基于指紋圖譜及多成分含量測定的黔產(chǎn)金釵石斛花質(zhì)量控制研究

田 鑫，李 堯，鹿廣玲，李桂琳，張建永，段燦燦

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院藥物分析教研室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099；3.云南省德宏熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，云南 瑞麗 678600)

金釵石斛為蘭科石斛屬石斛(DendrobiumnobileLindl.)的新鮮或干燥莖，是2020版中國藥典石斛收載的3個(gè)主要品種之一[1-2]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》有記載“金釵石斛主治傷中，除痹，下氣，補(bǔ)五臟虛勞贏瘦，強(qiáng)陰。久服厚腸胃。輕身延年。”認(rèn)為其有益胃生津、滋陰清熱等功效[3]。金釵石斛在我國主要分布于貴州、四川、云南、廣西、海南和臺灣等地，以貴州赤水產(chǎn)為最佳，為“道地藥材”[4]。中國藥材種植資源普查結(jié)果顯示，國內(nèi)現(xiàn)階段僅有貴州赤水符合金釵石斛的野外種植條件，該地區(qū)也是我國金釵石斛的主產(chǎn)區(qū)[5]。金釵石斛主要的化學(xué)成分按結(jié)構(gòu)類型可分為生物堿、糖苷、菲、倍半萜、聯(lián)芐等類[6]。金釵石斛具有多種藥理活性，如抗腫瘤、降血糖和血脂、抗白內(nèi)障、保肝和抗疲勞等[7-12]。目前金釵石斛的主要藥用部位是莖，而對于花等部位的開發(fā)不夠，大量資源被浪費(fèi)。民間金釵石斛花現(xiàn)多被用作茶飲，現(xiàn)已被列為貴州食品地方標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)包括了性狀、感官要求、污染物限量及水分、灰色等理化檢測，同時(shí)規(guī)定其所含石斛堿含量不得低于0.4 %。目前對金釵石斛花所含具體化學(xué)成分的研究較少，質(zhì)量控制方法目前也僅有一篇指紋圖譜的專利[13]，其僅指認(rèn)出D-無水葡萄糖這一種成分，這一研究尚不夠全面。本研究擬建立黔產(chǎn)金釵石斛花高效液相色譜(HPLC)的指紋圖譜，探索其化學(xué)成分的含量，為建立黔產(chǎn)金釵石斛花質(zhì)量控制方法提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀，配備G1315D可變波長檢測器(美國Agilent公司)；KQ-300VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；沃特浦超純水設(shè)備(四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司)；SpectraMax Plus 384酶標(biāo)儀(美谷分子儀器有限公司)；十萬分之一電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；電子天平(上海菁海儀器有限公司)；恒溫水浴槽(杭州佑寧儀器有限公司)。

1.2 試藥 甲醇(色譜純，阿拉丁試劑)，乙腈(色譜純，阿拉丁試劑)，甲醇(分析純，成都金山化學(xué)試劑有限公司)，乙醇(分析純，重慶萬盛川東化工有限公司)，乙酸(分析純，成都金山化學(xué)試劑有限公司)；對照品蘆丁(分析純，純度≥98 %，批號AF9022006)、甘草苷(分析純，純度≥98 %，批號AF8111195)、山柰酚-3-葡萄糖鼠李糖苷(分析純，純度≥98 %，批號AF20050831)，均購自成都埃法生物科技有限公司；對照品異槲皮苷(分析純，純度≥98 %，批號Y-076-180517)購自成都瑞芬思生物科技有限公司。

1.3 樣品信息 14批赤水金釵石斛花均為2020年收集，樣品信息見表1，其中S1～S9來自公司，S10～S14來自不同農(nóng)戶。S1、S2、S6、S9號樣品為凍干處理，其余均為烘干處理。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent Eclipse Plus C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流動(dòng)相A為乙腈，B為0.06 %醋酸-水；梯度洗脫，洗脫程序見表2；檢測波長：280 nm；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量2 μL。

表2 梯度洗脫表

2.2 指紋圖譜研究

2.2.1 供試品溶液的制備 精密稱取干燥的金釵石斛花0.5 g于錐形瓶中，加入35.00 mL 70 %甲醇，稱重，搖勻，超聲60 min(45 kHz，90 %)，冷卻至室溫后再稱重，用70 %甲醇補(bǔ)足損失的重量，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，得到供試品溶液。

2.2.2 方法學(xué)考察 (1)儀器精密度試驗(yàn) 取S1(赤水市信天中藥產(chǎn)業(yè)開發(fā)有限公司凱旋基地，批號20200505)金釵石斛花樣品溶液，在同樣的的色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，考察色譜峰相似度的一致性，記錄13個(gè)主要共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積，并分別計(jì)算它們間的 RSD 值。利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)(2012.130723版本)，進(jìn)行相似度的評價(jià)。結(jié)果表明：6次測定的13個(gè)共有峰的相對保留時(shí)間的RSD均小于0.26 %，各色譜峰相對主要峰面積的RSD %<3.5 %，相似度均達(dá)到1.000，儀器精密度良好。

