反復(fù)冷-熱刺激對大鼠鼻黏膜免疫屏障功能的影響及中醫(yī)解表方的作用研究

楊居崩,趙顯芳,聶發(fā)龍,肖純,代蓉,李秀芳

(云南中醫(yī)藥大學(xué),昆明 650500)

近年來,隨著SARS病毒[1-2]、MERS病毒[3-4]、H1N1流感病毒[5-6]、H7N9禽流感病毒[7-8]的相繼肆虐,目前,新型冠狀病毒肺炎在全球流行[9-13],呼吸系統(tǒng)感染性疾病的防治引起了全世界廣泛的關(guān)注,這些高致病性病毒的共同特點是均可由呼吸道進(jìn)入機體進(jìn)而引發(fā)疾病,并且它們的傳播途徑也主要是呼吸道,其中肺炎等嚴(yán)重的下呼吸道感染(lower respiratory tract infection,LRTI)往往始于上呼吸道感染(upper respiratory tract infection,URTI)研究證實[12],冠狀病毒及流感病毒引起的嚴(yán)重感染均與呼吸道黏膜屏障結(jié)構(gòu)破壞或功能低下密切相關(guān),提高呼吸道黏膜屏障的防御能力是防治呼吸系統(tǒng)感染性疾病的重要途徑之一。上呼吸道覆蓋于除鼻前庭外鼻腔結(jié)構(gòu)的鼻黏膜,直接與外界接觸,是機體與吸入抗原及病原體接觸的第一個部位,也是機體天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分,其不僅具有一般性的機械屏障作用,還參與體液免疫和細(xì)胞免疫過程,是執(zhí)行局部非特異性免疫功能的主要場所。鼻黏膜免疫屏障的功能易受多種因素的影響,其中,溫度變化的刺激尤其重要。研究表明[14-15],暴露在寒冷的氣候環(huán)境中會增加機體對普通感冒的易感性,其原因與寒冷刺激引起機體免疫功能抑制,病毒在低溫環(huán)境下更容易復(fù)制等因素有關(guān)[16]。為進(jìn)一步考察溫度變化的刺激對SD大鼠鼻黏膜局部免疫功能及機體炎癥反應(yīng)的影響,本實驗采用冷-熱循環(huán)刺激的方式干預(yù)SD大鼠,檢測其鼻黏膜免疫屏障相關(guān)效應(yīng)分子的變化,并同時考察了循環(huán)系統(tǒng)中炎癥因子的變化。

解表方是中醫(yī)臨床治療表證的常用方劑,由于中醫(yī)表證癥狀的描述與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的URTI癥狀非常相似,故中醫(yī)常用解表方治療上呼吸道感染,并取得了較好的效果。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)解表方麻黃湯和銀翹散均可提高寒冷所致上呼吸道黏膜屏障功能低下模型小鼠唾液中sIgA的含量,對鼻腔接種乙型溶血性鏈球菌感染小鼠有生存保護(hù)作用[17],提示,兩個解表方治療上呼吸道感染的機制與其提高上呼吸道黏膜免疫功能有關(guān)。因此在本實驗中同時對這兩個解表方的作用進(jìn)行了考察。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

120只SPF級雄性SD大鼠,8周齡,體重180～200 g,購于成都達(dá)碩實驗動物有限公司【SCXK(川)2020-030】,飼養(yǎng)于云南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗室【SYXK(滇)K2017-0005】,飼養(yǎng)期間各組大鼠自由飲水,飼喂普通維持飼料由成都達(dá)碩實驗動物有限公司提供。飼養(yǎng)環(huán)境:晝夜各半循環(huán)照明,濕度恒定,溫度控制在22～25℃。所有操作均符合云南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理學(xué)要求(審批號:R-082018034)。

1.1.2 主要試劑與儀器

BCA蛋白濃度檢測試劑盒(Beyotime,P0010),RIPA裂解液(強)(Beyotime,P0013B),吐溫-20(Biofroxx,1247ML100),過硫酰胺(Sangon Biotech,A600072-0025),10% SDS(Sangon Biotech,B548118),Tris(Genview,BT350-500G),四甲基乙二胺(Cellcook,A100761-0100),甘氨酸(Biofroxx,1275GR5009),DTT(Sangon Biotech,A620058-0025),1 mol/L Tris-HCL緩沖液(Solarbio,T1020),1.5 mol/L Tris-HCL緩沖液(Solarbio,T1010),30%丙烯酰胺緩沖液(Solarbio,A1010),Anti-IgA(Novus Biologicals,NB7501);Anti-Goat(Proteintech,SA00001-4),Anti-Rabbit(Proteintech,SA00001-2),Anti-beta Actin(Proteintech,20536-1-AP),溶菌酶(南京建成生物工程研究所,A050-1-1),PGE2(南京建成生物工程研究所,H099-1),TNF-α(南京建成生物工程研究所,H052-1),IL-1β(南京建成生物工程研究所,H002),IL-6(南京建成生物工程研究所,H007-1-2),sIgA(南京建成生物工程研究所,H108-2)。

