小鼠模型的鑒定

通過對Nod2f/f組和Nod2△hep組NOD2的mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)水平比較,發(fā)現(xiàn)Nod2△hep組NOD2的mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)水平均顯著下調(diào)(n=5,P＜0.05,圖1)。表明NOD2肝特異性敲除小鼠的模型建立成功。

圖1 NOD2基因敲除小鼠的基因表達(dá)及NOD2蛋白表達(dá)Figure 1 Gene expression and NOD2 protein expression in NOD2 knockout mice

2.2 肝特異性敲除NOD2對DEN誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷的影響

HE染色結(jié)果顯示,作為對照的Nod2f/f組和Nod2△hep組均無明顯肝炎癥壞死等表現(xiàn),而經(jīng)過DEN處理的Nod2f/f模型組和Nod2△hep模型組均有顯著的肝炎癥、壞死表現(xiàn),進(jìn)一步對兩個(gè)模型組比較,發(fā)現(xiàn)Nod2△hep模型組小鼠肝組織損傷情況顯著減輕,表現(xiàn)為細(xì)胞壞死及空泡形成顯著減少(圖2A)。對小鼠血清中ALT和AST的水平檢測結(jié)果顯示,Nod2f/f組和Nod2△hep組無顯著性異常,而Nod2f/f模型組和Nod2△hep模型組均高于Nod2f/f組和Nod2△hep組(P＜0.01),同時(shí),通過對模型組的比較發(fā)現(xiàn),Nod2△hep模型組血清ALT及AST均低于Nod2f/f模型組(P＜0.01)(圖2B)。

基因名稱Gene name Forward 5’-3’ Reverse 5’-3’GAPDH TGTGTCCGTCGTGGATCTGA TTCGTGTTGAAGTCGCAGGAG IL-6 TCCATCCAGTTGCCTTCTTG TTCCACGATTTCCCAGAGAAC TNF-α TGCCTATGTCTCAGCCTCTTC GGTCTGGGCCATAGAACTGA IL-1β TCGCTCAGGGTCACAAGAAA CATCAGAGGCAAGGAGGAAAAC IFN-γ ATGAACGCTACACACTGCATC CCATCCTTTTGCCAGTTCCTC NOD2 TGGTTCAGCCTCTCACGATGA AGGACACTCTCGAAGCCTT

2.3 肝特異性敲除NOD2對DEN誘導(dǎo)的小鼠肝炎癥的影響

對小鼠肝組織炎癥因子表達(dá)水平比較,發(fā)現(xiàn)Nod2△hep模型組肝組織中TNF-α、IL-6、IFN-γ和IL-1β的mRNA相對表達(dá)量均低于Nod2f/f模型組(P＜0.01)(圖3A)。進(jìn)一步對小鼠肝組織進(jìn)行F4/80免疫組化染色進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)Nod2△hep模型組F4/80染色陽性細(xì)胞數(shù)也顯著低于Nod2f/f模型組(P＜0.01)(圖3B)。而作為對照的Nod2f/f組和Nod2△hep組肝組織均無顯著性異常。

2.4 肝特異性敲除NOD2對DEN誘導(dǎo)的小鼠肝細(xì)胞增殖和凋亡的影響

研究發(fā)現(xiàn),與Nod2f/f組和Nod2△hep組比較,Nod2△hep模型組及Nod2f/f模型組肝組織中Ki67染色陽性細(xì)胞數(shù)及肝細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)顯著增多(P＜0.01),同時(shí)對兩個(gè)模型組比較發(fā)現(xiàn),Nod2△hep模型組肝組織Ki67染色陽性細(xì)胞數(shù)及肝細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)明顯少于Nod2f/f模型組(P＜0.01)(圖4,5)。