(2)重復(fù)性試驗(yàn) 取6份S1干燥金釵石斛花，按相同的方法制成供試品溶液，在同樣的色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算各個(gè)主要色譜峰保留時(shí)間RSD值，考察色譜峰相似度的一致性，記錄13個(gè)主要共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積，并分別計(jì)算它們間的 RSD 值。利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)，進(jìn)行相似度的評價(jià)。結(jié)果表明：6次測定的13個(gè)共有峰的相對保留時(shí)間的RSD均小于0.26 %，各色譜峰相對峰面積所對應(yīng)成分含量的RSD %<4.0 %，相似度均大于0.999，方法重復(fù)性良好。

(3)穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S1干燥金釵石斛花提取液分別在0、4、8、12、16、20、24 h 不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測，同樣的色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣7次，考察色譜峰相似度的一致性，記錄13個(gè)主要共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積，并分別計(jì)算它們間的 RSD 值。利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)，進(jìn)行相似度的評價(jià)。結(jié)果表明：13個(gè)共有峰的相對保留時(shí)間的RSD均小于0.44 %，各色譜峰相對峰面積的RSD %<4.6 %，相似度均大于0.999，樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.2.3 金釵石斛花樣品HPLC指紋圖譜的建立 取各金釵石斛花樣品，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣分析。共選出13個(gè)特征峰(13個(gè)主要共有峰峰面積之和大于總峰面積的78.7 %)，以S1為對照圖譜，時(shí)間窗寬度為0.1，得到14份樣品的重疊的HPLC指紋圖譜，見圖1和圖2。

圖1 對照指紋圖譜

圖2 14批赤水金釵石斛花樣品的HPLC指紋圖譜

2.2.4 金釵石斛花樣品HPLC指紋圖譜相似度評價(jià) 通過中位數(shù)矢量計(jì)算各金釵石斛花樣品指紋圖譜和對照指紋圖譜的相似度，結(jié)果14批金釵石斛花相似度為0.954～0.993，表明相似度良好(見表3)。

表3 14份金釵石斛花樣品指紋圖譜相似度計(jì)算結(jié)果

2.3 金釵石斛花樣品總黃酮含量的測定 經(jīng)過對照品比對，發(fā)現(xiàn)金釵石斛花中可能含有黃酮類成分，因此對14批金釵石斛花樣品中的總黃酮含量進(jìn)行測定。

2.3.1 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 準(zhǔn)確稱取5.07 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，置于25 mL容量瓶中，加60 %乙醇完全溶解定容，得質(zhì)量濃度為0.2028 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。分別吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0.00 mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL、6.00 mL于25 mL容量瓶中，加入5 % NaNO2溶液1.00 mL，搖勻，靜置7 min。加入10 % Al(NO3)3溶液1.00 mL，搖勻靜置7 min。加入1 mol/L NaOH溶液10.00 mL，搖勻靜置12 min后用體積分?jǐn)?shù)為60 %乙醇定容至刻度，搖勻靜置10 min，于波長510 nm處測吸光度值。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=6.2223X- 0.0061(r=0.9991)。

2.3.2 不同樣品總黃酮含量的測定 取各金釵石斛花樣品溶液1.00 mL，置于25 mL容量瓶中，同上述步驟操作，重復(fù)測定3次吸光度值，取平均值，代入標(biāo)曲，計(jì)算得到金釵石斛花樣品溶液中的總黃酮含量，S10含量最高為0.082 g/g，S1和S2含量最低為0.054 g/g。具體吸光度數(shù)值及總黃酮含量值見表4。

表4 14批金釵石斛花樣品總黃酮含量

2.4 金釵石斛花中三種黃酮類成分的含量測定

2.4.1 對照品溶液的配制 單一對照品溶液的配制：分別準(zhǔn)確稱取適量甘草苷、山柰酚-3-葡萄糖鼠李糖苷、異槲皮苷于3個(gè)5 mL容量瓶中，加70 %甲醇定容至刻度，超聲振蕩、搖勻，得到濃度分別為0.209、0.105和0.241 mg/mL的單一對照品貯備液，進(jìn)樣前過0.22 μm微孔濾膜。

混合對照品溶液的配制：分別準(zhǔn)確稱取甘草苷、山柰酚-3-葡萄糖鼠李糖苷、異槲皮苷0.21 mg、0.66 mg、0.20 mg于5 mL容量瓶中，加70 %甲醇定容至刻度，超聲振蕩、搖勻，即得混合對照品溶液，進(jìn)樣前過0.22 μm微孔濾膜。