酶標(biāo)儀(Tecan,Infinite M200 PRO,瑞士),垂直電泳儀(Bio-Rad,EPS-301,美國),濕轉(zhuǎn)儀(Bio-Rad,18113002,美國),UVP凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio Spectrum,美國),分析天平(Precisa,XS125A,瑞士),冰箱(青島海爾,BCD-392MNE,中國)。

1.1.3 實驗藥物

銀翹散:按《方劑學(xué)》[18]配伍比例,稱取銀翹散,全方除薄荷、荊芥外,12倍水浸泡30 min,煎煮15 min,在10 min時加入薄荷、荊芥。紗布濾過,再經(jīng)真空抽濾后液體在40°旋蒸至所需濃度相應(yīng)體積。大鼠的給藥劑量為臨床等效量(16.74 g生藥/kg體重)的2倍(33.48 g生藥/kg體重)。

麻黃湯:按《方劑學(xué)》[18]配伍比例,稱取麻黃湯,10倍水浸泡全方30 min,先煎麻黃20 min,再與余藥共煎30 min,紗布濾過,再經(jīng)真空抽濾后液體在55°旋蒸至所需濃度相應(yīng)體積。大鼠的給藥劑量為換算成人臨床等效量2.43 g生藥/kg體重。

1.2 方法

1.2.1 單輪冷-熱刺激對大鼠鼻黏膜免疫功能及血清炎癥指標(biāo)的影響

參考文獻(xiàn)[19]稍作修改,取雄性SD大鼠54只,隨機分為陰性對照組、模型組。造模前禁食不禁水12 h,正常組不予任何刺激;模型組將動物先置于-15℃環(huán)境中1 h,再轉(zhuǎn)移入25℃環(huán)境30 min,循環(huán)4次,造模結(jié)束后恢復(fù)進(jìn)食。模型組于寒冷刺激后0、6 h、1、3、5、7、9、11 d每個時間點取6只動物,常規(guī)方法制備鼻黏膜組織、血清、鼻腔灌洗液,用Western Blot法檢測鼻黏膜組織中IgA的蛋白表達(dá),以IgA蛋白表達(dá)最低的時間點,ELISA試劑盒檢測大鼠鼻腔灌洗液中溶菌酶、sIgA及PEG2含量,及血清中的PGE2、TNF-α、IL-6、IL-1β的含量。

1.2.2 兩輪冷-熱刺激對大鼠鼻黏膜免疫功能及血清炎癥指標(biāo)的影響

取雄性SD大鼠42只,隨機分為陰性對照組、模型組。造模前禁食不禁水12 h,正常組不予任何刺激;各模型組將動物先置于-15℃環(huán)境中1 h,再轉(zhuǎn)移入25℃環(huán)境30 min,循環(huán)4次,造模結(jié)束后恢復(fù)進(jìn)食,各組動物在刺激結(jié)束后第9天,再次采用相同的冷-熱刺激條件刺激大鼠,各組動物于再次刺激后1、3、5、7、9、11 d每個時間點取6只動物,常規(guī)方法制備鼻黏膜組織、血清及鼻腔灌洗液,Western Blot法檢測鼻黏膜組織IgA的蛋白表達(dá),ELISA試劑盒檢測鼻腔灌洗液中溶菌酶、sIgA及PEG2的含量,以及血清中PGE2、TNF-α、IL-6、IL-1β的含量。