2.5 肝特異性敲除NOD2對DEN誘導(dǎo)后炎癥相關(guān)信號通路的影響

通過對肝組織中P38、ERK、JNK、p65以及JAK2/STAT3蛋白磷酸化水平的比較,發(fā)現(xiàn)Nod2f/f模型組和Nod2△hep模型組均顯著高于Nod2f/f組和Nod2△hep組,進(jìn)一步對兩個(gè)模型組進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)Nod2△hep模型組肝組織中P38、ERK、JNK、p65以及JAK2/STAT3蛋白磷酸化水平顯著低于Nod2f/f模型組(P＜0.05)。表明肝NOD2缺失可下調(diào)NF-κB、MAPK和STAT3信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)(見圖6)。

圖6 肝NOD2缺失對DEN誘導(dǎo)后小鼠肝NF-κ B、MAPK和STAT3信號通路的影響(n=5)Figure 6 Effects of NOD2 deficiency on NF-κ B,MAPK and STAT3 signaling pathways in the liver of DEN induced mic(n=5)

3 討論

肝病是常見的疾病,許多肝病因?yàn)榈貌坏郊皶r(shí)診治,會從早期的肝炎,逐步進(jìn)展到肝硬化,甚至肝癌,是造成患者死亡的主要原因。肝作為最大的消化腺,容易受到代謝物、毒性物質(zhì)及微生物等多種因素的損傷,造成肝細(xì)胞的炎癥,嚴(yán)重的可以發(fā)生肝細(xì)胞壞死。同時(shí)肝具有強(qiáng)大的再生修復(fù)能力,研究發(fā)現(xiàn)肝切除手術(shù)或毒物造成肝損傷后,殘肝細(xì)胞能迅速由靜止?fàn)顟B(tài)進(jìn)入細(xì)胞周期,通過DNA合成和有絲分裂補(bǔ)償丟失的肝組織,恢復(fù)肝功能。在肝細(xì)胞的壞死-再生循環(huán)中,炎癥是誘發(fā)肝疾病的常見原因,是機(jī)體快速響應(yīng)感染或損傷的一種固有免疫,適度的炎癥反應(yīng)能夠保護(hù)機(jī)體免受進(jìn)一步的損傷。但是,慢性炎癥和過度的炎癥反應(yīng)通常是有害的,不僅對機(jī)體形成二次打擊,也會損傷機(jī)體的正常功能[9],如得不到及時(shí)診治,會進(jìn)一步形成肝硬化,甚至肝癌。正常情況下,肝可通過各種免疫細(xì)胞清除由腸道經(jīng)門靜脈系統(tǒng)到達(dá)感知各種細(xì)菌成分,但是肝出現(xiàn)損傷后,可以引起腸道菌群失調(diào)和腸道通透性增加,腸源性細(xì)菌成分通過門靜脈系統(tǒng)到達(dá)肝增多而清除減少,逐漸累積的細(xì)菌成分可持續(xù)激活肝免疫反應(yīng),加重肝炎癥反應(yīng)和DNA損傷,促進(jìn)肝疾病發(fā)展[10]。肝通過調(diào)控促炎和抗炎細(xì)胞因子間的平衡,發(fā)揮炎癥調(diào)節(jié)作用,在肝再生和肝壞死中也發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。因而積極探索肝炎癥的免疫機(jī)制,有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。

