Linc00941高表達(dá)通過激活TGF-β1/SMAD信號(hào)通路促進(jìn)胃癌的惡性生長

董 敏，鄭桂麗，王振國，仲 晨

(1.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第960醫(yī)院 腫瘤科，山東 濟(jì)南 250000；2.武警特色醫(yī)學(xué)中心 醫(yī)研部，天津 300162)

胃癌(GC)是臨床最常見的一種腫瘤，其發(fā)病率和死亡率很高，是世界上癌癥死亡的第二大原因[1]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的報(bào)告，每年確診的新病例超過95萬例，其中約90%處于晚期，大多數(shù)患者僅在GC的晚期才被診斷出，而且即使行根治性切除術(shù)，患者仍有很高的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)[2]。盡管GC的臨床治療取得了一些進(jìn)展，但由于GC的高復(fù)發(fā)率，其5年生存率仍低于25%[3]。因此，在GC中尋找可靠的生物標(biāo)記物對(duì)于GC的早期診斷和臨床治療具有重要的意義。長非編碼RNA(lncRNA)是功能性非編碼RNA分子，長度超過200個(gè)核苷酸，并且沒有蛋白質(zhì)編碼能力。LncRNA曾經(jīng)被認(rèn)為是基因組的“沉默物質(zhì)”，但是近年來的積累研究表明，哺乳動(dòng)物中存在大量的lncRNA，通過多種生物途徑的表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平，在調(diào)控基因表達(dá)中起著重要的作用[4]。有研究表明lncRNA在分化的組織或特定類型的癌癥中獨(dú)特表達(dá)，還有研究表明 lncRNA與腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移和患者的預(yù)后相關(guān)[5]。越來越多的證據(jù)表明， lncRNA的異常表達(dá)與GC的癌變和進(jìn)展密切相關(guān)，其中Linc00941被認(rèn)為在胃癌、肺癌、結(jié)腸癌等組織中過表達(dá)[6-7]。然而Linc00941在胃癌中的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源及分組 腫瘤標(biāo)本來源于2016年5月至2019年5月我院手術(shù)的91例胃癌患者；納入標(biāo)準(zhǔn)：初次診斷胃癌并于我院行手術(shù)治療且病理診斷為胃癌者，年齡28～68歲，ASA Ⅰ或Ⅱ級(jí)，BMI 18～30 kg/m2，無心血管疾患，肝腎功能正常，未接受化療；排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他腫瘤者，合并其他臟器嚴(yán)重病變者，不能配合臨床實(shí)驗(yàn)者；其中高分化和中分化設(shè)為低度惡性組(LGC group，n=31)，低分化設(shè)為高度惡性組(HGC group，n=60)，正常對(duì)照(Control group，n=91)取癌旁距離腫瘤>5cm的正常胃黏膜組織；為評(píng)估Linc00941與患者無瘤生存的影響，根據(jù)Linc00941表達(dá)水平將患者分為Linc00941低表達(dá)組(LLGC group，n=45)和Linc00941高表達(dá)組(HLGC group，n=46)。所有患者排除合并嚴(yán)重臟器損害者，術(shù)前均未行化療或放療，術(shù)后均有完整的病理診斷。本研究獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(審批號(hào)：201604001)，所有患者或家屬均簽署知情同意書。

1.2 試劑和材料 胃癌細(xì)胞系HS-746T購自上海中科院細(xì)胞庫；Linc00941 Inhibitor、Linc00941-NC及RT-PCR引物由賽默飛公司合成；RNA提取試劑盒( R0036)購自碧云天生物科技(北京)有限公司，RT-qPCR試劑盒(QR0100)、MTT(TOX1)、Trizol(T9424)及去RNA酶試劑購自sigma公司；TGF-β1 (ab142139)、SMAD4(ab95455)和GAPDH(ab8245)抗體購自Abcam 公司； Tranwell小室、細(xì)胞培養(yǎng)板及計(jì)數(shù)板購自美國康寧公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶購自Gibco公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(Sham group)、陰性對(duì)照組(NC group)和Linc00941抑制組(Inhibit group)。轉(zhuǎn)染AAVrh.10 siRNA和AAVrh.10 Negative進(jìn)入HS-746T細(xì)胞。根據(jù)細(xì)胞的密度進(jìn)行換液或者傳代。每次傳代時(shí)，加入2.5μg/mL嘌呤霉素繼續(xù)篩選穩(wěn)定的細(xì)胞株。24h后將細(xì)胞一部分用于后續(xù)的RT-qPCR、Transwell等實(shí)驗(yàn)。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR 按照使用說明，使用TRIZOL試劑從腫瘤組織中獲取總mRNA，按照靶基因Linc00941正向5'-ACCACTACACTCAGCCAAATAC-3'，反向5'-GGCTATCAACTGTCTCCTTTAGAC-3'特異性引物的序列，使用RT-qPCR RT試劑盒分析Linc00941表達(dá)量，數(shù)據(jù)以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法分析。