1.2.3 解表方對兩輪冷-熱刺激致大鼠鼻黏膜免疫屏障功能下降的影響

取雄性SD大鼠24只,隨機分為陰性對照組、模型組、銀翹散組和麻黃湯組。造模前禁食不禁水12 h,正常組不予任何刺激;其余各組進(jìn)行首次寒冷刺激,在造模6 h后,正常組和模型組灌胃給予蒸餾水(1 mL/100 g),銀翹散組和麻黃湯組給予相應(yīng)的藥物(1 mL/100 g),連續(xù)給予7 d,每天1次,在第9天時進(jìn)行第2次寒冷刺激,陰性對照組和模型組在第2次寒冷刺激后6 h后灌胃給予蒸餾水,銀翹散組和麻黃湯組給予相應(yīng)的藥物,22 h時再灌胃給予受試物1次,24 h時按常規(guī)方法制備血清、鼻腔灌洗液和鼻黏膜組織。鼻黏膜組織用于檢測IgA的蛋白表達(dá),大鼠鼻腔灌洗液用于檢測溶菌酶、sIgA及PGE2的含量,血清用于檢測血清中PGE2、TNF-α、IL-6、IL-1β的含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 單輪冷-熱刺激對大鼠鼻黏膜免疫功能及血清炎癥指標(biāo)的影響

結(jié)果顯示,SD大鼠在-15℃環(huán)境中1 h,再轉(zhuǎn)移入25℃環(huán)境30 min,循環(huán)4次刺激后,隨著時間的延長,鼻黏膜中IgA(圖1a)蛋白表達(dá)持續(xù)下降(P＜0.05);單輪冷-熱刺激后1 d,與陰性對照組相比,模型組大鼠鼻腔灌洗液中sIgA(圖1b)的含量降低(P＜0.05),而溶菌酶、PGE2、TNF-α、IL-6、IL-1β(圖1c,1d,1e,1f,1g,1h)無明顯差異(P＜0.05)。

2.2 兩輪冷-熱刺激對大鼠鼻黏膜免疫功能及血清炎癥指標(biāo)的影響

結(jié)果顯示,大鼠在單輪冷-熱刺激后第9天,對大鼠進(jìn)行再次刺激后,隨著時間的延長,大鼠鼻黏膜中IgA(圖2a)蛋白表達(dá)持續(xù)下降(P＜0.05),刺激后1、3、11 d時鼻腔灌洗液中溶菌酶(圖2b)的含量明顯低于對照組動物(P＜0.05);刺激后1 d時鼻腔灌洗液中sIgA(圖2c)含量明顯高低于對照組動物(P＜0.05);與陰性對照組相比,1、3 d時模型組血清中PGE2(圖2d)的含量明顯高于對照組動物(P＜0.05);而鼻腔灌洗液中的PGE2(圖2e),1、3 d時含量明顯低于對照組(P＜0.05);血清中的TNF-α(圖2f)含量持續(xù)上升,1、3、5、7、11 d時血清中TNF-α的含量明顯高于對照組(P＜0.05);刺激后1、11 d時血清中IL-6(圖2g)的含量明顯對照組動物(P＜0.05);1、3、11 d時血清中IL-1β(圖2h)的含量明顯高于對照組(P＜0.05)(見圖2)。

圖2 兩輪冷-熱刺激對大鼠鼻黏膜免疫功能及血清炎癥指標(biāo)的影響Figure 2 Effects of two rounds of cold-warm stimulation on immune function of nasal mucosa and serum inflammatory indexes in rats

2.3 單輪刺激與兩輪刺激大鼠鼻黏膜組織IgA蛋白含量的動態(tài)變化結(jié)果對比

為了比較SD大鼠受到單輪冷-熱刺激與兩輪冷-熱刺激后,鼻黏膜中IgA蛋白表達(dá)的差異,結(jié)果顯示,SD大鼠再次受到刺激后,隨著時間的延長,鼻黏膜中IgA蛋白表達(dá)持續(xù)下降,恢復(fù)速率更慢,1、3、9 d鼻黏膜中IgA蛋白明顯低于單輪刺激動物(P＜0.05)(見圖3)。

2.4 解表方對兩輪冷-熱刺激致大鼠鼻黏膜免疫屏障功能下降的影響

結(jié)果顯示,與陰性對照組比較,模型組大鼠鼻黏膜中IgA蛋白表達(dá)、鼻腔灌洗液中溶菌酶和sIgA明顯降低(P＜0.05),而血清中的炎癥因子PGE2、TNF-α、IL-6、IL-1β均明顯升高(P＜0.05);與模型組比較,銀翹散組大鼠鼻黏膜IgA蛋白表達(dá)、鼻腔灌洗液中溶菌酶含量和sIgA含量均明顯升高,血清中的炎癥因子PGE2、TNF-α、IL-6、IL-1β的含量均明顯下降(P＜0.05);與模型組比較,麻黃湯組大鼠鼻黏膜IgA蛋白表達(dá)、鼻腔灌洗液中的sIgA含量均明顯升高,而血清中僅IL-1β含量下降,PGE2、TNF-α、IL-6含量無明顯差異(P＞0.05)(見圖4)。

