REST/NRSF對皮質(zhì)酮應(yīng)激模型小鼠抑郁與焦慮樣行為影響

余煊,李祥磊,孫秀萍,秦川

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,國家人類疾病動物模型資源庫,衛(wèi)健委人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室,北京市人類重大疾病實驗動物模型工程技術(shù)研究中心,北京 100021)

抑郁癥又名重度抑郁障礙(major depressive disorder,MDD),是一種嚴重的情緒障礙和精神疾病。有證據(jù)表明,抑郁癥同時受到環(huán)境和遺傳因素的影響,其中應(yīng)激引起的下丘腦垂體腎上腺軸(HPA軸)功能異?；钴S與抑郁癥發(fā)病有著密切的聯(lián)系[1-3]。抑郁患者檢測發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)醇水平異常升高,皮質(zhì)醇節(jié)律紊亂[4];同時地塞米松抑制實驗發(fā)現(xiàn),HPA軸功能異常與急性抑郁狀態(tài)存在相關(guān)性[5]。多個研究表明,長期反復(fù)皮下注射皮質(zhì)酮可以誘導(dǎo)小鼠表現(xiàn)抑郁樣行為,并且小鼠抑郁樣行為隨著注射時間增加而加重[6-9],可以用作研究慢性應(yīng)激的抑郁模型[10-11]。

抑制元件1沉默轉(zhuǎn)錄因子(RE-1-silencing transcription factor,REST)也稱為神經(jīng)元限制性沉默因子(neuron restrictive silencer factor,NRSF)是通過與目標(biāo)基因RE-1/NRSE序列結(jié)合,從而抑制其表達的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[12-13];它可以與其他蛋白協(xié)同作用,在神經(jīng)元的分化和發(fā)育中發(fā)揮多種廣泛的調(diào) 節(jié) 作 用[14-15]。REST參 與 了 神 經(jīng) 發(fā) 生(neurogenesis)和神經(jīng)元表型的精細形成(neuronal phenotype elaboration)[16];能夠調(diào)控各種編碼和非編碼神經(jīng)元特異性基因,包括發(fā)育過程中編碼突觸可塑性和結(jié)構(gòu)重塑的關(guān)鍵蛋白,如神經(jīng)遞質(zhì)受體,離子通道,突觸囊泡和miRNA等[17-20];通過表觀遺傳修飾參與染色質(zhì)可塑性、神經(jīng)應(yīng)激反應(yīng)[21-23];可以抑制凋亡、神經(jīng)保護[24-25]等。REST主要在小鼠胚胎的四肢和CNS中,成年小鼠腎上腺胸腺中高表達;而成年小鼠大腦皮層、前額葉、小腦中低水平表達,主要位于未分化的神經(jīng)祖細胞和非神經(jīng)元細胞[14,26]。REST在神經(jīng)系統(tǒng)的功能中有著重要作用,REST與其靶基因的相互作用也涉及到精神和神經(jīng)系統(tǒng)疾病,包括阿爾茲海默癥、帕金森癥、亨廷頓病、唐氏綜合征、C1型尼曼氏病等[14,18,25,27]。此外,臨床研究腦成像結(jié)果和死后大腦解剖顯示,抑郁癥患者腦中神經(jīng)元丟失和凋亡增加[28-29]。而且有一部分治療抑郁癥的抗抑郁藥和情緒穩(wěn)定劑,是通過增強神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護細胞機制產(chǎn)生作用,而REST抑制細胞死亡相關(guān)基因表達有著神經(jīng)保護作用[27,30]。在一些抑郁動物模型和臨床研究數(shù)據(jù)中,人們也發(fā)現(xiàn)應(yīng)激壓力能夠使REST在轉(zhuǎn)錄和表達水平發(fā)生變化,例如幼年時期暴露于社會應(yīng)激的大鼠腦內(nèi)海馬和內(nèi)側(cè)前額葉皮層REST水平下降,但是成年小鼠暴露于社會應(yīng)激時海馬REST表達量上升[27]。

轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子REST在抑郁癥的發(fā)病和治療過程中發(fā)揮作用的具體功能和機制尚不明確。因此,本研究希望通過建立皮質(zhì)酮小鼠模型,檢測REST在該抑郁模型中的表達情況,并通過注射AAV上調(diào)小鼠海馬內(nèi)REST表達水平檢測小鼠抑郁與焦慮行為變化,探索REST在小鼠應(yīng)激模型中的生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

48只6～7周齡SPF級BALB/c小鼠,體重22～24 g,購買自華阜康公司【SCXK(京)2019-0008】,飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所嚙齒類行為學(xué)SPF屏障設(shè)施【SYXK(京)2018-0019】,相對濕度約為50%,溫度控制22～25℃,給予充足食物和飲水,12 h/12 h固定燈光周期。動物實驗方案通過中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所實驗動物管理和使用委員會審批(IACUC QC18001)。