2.4.2 供試品溶液的制備 同“2.2.1”。

2.4.3 專屬性考察 分別將空白溶劑(70 %甲醇)、3個(gè)單一對照品溶液、混合對照品溶液、樣品(S1)溶液按色譜條件進(jìn)樣測定，見圖3。由圖3可知，金釵石斛花供試品溶液所測成分甘草苷、山柰酚-3-葡萄糖鼠李糖苷、異槲皮苷色譜峰保留時(shí)間和對照品溶液中所測各成分的保留時(shí)間一致，其他成分對測定無干擾，且溶劑對測定無干擾。表明實(shí)驗(yàn)條件專屬性良好。

A：空白溶劑(70 %甲醇)；B：甘草苷；C：山柰酚-3-葡萄糖鼠李糖苷；D：異槲皮苷；E：3個(gè)對照品的混標(biāo)；F：金釵石斛花樣品(S1)。

2.4.4 線性關(guān)系考察 精密量取混合對照品溶液1.00、2.00、5.00、10.00、15.00、20.00 μL 注入高效液相色譜儀，測定。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各混合對照品的回歸方程、線性范圍和回歸系數(shù)，結(jié)果顯示各成分在一定濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，結(jié)果見表5。

表5 三種黃酮對照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4.5 精密度試驗(yàn) 取同一混合對照品溶液，在色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，測得3個(gè)對照品峰面積，分別計(jì)算保留時(shí)間和峰面積的RSD值。結(jié)果甘草苷、山柰酚-3-葡萄糖鼠李糖苷、異槲皮苷保留時(shí)間的RSD值分別為：0.24 %、0.25 %和0.24 %；峰面積的RSD值分別為：1.81 %、0.53 %和2.98 %。表明儀器精密度良好。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批次金釵石斛花樣品(S1)，制備供試品溶液，在相同色譜條件下，分別于0、4、8、12、16、20、24 h 進(jìn)樣，測得3個(gè)對照品峰面積，分別計(jì)算保留時(shí)間和峰面積的RSD值。結(jié)果甘草苷、山柰酚-3-葡萄糖鼠李糖苷、異槲皮苷保留時(shí)間的RSD值分別為：0.29 %、0.26 %和0.43 %；峰面積的RSD值分別為：2.85 %、2.90 %和4.53 %。表明供試品溶液在24 h內(nèi)檢測質(zhì)量穩(wěn)定。

2.4.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次金釵石斛花樣品(S1)6份，制備供試品溶液，在相同色譜條件下進(jìn)樣，分別計(jì)算保留時(shí)間和峰面積的RSD值。結(jié)果甘草苷、山柰酚-3-葡萄糖鼠李糖苷、異槲皮苷保留時(shí)間的RSD值分別為：0.22 %、0.25 %和0.24 %；甘草苷、山柰酚-3-葡萄糖鼠李糖苷、異槲皮苷含量的RSD值分別為：3.75 %、3.60 %和1.91 %。表明該方法的重復(fù)性良好。

2.4.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定已知含有量的同一樣品粉末(S1)0.25 g，共9份，分別按1∶0.8、1∶1、1∶1.2 的比例精密加入混合對照品溶液，在上述色譜條件下測定，記錄各成分的峰面積，計(jì)算回收率。回收率=(C-A)/B×100 %，A為樣品所含被測成分的質(zhì)量，B為加入對照品質(zhì)量，C為實(shí)測質(zhì)量。結(jié)果見表6，甘草苷、山柰酚-3-葡萄糖鼠李糖苷和異槲皮苷的平均回收率分別是100.5 %、103.4 %和100.0 %，RSD分別為1.4 %、1.3 %和2.1 %，表明該方法回收率良好。

表6 金釵石斛花中3種黃酮類成分的加樣回收率試驗(yàn)

續(xù)表

2.4.9 三種黃酮類成分的含量測定結(jié)果 取14批金釵石斛花樣品，按2.2.1所述方法制備供試品溶液，在2.1項(xiàng)色譜條件下依次分析，分別將甘草苷、山柰酚-3-葡萄糖鼠李糖苷、異槲皮苷的峰面積代入線性回歸方程，計(jì)算其含量，結(jié)果見表7。