3 討論

URTI常發(fā)生于季節(jié)交替之時[20-22],其癥狀為鼻塞、流涕、喉嚨痛、咳嗽以及打噴嚏等[23-24],為自限性疾病,但可發(fā)展為肺炎、支氣管炎等嚴(yán)重的LRTI,特別是老人、嬰幼兒以及具有潛在疾病的人可能造成致命后果[25-27],研究表明,大多數(shù)呼吸道病毒感染具有季節(jié)性。在溫帶地區(qū),URTI在秋季和春季出現(xiàn)的頻率增加,并在整個冬季高度流行[22,28]。冬季寒冷、干燥的氣候特點是呼吸道感染增加的主要驅(qū)動因素,可促使病毒穩(wěn)定性增加并加快傳播,削弱宿主的免疫系統(tǒng)[29-31],如2002～2003年重癥急性呼吸綜合征(SARS-CoV)和最近出現(xiàn)的新型冠狀病毒肺炎(SARS-CoV-2)等[32-35]進(jìn)一步表明了冬季環(huán)境容易促進(jìn)各種呼吸道病毒感染的傳播,并在健康人群中高度流行,研究表明[36-37]人體暴露于寒冷環(huán)境中會增加呼吸道感染的風(fēng)險及其嚴(yán)重程度,每年冬季都會因氣溫的下降而導(dǎo)致死亡率和發(fā)病率的大幅上升,其死亡率比其他季節(jié)平均高出26%,其中24%的人死于呼吸系統(tǒng)疾病[38]。另外平均氣溫每降低1℃,冬季死亡人數(shù)就增加8000人[39]。根據(jù)英國230名全科醫(yī)生在1970年8月至1991年7月期間統(tǒng)計的每萬名登記病人的發(fā)病率數(shù)據(jù)顯示[40],隨著氣溫的下降,流感樣疾病的發(fā)病率增加,發(fā)病高峰出現(xiàn)在2月份平均溫度最低的時期,其最大的因素是呼吸冷空氣會導(dǎo)致氣道降溫,從而導(dǎo)致呼吸道上皮溫度下降,并降低局部呼吸防御功能,如降低粘液纖毛清除率和抑制白細(xì)胞吞噬,最終導(dǎo)致呼吸道感染[41-42]。呼吸道黏膜免疫系統(tǒng)是機體抵御經(jīng)口鼻入侵病原體的第一道防線,鼻黏膜作為RMIS的重要組成部分,也是病原體入侵的首個接觸部位,鼻黏膜免疫功能低下是URTI發(fā)生的重要原因,也與URTI反復(fù)發(fā)作密切相關(guān),故維持鼻黏膜屏障功能的完整性對于URTI防治具有重要意義。結(jié)合臨床的這些研究報道,本實驗探討了反復(fù)冷-熱刺激對大鼠鼻黏膜免疫屏障功能的影響,并考察了中醫(yī)常用解表方麻黃湯和銀翹散的作用。

sIgA作為黏膜免疫系統(tǒng)的主要效應(yīng)分子,可通過限制病原體的上皮定植,防止病原體進(jìn)入黏膜上皮,保護(hù)黏膜表面免受環(huán)境病原體和抗原的侵害[43-45]。溶菌酶是體液中的非特異性殺菌物質(zhì),可反映機體非特異性免疫機能的水平,溶菌酶含量下降,則機體局部抗菌、抗感染能力下降[46-47]。當(dāng)受到反復(fù)的冷-熱刺激后,SD大鼠鼻黏膜IgA蛋白表達(dá)明顯下降,在刺激后的第1天表達(dá)最低,此時鼻腔灌洗中分泌型的sIgA顯著下降,但溶菌酶含量無明顯變化,血清中炎癥介質(zhì)PGE2及炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β也都無明顯變化,在刺激后的3 d內(nèi),SD大鼠鼻黏膜IgA蛋白均呈低表達(dá),但第3天后開始呈上升趨勢,至第7天則完全恢復(fù)至正常水平,提示,在短暫的反復(fù)冷-熱刺激后,會使得鼻黏膜的免疫屏障功能暫時低下,但此時機體的炎癥反應(yīng)不明顯。