1.5 Western blot 分別破碎腫瘤組織和細(xì)胞提取蛋白質(zhì)，蛋白分離轉(zhuǎn)膜后封閉， 4°C條件下分別與一抗TGF-β1(1∶10 000)、SMAD4(1∶10 000)和GAPDH(1∶10 000)孵育過夜。洗膜后與山羊抗兔二抗(1∶2 000)在室溫下孵育1 h。使用ECL試劑盒檢測條帶，以GAPDH為內(nèi)參，使用ImageJ 1.42q軟件程序分析圖像。

1.6 MTT增殖試驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞懸液約100 μL ，37 ℃、5% CO2條件下，在具有完全培養(yǎng)基的96 孔板中培養(yǎng)至約2×105/孔。用20 μL 的MTT處理后，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加150 μL DMSO終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測定各孔在490 nm 處的吸光值。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn) 利用無血清DMEM培養(yǎng)基重懸，取對(duì)數(shù)生長期各組細(xì)胞懸液200 μL(約1×104/mL)加入Transwell小室中，培養(yǎng)24 h后，結(jié)晶紫染色薄膜下層細(xì)胞后，置于顯微鏡下計(jì)數(shù)拍照。

2 結(jié)果

2.1 Linc00941表達(dá)水平與胃癌的關(guān)系 與正常對(duì)照組相比，高度惡性組和低度惡性組的Linc00941表達(dá)水平明顯升高(P<0.001)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且高度惡性組的Linc00941表達(dá)水平明顯高于低度惡性組(P<0.001，見圖1 A)；按照胃癌病理分級(jí)分3級(jí)，2級(jí)和3級(jí)Linc00941 mRNA表達(dá)水平明顯高于1級(jí)(P=0.029,P<0.001)，且3級(jí)組Linc00941 mRNA表達(dá)水平明顯高于2級(jí)組(P<0.001，見圖1B)；Linc00941表達(dá)水平與胃癌病理分級(jí)正相關(guān)(r=0.602，P<0.001，見圖1C)。

2.2 胃癌組織中TGF-β1、SMAD4表達(dá)水平及其與Linc00941的關(guān)系 與對(duì)照組相比，低度惡性組和高度惡性組TGF-β1、SMAD4蛋白表達(dá)水平均明顯升高[低度惡性組(P<0.001)，高度惡性組(P<0.001)]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且HGC組表達(dá)水平高于LGC組(P=0.035，P<0.001)(見圖2A、B)。在低度惡性組、高度惡性組和所有患者組中Linc00941 mRNA值與TGF-β1、SMAD4值均呈正相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

表1 Linc00941與TGF-β1/SMAD4相關(guān)性

2.3 患者臨床資料 91例患者中男性46例，女性45例，平均年齡為31～72歲，中位數(shù)65歲，隨訪時(shí)間為27～63個(gè)月。Lauren分型：腸型54例，彌漫型37例；腫瘤浸潤肌層28例，浸潤漿膜及漿膜外層63例；高分化5例，中分化26例，低分化60例，51例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，40例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，TNM分期Ⅰ期20例、Ⅱ期33例、Ⅲ期30例、Ⅳ期8例。按照Linc00941的表達(dá)情況將患者分為低表達(dá)組(45例)和高表達(dá)組(46例)，兩組患者性別、年齡沒有差異，具有可比性。兩組患者腫瘤的Lauren分型、浸潤程度比較沒有差異(P>0.05)；兩組患者腫瘤的分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移、TNM分期之間存在明顯差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

表2 胃癌組織中Linc00941表達(dá)與臨床病理特征

2.4 Linc00941表達(dá)水平與總生存期的影響 根據(jù)Linc00941表達(dá)水平將胃癌患者分為Linc00941低表達(dá)組(LLGC組，n=45)和Linc00941高表達(dá)組(HLGC組，n=46)， Linc00941高表達(dá)組生存率低于Linc00941低表達(dá)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.016，見圖1)。

圖3 Linc00941表達(dá)與胃癌患者預(yù)后生存關(guān)系

2.5 Linc00941沉默抑制HS-746T細(xì)胞增殖和侵襲 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沉默48 h對(duì)照組與陰性對(duì)照組細(xì)胞增值率沒有差異(P=0.506)，Linc00941抑制組細(xì)胞增值率明顯低于其他兩組(P=0.002，P=0.047，見圖4A)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組(157±12)組和陰性對(duì)照組(149±18)相比穿膜細(xì)胞數(shù)沒有差別(P=0.386)，而Linc00941沉默陰性對(duì)照組的HS-746T穿膜細(xì)胞數(shù)(67±5)較其他兩組明顯降低(P<0.001，見圖4B)。

A：MTT實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞增殖率；B：Transwell實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞穿膜數(shù)，紫色標(biāo)記細(xì)胞核；放大倍數(shù)均為400倍；**：與Sham組相比， P<0.01，#：與NC組相比，P<0.05。