1.1.2 主要試劑與儀器

動物組織總RNA提取試劑(DP431,天根生化有限公司),FastKing一步法反轉(zhuǎn)錄-熒光定量試劑盒(SYBR Green)(FP313,天根生化有限公司)。動物運動軌跡跟蹤系統(tǒng)(Noldus,荷蘭),CFX ConnectTM熒光定量PCR檢測系統(tǒng)(Bio-rad,美國)。

1.2 方法

1.2.1 Rest-AAV注射

Rest組與Rest模型組24只小鼠被雙側(cè)注射1 μL的Rest過表達載體病毒。在0.4 L/min的異氟烷深度麻醉下通過腦立體定位手術(shù),使用30 Ga規(guī)格的微量注射器(Hamilton)和微量注射泵(WPI)向小鼠雙側(cè)海馬注射AAV病毒(相對前囟坐標(biāo):-2.8 mm AP,±2.5 mm ML,-3.2 mm DV),速度為400 nL/min。注射完成5 min后,緩慢抽出注射針。

1.2.2 皮質(zhì)酮模型

48只小鼠隨機分為對照組、模型組、REST-AAV注射組(Rest組)與REST-AAV注射并造模組(Rest模型組),對照組和模型組小鼠進行假手術(shù)注射(sham)以去除手術(shù)損傷對小鼠行為學(xué)的影響。模型組與Rest模型組小鼠每天皮下注射皮質(zhì)酮20 mg/kg(1% DMSO,0.1% Tween-80)建立內(nèi)分泌干擾的慢性抑郁模型,皮質(zhì)酮溶液濃度為4 mg/mL;對照組與Rest組每天注射相同體積溶劑作為對照。連續(xù)注射4周后進行行為學(xué)測試,然后灌流取材進行后續(xù)檢測。

1.2.3 行為學(xué)測試

(1)曠場實驗:測試小鼠被依次單獨放在新穎的空曠方形盒子(50×50×30 cm)中央,記錄并統(tǒng)計5 min內(nèi)小鼠的總運動時間、運動路程以及在中心區(qū)域和邊緣區(qū)域停留的時間。

(2)高架十字迷宮實驗:十字迷宮包括一個中心平臺(5×5 cm)、兩個開放的手臂和兩個封閉的手臂(30×5 cm),架于地板上方55 cm。封閉臂有一個高10 cm的圍墻,末端封閉,允許5勒克斯的光強度,而開放臂則完全打開。將小鼠放置在中心平臺上,頭部朝向開放臂,讓其自由進入四臂探索5 min。測量小鼠進入開放臂和封閉臂的次數(shù)以及在這些臂上停留的時間。

(3)懸尾實驗:用膠帶將小鼠尾巴粘在離底20 cm高的檢測鐵片上,使用Noldus系統(tǒng)實時記錄受力變化判斷小鼠處于運動或者不動狀態(tài),每組實驗共6 min,統(tǒng)計小鼠在此期間的不動時間。

(4)強迫游泳實驗:將小鼠放置于盛有15 cm深溫水(25±1)℃的透明圓筒(高25 cm,直徑10 cm)中,每組實驗共6 min,記錄后4 min內(nèi)小鼠的不動時間。每組實驗結(jié)束后將小鼠擦干放在裝有干燥墊料置于加熱墊上的鼠盒中,直至小鼠毛發(fā)完全干燥。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

使用GraphPad Prism 8.0軟件對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。使用Shapiro-Wilk法檢驗數(shù)據(jù)正態(tài)性。兩組數(shù)據(jù)比較使用獨立樣本t檢驗或配對樣本t檢驗;多組數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布且方差齊,使用方差分析(ANOVA),并選擇Tukey HSD法進行兩兩比較;多組數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布但方差不齊,使用Brown-Forsythe檢驗,并選擇Games-Howell法進行兩兩比較。雙因素數(shù)據(jù)使用Greenhouse-Geisser校正的雙因素重復(fù)測量方差分析(repeated measures two-way ANOVA),選擇Tukey法進行組間變量的多重比較。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準差()。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,P＜0.01為差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義,P＜0.001為差異具有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AAV載體病毒注射提高小鼠腦海馬中REST/NRSF的表達

根據(jù)RestmRNA編碼序列(NM_011263.2)設(shè)計AAV載體,由和元生物公司完成載體構(gòu)建和AAV病毒合成,血清型AAV2/9,質(zhì)粒表達載體如圖1A所示。所得的REST-AAV病毒及對照通過立體定位注射至小鼠腦兩側(cè)海馬。2周后,用實時熒光定量PCR檢測病毒在小鼠腦內(nèi)的表達效率,小鼠腦內(nèi)Rest的mRNA表達水平較對照病毒注射小鼠有顯著升高(P＜0.001),如圖1B所示。檢測結(jié)果表明,合成的REST-AAV病毒能夠有效達到腦局部區(qū)域過表達REST的作用,可以用于后續(xù)實驗調(diào)控REST水平。