許多研究證實(shí),有20%～75%的慢性肝病患者發(fā)生腸道菌群失調(diào)[11],特別是小腸細(xì)菌過度生長,使得門脈中內(nèi)毒素(LPS)水平明顯升高的情況下更易發(fā)生;另有學(xué)者發(fā)現(xiàn),肝硬化患者腸道上皮緊密連接蛋白ZO-1表達(dá)水平下降,黏膜屏障功能受損,滲透性增加,移位到肝的細(xì)菌或其代謝成分增多,容易發(fā)現(xiàn)肝炎癥,進(jìn)一步可以加重肝損傷,他們應(yīng)用抗生素利福昔明抑制腸道細(xì)菌過度生長可一定程度緩解肝性腦病和肝硬化失代償期患者的病情[12]。學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),在不同肝炎癥模型中,腸源性細(xì)菌產(chǎn)物可以誘導(dǎo)肝NOD2表達(dá)增加,促進(jìn)機(jī)體TNF-α和IFN-γ的表達(dá),有促進(jìn)肝炎癥反應(yīng)的作用[13-14]。NOD2作為PRRs家族的重要成員,可以通過識別腸源性細(xì)菌產(chǎn)物MDP而被激活,從而啟動宿主免疫和炎癥反應(yīng)。學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),在不同肝炎癥模型中,腸源性細(xì)菌產(chǎn)物可以誘導(dǎo)肝NOD2表達(dá)增加,促進(jìn)機(jī)體TNF-α和IFN-γ的表達(dá),有促進(jìn)肝炎癥反應(yīng)的作用[15-16]。NOD2作為PRRs家族的重要成員,可以通過識別腸源性細(xì)菌產(chǎn)物MDP而被激活,從而啟動宿主免疫和炎癥反應(yīng),但是對NOD2在肝炎癥中的機(jī)制還不完全清楚。因而積極探索NOD2與肝炎癥發(fā)生中的作用及機(jī)制具有非常重要的意義。為探索NOD2在肝炎癥發(fā)病中的作用,我們借助動物研究所的平臺,構(gòu)建了NOD2肝特異性敲除小鼠(Nod2△hep),并采用PCR和Western Blot技術(shù)對NOD2基因敲除小鼠進(jìn)行鑒定,通過對Nod2f/f組和Nod2△hep組肝組織NOD2 mRNA及蛋白質(zhì)相對表達(dá)量的比較,發(fā)現(xiàn)Nod2△hep組NOD2的mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)水平均顯著下調(diào),表明NOD2肝特異性敲除小鼠的模型建立成功。為了使小鼠形成肝炎,選擇DEN對其干預(yù),當(dāng)一次性注射DEN后可以造成小鼠急性肝損傷,能較好滿足小鼠肝炎研究的需要。進(jìn)一步對其機(jī)制進(jìn)行了探索,發(fā)現(xiàn)與Nod2f/f模型組比較,Nod2△hep模型組小鼠肝組織細(xì)胞壞死及空泡形成明顯減少,Nod2△hep模型組小鼠血清ALT和AST水平明顯下降(P＜0.01),而Nod2△hep組小鼠與Nod2f/f組小鼠肝組織病理及肝功能均無明顯異常。另外通過對各組肝組織炎癥因子表達(dá)情況進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)與Nod2f/f模型組相比,Nod2△hep模型組中炎癥因子TNF-α、IL-6、IFN-γ和IL-1β的基因表達(dá)水平及肝組織F4/80染色陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少(P＜0.01),而Nod2△hep組小鼠與Nod2f/f組小鼠炎癥因子表達(dá)水平無明顯改變;進(jìn)一步對各組肝細(xì)胞增殖凋亡情況進(jìn)行了比較,發(fā)現(xiàn)與Nod2f/f模型組相比,Nod2△hep模型組中肝細(xì)胞的增殖及凋亡水平下降,而Nod2△hep組小鼠與Nod2f/f組小鼠增殖及凋亡水平無明顯改變;Western Blot表達(dá)結(jié)果表明,Nod2△hep模型組小鼠肝組織中的P38、ERK、JNK、p65以及JAK2/STAT3蛋白磷酸化水平較Nod2f/f模型組明顯下降,而Nod2△hep組小鼠與Nod2f/f組小鼠肝組織中相關(guān)蛋白磷酸化水平均低于模型組。表明肝NOD2缺失可顯著抑制DEN誘導(dǎo)的小鼠肝炎癥因子生成和巨噬細(xì)胞聚集,減少了肝細(xì)胞死亡,有助于減輕肝損傷程度,其機(jī)制可能與其下調(diào)肝組織NF-κB、MAPK和STAT3信號通路相關(guān)因子的表達(dá)有關(guān),值得進(jìn)一步深入研究。