糞菌移植療法對大鼠脊髓損傷后的作用研究*

劉明富，劉 槃，寧 宇，張 瓊，農(nóng)海斌，宗少暉△

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，南寧 530021）

脊髓損傷（spiral cord injury，SCI）是由于脊髓結(jié)構(gòu)破壞，引起脊髓神經(jīng)功能障礙的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病[1-3]，2017年調(diào)查顯示，我國SCI發(fā)病數(shù)高達(dá)37/100萬人[4]，其中北京60.2/100 萬，上海25/100 萬[5]，給社會帶來沉重負(fù)擔(dān)。SCI 后免疫細(xì)胞出現(xiàn)過度活化，免疫炎性因子如白細(xì)胞介素（IL）、腫瘤壞死因子（TNF）-α、補(bǔ)體蛋白分子等大量釋放，形成炎性因子風(fēng)暴，對SCI 處組織及細(xì)胞進(jìn)行暴風(fēng)雨般的自殺式攻擊，給機(jī)體組織造成擴(kuò)大化的損害[6-7]。因此，控制損傷部位過度的炎性反應(yīng)在SCI后繼發(fā)性損傷及神經(jīng)再生等一系列重要進(jìn)程中可發(fā)揮關(guān)鍵性作用。腸道菌群是位于腸道中的共生微生物群，在機(jī)體生理活動中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。最新研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群能夠影響機(jī)體免疫系統(tǒng)，在維持免疫細(xì)胞功能上發(fā)揮重要的作用，由腸道菌群失衡引起的免疫炎癥過度激活，可影響到中樞系統(tǒng)疾病[8]。近年來，糞菌移植（FMT）研究進(jìn)展迅猛，一開始常用于胃腸道疾病，近些年來也開始用于自身免疫性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等[9-10]。本研究擬探討FMT 對大鼠SCI 后炎性反應(yīng)的影響及可能機(jī)制，對FMT 療法能否促進(jìn)SCI修復(fù)進(jìn)行評價(jià)，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF 級成年SD 大鼠36 只，體重180～220 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（桂）2020-0002，動物使用許可證號：SYXK（桂）2020-0003。所有動物置于SPF級動物房內(nèi)飼養(yǎng)，溫度20～25 ℃，相對濕度50%～60%，12 h/12 h明暗循環(huán)。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。本研究動物實(shí)驗(yàn)符合倫理審查標(biāo)準(zhǔn)（編號：201910031），嚴(yán)格遵循“3R”原則。

1.2 SCI 模型的建立 通過改良Allen's 擊打法建立SCI模型。大鼠麻醉后，取仰臥位；以T10為中心點(diǎn)，切開皮膚約4 cm，分離各層組織，暴露脊髓組織，脊髓呈現(xiàn)乳白色，使用克氏針（10 g）于3.5 cm高度進(jìn)行垂直擊打，此時(shí)大鼠尾巴擺動，雙后肢及軀體輕微抽搐并伸縮，脊髓迅速充血、水腫，提示造模成功。

1.3 糞菌液的制備 收集健康大鼠新鮮糞便，使用燒杯稱取10 g，加入生理鹽水50 mL充分?jǐn)嚢?，使?00 μm 濾網(wǎng)進(jìn)行過濾，濾液以12 000 r/min 離心10 min，取沉淀加入等量生理鹽水，重復(fù)上述步驟3次，糞菌液制備完成。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組和處理 將SD 大鼠隨機(jī)分為3 組，即對照組（A組）、SCI組（B組）、FMT治療組（C組），每組12只。A組僅手術(shù)暴露，不進(jìn)行擊打，B組和C組建立SCI 模型。C 組灌胃給予菌液，1 次/d，劑量為10 mL/kg，連續(xù)灌胃14 d，A組和B組灌胃給予等量生理鹽水。

1.5 腸道菌群測序 于術(shù)后14 d 收集各組糞便標(biāo)本，采用16S rDNA V3-V4高度保守區(qū)進(jìn)行HiSeq平臺測序。