2.2 REST/NRSF過表達影響模型小鼠行為學(xué)變化

小鼠重復(fù)皮質(zhì)酮注射建立抑郁模型后(實驗流程第15天),每周對各組小鼠稱量體重,并在注射結(jié)束后進行相關(guān)行為學(xué)測試,實驗流程如圖2所示。皮質(zhì)酮對模型小鼠體重的影響如圖3所示,雙因素重復(fù)測量方差分析,時間主效應(yīng)顯著F(3.005,132.2)=39.48,P＜0.0001;模型分組主效應(yīng)顯著F(3,44)=28.88,P＜0.0001;交互作用顯著F(12,176)=15.00,P＜0.0001。對照組小鼠體重隨小鼠年齡增加逐步增長至(27.2±1.5)g;模型組和Rest模型組小鼠體重從第2周開始出現(xiàn)顯著下降,分別為(24.3±0.6)g和(23.9±0.9)g,兩兩比較均與對照組具有顯著差異,這與前人研究報道結(jié)果相似[9]。而模型組與Rest模型組小鼠體重之間并無顯著差異,這說明腦內(nèi)過表達REST不能影響重復(fù)注射皮質(zhì)酮引起的小鼠體重變化。

圖2 實驗流程Figure 2 Experimental procedure

重復(fù)注射皮質(zhì)酮造模結(jié)束后,首先進行曠場實驗和高架迷宮實驗。曠場實驗中,Rest模型組小鼠總運動時間有所減少,但與其他各組均無顯著性差異(圖4A);各組小鼠總運動距離也無顯著性差異(圖4B)。小鼠在曠場中央?yún)^(qū)所處的時間和進入中央?yún)^(qū)探索的次數(shù)是反應(yīng)小鼠焦慮狀態(tài)的重要指標(biāo)。實驗結(jié)果表明,各組小鼠在中央?yún)^(qū)停留的時間并沒有差異(圖4C),但是Rest模型組小鼠進入中央?yún)^(qū)的次數(shù)較對照組減少,表現(xiàn)出一定的焦慮傾向,如圖4D所示,F(3.000,28.05)=3.879,P=0.0194。高架迷宮實驗中,對照組和模型組小鼠在開放臂的探索次數(shù)和停留時間比例都略大于封閉臂的,但沒有顯著性差異,Rest組小鼠在不同臂的探索次數(shù)和停留時間沒有區(qū)別;但是Rest模型組小鼠對封閉臂的探索次數(shù)和停留時間都顯著大于在開放臂的(P＜0.01),表現(xiàn)出較為明顯的焦慮行為(圖5A,5B)。

隨后,進一步使用懸尾實驗和強迫游泳實驗檢測各組小鼠的抑郁樣行為。在懸尾實驗中,模型組小鼠的不動時間相對對照組增加,Rest模型組小鼠的不動時間則有所下降,與對照組和Rest組小鼠沒有顯著性差異,如圖6A所示。相似的在強迫游泳實驗中(圖6B),實驗記錄后4 min內(nèi)模型組小鼠的不動時間較對照組顯著性上升,而過表達REST能減少皮質(zhì)酮誘導(dǎo)模型引起的不動時間增加(Rest模型組),F(3,44)=4.932,P=0.0049。單獨過表達REST,未重復(fù)注射皮質(zhì)酮誘導(dǎo)應(yīng)激模型,對小鼠的懸尾和游泳不動時間均無顯著影響。

2.3 REST/NRSF過表達調(diào)控相關(guān)基因變化

行為學(xué)實驗結(jié)束后,將各組小鼠快速安樂死取材,分離小鼠海馬區(qū)域腦組織提取總RNA,并進行實時熒光定量PCR檢測。Rest基因的表達與之前相似,注射有AAV的Rest組和Rest模型組小鼠腦內(nèi)海馬Rest水平較對照組和模型組顯著提高。有趣的是皮質(zhì)酮注射應(yīng)激模型也能引起小鼠海馬Rest水平上調(diào),但是在注射AAV的小鼠上建立該抑郁應(yīng)激模型反而導(dǎo)致Rest水平下降。此 外,還 檢 測 了Grin2b、Bndf、Nt3、Ngf、Fgf2等抑郁應(yīng)激相關(guān)的基因表達。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),皮質(zhì)酮注射應(yīng)激模型,對除Grin2b外基因表