表7 14批金釵石斛花中三種黃酮類成分含量

2.5 模式識別分析 應(yīng)用Simca-P 14.1軟件，以共有峰的峰面積為變量，進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果見圖4。14批金釵石斛花藥材被分為2類：Ⅰ類包括S1、S2、S6、S9號樣品，其中其中S1產(chǎn)自赤水市凱旋鎮(zhèn)，S2和S9均產(chǎn)自赤水市官渡鎮(zhèn)，S6產(chǎn)自赤水市長期鎮(zhèn)，此類樣品均為凍干方式制成；Ⅱ類包括S3～S5、S7～S8、S10～S14號樣品，其中S3和S11產(chǎn)自赤水市長沙鎮(zhèn)，S4和S14產(chǎn)自赤水市旺隆鎮(zhèn)，S5產(chǎn)自赤水市復(fù)興鎮(zhèn)，S7和S10產(chǎn)自赤水市長期鎮(zhèn)，S8和S13產(chǎn)自赤水市官渡鎮(zhèn)，S12產(chǎn)自赤水市石堡鄉(xiāng)，此類樣品均為烘干方式制成，由此說明相同產(chǎn)地不同批次間差異較小。Ⅰ類和Ⅱ類樣品表明不同處理方式的樣品存在差異。產(chǎn)自農(nóng)戶的S10～S14號樣品均在Ⅱ類。

圖4 聚類分析圖

3 討論

3.1 色譜條件的考察 本研究考察了Agilent Eclipse Plus C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)、Thermo AcclaimTM120 C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)和Agilent Eclipse XDB C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)三個(gè)色譜柱與254、280、360 nm三種檢測波長，結(jié)果表明，Agilent Eclipse Plus C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)柱效更好，且在280 nm時(shí)樣品溶液具有較好的峰形。此外實(shí)驗(yàn)中考察了醋酸水-甲醇、醋酸水-乙腈、磷酸水-甲醇和磷酸水-乙腈等不同流動(dòng)相體系，結(jié)果表明，在0.06 %醋酸水-乙腈流動(dòng)相體系下，出峰時(shí)間最合適，特征峰能達(dá)到分離度要求，色譜圖基線較平穩(wěn)，峰對稱性好。

3.2 樣品處理方法的考察 在其余條件相同的情況下，本實(shí)驗(yàn)中先考察了40 %、70 %、100 %乙醇提取樣品的情況，根據(jù)峰形和峰面積選擇最優(yōu)提取溶劑百分比。再用此百分比的甲醇同法操作，測定結(jié)果與該百分比的乙醇結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以70 %甲醇作為提取溶劑時(shí)，樣品的峰形最好，特征峰總面積最大。

在其余條件相同的情況下，實(shí)驗(yàn)中考察了超聲30、60、90 min后的樣品提取情況，發(fā)現(xiàn)提取60 min時(shí)樣品的特征峰總面積最大。

在其余條件相同的情況下，實(shí)驗(yàn)中分別考察了以超聲、冷浸、65 ℃水浴回流60 min后對樣品的提取情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)水浴回流提取的樣品特征峰總面積僅略微高于超聲提取的樣品特征峰總面積，從易于操作和效率等方面綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)選擇超聲提取法。

3.3 金釵石斛花指紋圖譜分析 前期金釵石斛花指紋圖譜專利[13]已經(jīng)建立了HPLC指紋圖譜，確定了26個(gè)特征峰，定性了D-無水葡萄糖1個(gè)成分，對于金釵石斛花的質(zhì)量控制具有重要作用，但該成分特征性不強(qiáng)。本研究在上述研究的基礎(chǔ)上，采用HPLC法，建立全新的金釵石斛花指紋圖譜，共標(biāo)定13個(gè)共有峰，指認(rèn)了其中甘草苷、山柰酚-3-葡萄糖鼠李糖苷和異槲皮苷3個(gè)成分。與此同時(shí)還對這3個(gè)黃酮類成分和總黃酮含量進(jìn)行了定量分析，是對金釵石斛花指紋圖譜的有效補(bǔ)充。

3.4 金釵石斛莖與花化學(xué)成分的異同點(diǎn) 金釵石斛莖目前報(bào)道的主要的化學(xué)成分按結(jié)構(gòu)類型可分為生物堿、糖苷、菲、倍半萜、聯(lián)芐、黃酮等類[6]，其中莖中的黃酮類成分主要為異甘草苷[14]和芹菜素-6-C-α-鼠李糖-8-C-β-葡萄糖苷[15]。而對于金釵石斛花，前期研究多集中于其揮發(fā)性成分，結(jié)構(gòu)類型主要為烯烴、酯、醇、醛類等[16]，而對于其中的黃酮類成分未見報(bào)道。本研究首次采用對照品比對方法發(fā)現(xiàn)金釵石斛花中的甘草苷、山柰酚-3-葡萄糖鼠李糖苷、異槲皮苷等黃酮類成分，可為后續(xù)深入研究提供參考。

4 結(jié)論

本研究建立了金釵石斛花HPLC指紋圖譜，并建立了總黃酮和三種黃酮類成分的含量測定方法。本研究可為下一步制定金釵石斛花的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。