研究顯示,小鼠在初次感染細(xì)菌或病毒性肺炎后即使被治愈,再次感染肺炎的機率也會明顯升高,會出現(xiàn)免疫系統(tǒng)對相同致病因素的反應(yīng)性下降的現(xiàn)象[48]。在本實驗研究中,大鼠受到單輪冷-熱刺激后7 d鼻黏膜中IgA蛋白表達(dá)就能恢復(fù)正常,那如果大鼠再次受到相同條件的冷-熱刺激時,大鼠鼻黏膜免疫效應(yīng)分子IgA是否能夠再次在短時間內(nèi)恢復(fù)正常呢?為了回答這個問題,大鼠在單輪冷-熱刺激后的第9天,對大鼠進(jìn)行相同條件的再次冷-熱刺激,結(jié)果發(fā)現(xiàn),再次刺激后,隨著時間的延長,大鼠鼻黏膜中IgA蛋白表達(dá)持續(xù)下降,刺激后1、3、9 d鼻黏膜中IgA蛋白表達(dá)明顯低于單輪冷-熱刺激,雖然鼻黏膜中IgA蛋白表達(dá)在3 d后也呈上升趨勢,但較單輪冷-熱刺激后上升速率更慢,至第11天時,鼻黏膜中IgA蛋白表達(dá)也未恢復(fù)正常,同時,再次的冷-熱刺激后,模型大鼠鼻腔灌洗液中sIgA和溶菌酶的含量均顯著下降,血清中PGE2、TNF-α、IL-6、IL-1β均顯著升高,提示,大鼠在受到冷-熱刺激后,即使鼻黏膜中IgA蛋白表達(dá)恢復(fù)正常,再次受到冷-熱刺激后,鼻黏膜免疫系統(tǒng)功能下降會更明顯,機體的防御能力下降,這可能與機體受到反復(fù)的冷-熱刺激后會造成上呼吸道感染的易感性提高的原因相關(guān)。

銀翹散源于《溫病條例》,由清代溫病學(xué)家吳鞠通創(chuàng)制,是中醫(yī)用于治療風(fēng)熱表證的代表方,使用至今已有兩百多年歷史,具有辛涼透表、清熱解毒的功效,主要用于溫病初起,微惡風(fēng)寒,頭痛口渴,咳嗽咽痛,舌尖紅,苔薄白或薄黃,脈浮數(shù)等。麻黃湯源于張仲景所著《傷寒論》,是中醫(yī)用于治療風(fēng)寒表證的代表方,具有發(fā)汗解表、宣肺平喘、利水消腫的功效,主治外感風(fēng)寒表實證,惡寒發(fā)熱,頭身疼痛,無汗而喘,舌苔薄白,脈浮緊等。由于兩個解表方的主治病癥與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中URTI的臨床癥狀非常相似,因此,兩個解表方被廣泛用于URTI的治療,在臨床上顯示了較好的療效。本研究的結(jié)果顯示,反復(fù)冷-熱刺激后,SD大鼠鼻黏膜IgA蛋白表達(dá)明顯下降,鼻腔灌洗中分泌型的sIgA顯著下降,提示鼻黏膜的免疫屏障功能下降,分別給予麻黃湯和銀翹散后,均能升高鼻黏膜IgA的蛋白表達(dá)和鼻腔灌洗中sIgA的含量,并且以麻黃湯提高鼻黏膜IgA的蛋白表達(dá)的作用更加明顯。提示,麻黃湯側(cè)重于促進(jìn)鼻黏膜IgA的蛋白表達(dá)來發(fā)揮提高鼻黏膜免疫功能的作用。銀翹散組溶菌酶的含量升高,麻黃湯組無明顯變化,提示銀翹散可通過提高sIgA、溶菌酶的含量而發(fā)揮增強鼻腔局部非特異性免疫功能的作用。再次冷-熱刺激導(dǎo)致SD大鼠多種炎癥因子明顯升高,銀翹散和麻黃湯對大鼠鼻腔灌洗液中和血清中PGE2均無明顯影響,但銀翹散可顯著降低模型大鼠血清中TNF-α、IL-1β的含量,提示其具有減輕炎癥反應(yīng)的作用,麻黃湯僅能降低IL-1β的含量,提示,銀翹散在緩解炎癥反應(yīng)方面作用更為突出。本研究顯示,不同藥性的麻黃湯與銀翹散對寒冷刺激致大鼠鼻黏膜免疫功能低下模型具有相同的作用也有不同的作用,但其具體的作用機制尚不清楚,因此在后續(xù)的研究中將對兩種解表方的作用機制進(jìn)行深入研究。為臨床治療URTI提供科學(xué)的理論依據(jù)。