達水平都有著顯著影響,如圖7所示。模型組小鼠Bndf、Nt3、Ngf的表達水平下降,Fgf2表達水平升高;過表達Rest則直接下調(diào)了Bndf、Nt3、Ngf的表達,但在此基礎(chǔ)上建立皮質(zhì)酮模型,這些基因表達再無進一步變化;但Fgf2在小鼠過表達Rest后,模型引起的表達上升轉(zhuǎn)為下降,這表明過表達REST影響了多種相關(guān)基因表達,可能引起下游眾多信號通路發(fā)生變化。

3 討論

REST是神經(jīng)發(fā)育中的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,同時也被證實在神經(jīng)退行性疾病中起著神經(jīng)保護功能[18,25,27],并有可能作為抑郁癥的生物標(biāo)志物和治療對策[27]。在這項研究中,實驗結(jié)果首次表明REST確實在皮質(zhì)酮抑郁應(yīng)激模型中起著重要的作用,海馬區(qū)過表達Rest能夠直接影響小鼠在抑郁和焦慮行為學(xué)測試中的表現(xiàn),同時能夠調(diào)節(jié)Grin2b、Bndf、Nt3、Ngf、Fgf2等多種相關(guān)基因的RNA轉(zhuǎn)錄水平。

研究報道稱REST具有一定的神經(jīng)保護功能,并可能與抑郁癥發(fā)病過程中的細胞死亡/存活信號通路及腦神經(jīng)元損傷機制相關(guān)[14,27],而皮質(zhì)酮反復(fù)注射可能誘導(dǎo)模型小鼠海馬內(nèi)神經(jīng)元發(fā)生退行性改變,因此,REST的神經(jīng)保護功能可能在此發(fā)揮作用。同時,實驗結(jié)果表明REST過表達可能不是起單純的神經(jīng)保護作用:在懸尾實驗和強迫游泳實驗中,皮質(zhì)酮模型小鼠表現(xiàn)出顯著的抑郁樣行為,而REST過表達能夠減少這兩組測試中小鼠的不同時間,表現(xiàn)出一定的抑郁緩解作用;但是在同時過表達REST和注射皮質(zhì)酮誘導(dǎo)應(yīng)激模型時,小鼠在高架十字迷宮中也表現(xiàn)出強烈的焦慮行為。mRNA的檢測結(jié)果從另一方面印證相關(guān)的猜測,Bndf、Nt3、Ngf等神經(jīng)營養(yǎng)因子在抑郁模型組小鼠中表達水平下降;但是在Rest模型組中,REST過表達并沒有上調(diào)相關(guān)的神經(jīng)營養(yǎng)因子表達,反而進一步抑制了部分基因的表達。這些結(jié)果表明,單純調(diào)控REST的表達水平可能并不能作為治療抑郁癥的良好靶點。由于REST調(diào)控眾多重要基因,直接上調(diào)REST的表達水平可能引起下游眾多信號通路發(fā)生變化,進一步引起相關(guān)神經(jīng)元和神經(jīng)環(huán)路功能的改變。

此外,構(gòu)建AAV病毒載體過表達REST后,發(fā)現(xiàn)在實驗中使用病毒濃度引起的小鼠海馬內(nèi)其轉(zhuǎn)錄水平濃度大幅升高,遠超出其生理正常水平和應(yīng)激模型誘導(dǎo)后表達水平。這可能導(dǎo)致REST調(diào)控的下游基因產(chǎn)生一系列不可預(yù)測的變化,會影響到小鼠抑郁和焦慮樣行為。大量臨床醫(yī)學(xué)與動物實驗科學(xué)研究認為應(yīng)激通常是抑郁和焦慮的重要誘因,且在抑郁患者和抑郁動物模型的相關(guān)檢測中焦慮反應(yīng)與應(yīng)激反應(yīng)也常常伴隨或交替出現(xiàn),例如大鼠母子分離模型能導(dǎo)致類似焦慮和抑郁的行為增加,以及HPA反應(yīng)變化[31]。關(guān)于REST過表達后的實驗結(jié)果提示,其可能在焦慮和抑郁的行為變化中有一定功能。

綜上所述,首次證實了調(diào)節(jié)REST在小鼠海馬的表達,能夠改善小鼠的抑郁樣行為,但同時可能引起焦慮樣行為;神經(jīng)營養(yǎng)因子基因和神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)基因表達在這一過程中發(fā)生了顯著變化。由于神經(jīng)元損傷是抑郁癥的重要特征之一,具有神經(jīng)保護功能的REST基因可以作為抑郁癥機制和抑郁癥治療研究策略的新方向,實驗結(jié)果為這一猜想提供了初步的理論依據(jù),同時也提示抑郁癥中REST的神經(jīng)保護機制還需要進一步深入的探索。