2.6 Linc00941沉默抑制TGF-β1、SMAD4表達(dá) 與對(duì)照組相比， 陰性對(duì)照組的Linc00941 mRNA沒有顯著差別(P=0.566)，與對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，Inhibit組的Linc00941 mRNA表達(dá)水平均明顯下降(P<0.001，見圖 5A)。與 Linc00941抑制組相比，陰性對(duì)照組的TGF-β1、SMAD4蛋白表達(dá)沒有顯著差別(P=0.937，P=0.818)，與對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比， Linc00941抑制組TGF-β1、SMAD4蛋白表達(dá)水平均明顯下降[TGF-β1(P=0.017，P=0.049)，SMAD4(P=0.015，P=0.012)](見圖 5B、C)。

*：與Sham組相比， P<0.05； **：與Sham組相比，P<0.01；#：與NC組相比，P<0.05；##：與NC組相比，P<0.01。

3 討論

LncRNA是當(dāng)前非編碼RNA研究熱點(diǎn)，幾乎參與所有的表觀遺傳調(diào)控，約占人類全部基因的98%[4]。越來越多的證據(jù)表明，LncRNA在各種人類疾病和癌癥中起著至關(guān)重要的作用[8]。胃癌作為高發(fā)病率和高死亡率的腫瘤類型之一，尋找新的可靠的生物標(biāo)志物對(duì)其診斷和治療具有重要意義。有研究發(fā)現(xiàn)Linc00941被認(rèn)為是肺腺癌、結(jié)腸癌、甲狀腺癌的候選生物標(biāo)志物[6-7,9]。Bhan等[8]在Cancer RNA-Seq Nexus數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)Linc00941的表達(dá)水平在胃癌組織的大多數(shù)階段也顯著上調(diào)。Luo等[10]通過qRT-PCR確認(rèn)胃癌與正常胃組織中Linc00941的差異表達(dá)。然而仍不清楚Linc00941在胃癌組織中差異表達(dá)的機(jī)制，為此，本研究結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)展開進(jìn)一步的探索。

LncRNA通常以RNA-蛋白質(zhì)相互作用影響基因表達(dá)[11]。因此，本研究深入研究可與LINC00941相互作用的蛋白。TGF-β1/SMAD信號(hào)通路是EMT的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，SMAD4是重要的輔因子，可與活化的SMAD2和SMAD3結(jié)合形成調(diào)節(jié)目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄的寡聚復(fù)合物[12-13]。鑒于LINC00941對(duì)于SMAD4穩(wěn)定性很重要，并且LINC00941包含預(yù)測的TGF-β1靶向位點(diǎn)(http://www.gene-regulation.com/index2.html)，本研究評(píng)估了LINC00941在TGF-β1/ SMAD信號(hào)通路中的作用。既往的研究表明，EMT與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)，lncRNAs可以通過影響EMT來調(diào)節(jié)癌癥轉(zhuǎn)移[14-16]。而在肝細(xì)胞癌中Linc00941的高表達(dá)可顯著促進(jìn)EMT和組織的惡性生長，并且激活TGF-β1相關(guān)的信號(hào)通路[17]?？紤]到EMT對(duì)胃癌的惡性進(jìn)展具有促進(jìn)作用，本研究分析91例患者胃癌組織與正常胃組織的Linc00941表達(dá)水平，以及EMT相關(guān)的TGF-β1、SMAD蛋白表達(dá)情況。結(jié)果表明，胃癌組織的Linc00941表達(dá)水平較正常胃組織明顯升高，且與腫瘤的惡性度呈正相關(guān)，胃癌組織中EMT相關(guān)的TGF-β1、SMAD4表達(dá)水平均明顯升高，與腫瘤的惡性度呈正相關(guān)。按照Linc00941表達(dá)水平將91例胃癌患者分為Linc00941高表達(dá)組(HLGC組)和Linc00941低表達(dá)組(LLGC組)，根據(jù)隨訪結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HLGC組的預(yù)后生存低于LLGC組。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)Linc00941表達(dá)水平與TGF-β1、SMAD4表達(dá)水平正相關(guān)。

為進(jìn)一步揭示胃癌細(xì)胞中Linc00941對(duì)EMT的生物學(xué)功能，本研究采用胃癌細(xì)胞系HS-746T進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沉默Linc00941后TGF-β1、SMAD4蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)，MTT和Transwell實(shí)驗(yàn)表明HS-746T細(xì)胞的增殖和侵襲能力下降。我們的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，LINC00941可以直接結(jié)合SMAD4，SMAD4是轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素，也是TGF-β誘導(dǎo)的EMT不可或缺的效應(yīng)子[18]。在BC裸鼠模型中，SMAD4沉默顯著減弱骨轉(zhuǎn)移并延長生存期[19]。此外，SMAD4可以與SMAD3相互作用，與SNAIL-1形成復(fù)合物，該復(fù)合物在TGF-β誘導(dǎo)的EMT期間充當(dāng)BC中Ecadherin啟動(dòng)子的核心抑制劑[20]。這些研究結(jié)果表明，LINC00941可能通過影響EMT調(diào)控胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲。然而本研究仍然存在一些局限性，Linc00941對(duì)胃癌作用的具體生物學(xué)機(jī)制仍然需要進(jìn)一步研究。

總之，通過上述研究發(fā)現(xiàn)Linc00941在胃癌中起著重要的致癌作用， TGF-β1/SMAD信號(hào)通路的EMT作用可能是Linc00941的作用途徑之一。