1.6 體重和Basso-Beattie-Bresnaha（BBB）評分各組分別于術(shù)前（0 d）及術(shù)后1 d、3 d、7 d、14 d稱體重，并評估大鼠后肢功能恢復(fù)情況。BBB評分分為3個(gè)部分：（1）0～7分，評估后肢踝關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)和髖關(guān)節(jié)恢復(fù)情況；（2）8～13 分，評估后肢的承重和前、后肢協(xié)調(diào)恢復(fù)情況；（3）14～21 分，評估后肢主動爪位置與身體平行情況[11]。評分越高，表明大鼠運(yùn)動功能恢復(fù)越好。

1.7 脊髓組織IL-10、IL-4 和IL-17 含量測定 術(shù)后14 d，取脊髓組織按照1∶10（g/mL）比例加入RIPA 裂解液，充分研磨后再冷孵育20 min 充分裂解，14 000 r/min 離心20 min，取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法檢測脊髓組織中IL-10、IL-17和IL-4含量。

1.8 蘇木精—伊紅（HE）染色 術(shù)后14 d，取損傷處脊髓組織用4%多聚甲醒固定24 h，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，3 μm厚切片，行HE染色；沖洗，干燥，樹脂封片，顯微鏡下觀察脊髓組織病理學(xué)改變。

1.9 尼氏染色 制作病理切片（步驟同HE 染色），采用焦油紫作為核心染料，染色1 h 后用離子水沖洗，用分化劑進(jìn)行脫色，乙醇脫水和二甲苯透明后用中性樹膠封片。尼氏體呈深藍(lán)紫色顆?；虬邏K狀，細(xì)胞核淡藍(lán)色，背景無色或淺藍(lán)色。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HiSeq平臺測序結(jié)果 物種累積曲線反映的是抽樣個(gè)數(shù)對物種多樣性的影響；當(dāng)抽樣個(gè)數(shù)較少時(shí)，發(fā)現(xiàn)的物種并不全面，并不能表征整個(gè)群落結(jié)構(gòu)，隨著抽樣個(gè)數(shù)的增加，發(fā)現(xiàn)的物種數(shù)越來越多，也更能表征這個(gè)群落結(jié)構(gòu)。當(dāng)曲線末端上升趨勢趨于平緩時(shí)，則表明采樣量足夠，見圖1A。在關(guān)鍵物種門水平差異比較結(jié)果中，B 組擬桿菌門（Bacteroidetes）和螺旋體菌門（Saccharibacteria）數(shù)量減少（P＜0.05，P＜0.01），變形菌門（Proteobacteria）數(shù)量增多（P＜0.05），表明SCI 后腸道菌群發(fā)生了改變，見圖1B。

圖1 HiSeq平臺測序結(jié)果

2.2 3 組大鼠體重比較 與A 組比較，B 組和C 組在術(shù)后1 d體重?zé)o明顯差異（P＞0.05），術(shù)后3 d、7 d、14 d 體重均明顯下降（均P＜0.05）；與B 組比較，C組于術(shù)后1 d、3 d、7 d、14 d 體重均無明顯差異（均P＞0.05），見圖2。

圖2 SCI后大鼠體重變化

2.3 3 組BBB 評分比較 與A 組比較，B 組與C 組術(shù)后1 d，3 d，7 d，14 d的BBB評分均明顯下降（P＜0.05）；與B 組比較，C 組術(shù)后1 d，3 d，7 d，14 d 的BBB評分均明顯升高（均P＜0.05），見圖3。

圖3 SCI后大鼠運(yùn)動功能變化

2.4 3 組脊髓組織炎癥因子水平比較 與A 組比較，B組脊髓組織IL-10含量顯著下降，IL-17含量明顯上升（均P＜0.05），C 組IL-10 和IL-4 含量明顯上升，IL-17含量明顯下降（均P＜0.05）；與B組比較，C組IL-10 和IL-4 含量明顯上升，IL-17 含量明顯下降（均P＜0.05），見圖4。

圖4 SCI后14 d 3組脊髓組織炎癥因子水平比較

2.5 脊髓組織病理學(xué)變化 A組脊髓組織規(guī)整，細(xì)胞大小形態(tài)正常；B組在損傷處有炎性細(xì)胞浸潤，細(xì)胞數(shù)量減少，有空泡，出現(xiàn)病理性改變；C 組損傷情況明顯減輕，細(xì)胞變性水腫情況改善，見圖5。

圖5 SCI后14 d脊髓組織HE染色圖

2.6 脊髓組織神經(jīng)元形態(tài)觀察 A 組神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)清晰完整，胞核較大且呈圓形，有數(shù)量較多的尼氏小體；B組神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)溶解壞死，存活的神經(jīng)元形態(tài)各異大小不一，尼氏小體數(shù)量相較于A組明顯減少；C組神經(jīng)元細(xì)胞相較于B組細(xì)胞核清晰，壞死細(xì)胞減少，尼氏小體數(shù)量增多，見圖6。

圖6 SCI后14 d脊髓組織尼氏染色圖

3 討論

SCI 后的繼發(fā)性損傷是指脊髓破壞后，由免疫失衡、自由基誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡等引起的瀑布放大式組織自毀級聯(lián)反應(yīng)，會導(dǎo)致?lián)p傷區(qū)域擴(kuò)大，使癱瘓擴(kuò)展到更高節(jié)段，其損毀程度遠(yuǎn)大于脊髓破壞本身[12]。因此，抑制SCI 后由免疫失衡引起的炎癥反應(yīng)對促進(jìn)SCI 修復(fù)具有重要意義。16S rRNA 測序結(jié)果中，損傷組Bacteroidetes 和Saccharibacteria數(shù)量減少，Proteobacteria數(shù)量增加，使損傷組腸道菌群平衡失調(diào)。Proteobacteria包括很多病原菌，如沙門氏菌、霍亂弧菌、幽門螺桿菌等都對人體有害。而Bacteroidetes可以產(chǎn)生短鏈脂肪酸，其作為能源物質(zhì)，可糾正電解質(zhì)，降低神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB 的活化，進(jìn)而減少促炎因子的釋放從而保護(hù)神經(jīng)元[13]，因此，糾正SCI 后的腸道菌群紊亂具有潛在的治療作用。本實(shí)驗(yàn)使用FMT 治療維持腸道菌群平衡后發(fā)現(xiàn)，C 組BBB 評分比損傷組有明顯提高，提示維持腸道菌群平衡對SCI 后神經(jīng)功能恢復(fù)有促進(jìn)作用。但大鼠體重經(jīng)FMT治療后并沒有顯著升高，可能的原因是治療時(shí)間不夠，體重回升較慢。HE 染色和尼氏染色結(jié)果顯示，SCI后組織存在炎性浸潤，出現(xiàn)了神經(jīng)元細(xì)胞溶解壞死，尼氏小體數(shù)量急劇減少，經(jīng)過FMT 治療后，脊髓組織中炎性反應(yīng)減少，壞死細(xì)胞數(shù)量減少，尼氏小體數(shù)量增加，提示FMT 療法可改善脊髓組織的形態(tài)與功能。

免疫失衡導(dǎo)致的炎癥是繼發(fā)性SCI中主要的損害因素之一。SCI 時(shí)可激活神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞等產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子（IL-17、TNF-α）、趨化因子（MCP-1、MCP-2）、金屬蛋白酶等，進(jìn)一步攻擊脊髓組織[14]。其中IL-17 可通過激活NF-kB 信號通路促進(jìn)各種細(xì)胞因子的表達(dá)[15]，引起炎性級聯(lián)放大反應(yīng)，加重SCI。IL-10主要由調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分泌，對TNFα、IL-17等促炎因子起到抑制作用，進(jìn)而阻斷小膠質(zhì)細(xì)胞的抗原呈遞功能以及減少星形膠質(zhì)分泌炎性因子[16]。IL-4 主要由活化T 細(xì)胞產(chǎn)生，在炎癥反應(yīng)中起到抗炎作用[17]，可緩解炎癥因子對脊髓組織的破壞。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SCI 組脊髓組織中的促炎因子IL-17含量上升，而抗炎因子IL-10和IL-4含量下降，經(jīng)FMT 治療后，IL-17 的釋放得到抑制，含量較SCI 組有明顯下降，而IL10 和IL-4 含量升高，提示FMT療法能夠有效抑制炎癥反應(yīng)，降低脊髓繼發(fā)性損傷帶來的危害。

綜上所述，F(xiàn)MT 療法能夠降低SCI 后脊髓組織中的炎癥反應(yīng)，減少由IL-17 引起的炎性級聯(lián)放大效應(yīng)，通過調(diào)控免疫平衡從而抑制脊髓繼發(fā)性損傷中的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而在SCI的治療中發(fā)揮重要作用。