沙庫巴曲纈沙坦對(duì)急性心梗大鼠心功能及脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2表達(dá)水平的影響

周廣志,劉愛軍,張永林,錢文浩

(1.徐州醫(yī)科大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院,江蘇 徐州 221004 ; 2.濱?？h人民醫(yī)院 心血管內(nèi)科,江蘇 鹽城 224500 ; 3.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科,江蘇 徐州 221000)

急性心肌梗死可激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(Renin angiotensin aldosterone system，RASS)，升高血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)水平，激活血管緊張素Ⅱ受體(Angiotensin receptor，AT)，改變心臟結(jié)構(gòu)，降低心臟功能，進(jìn)而發(fā)展為心力衰竭[1-2]。目前，臨床上治療心衰主要是依靠利尿劑、RASS抑制劑和β受體拮抗劑，近年研究顯示，沙庫巴曲纈沙坦是一種新型的抗心衰藥物，對(duì)心力衰竭有一定的治療作用[3]。沙庫巴曲纈沙坦的優(yōu)勢在于纈沙坦可以拮抗AT，同時(shí)沙庫巴曲在體內(nèi)的活性代謝產(chǎn)物L(fēng)BQ657為腦咖肽酶抑制劑，可有效提高體內(nèi)的利鈉肽水平[4-5]。脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2(Iipoprotein-associated phospholipase A2，Lp-PLA2)是炎性因子分泌出的一種酶類物質(zhì)，通過對(duì)炎癥的促進(jìn)作用，進(jìn)而導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[6-7]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Lp-PLA2和超敏C反應(yīng)蛋白(Highly sensitive C-reactive protein，Hs-CRP)是新發(fā)現(xiàn)的炎癥因子，其不僅與血栓的形成和動(dòng)脈粥樣硬化的破裂有密切的關(guān)系，而且也可對(duì)心血管不良事件的發(fā)生進(jìn)行獨(dú)立的預(yù)測。劉長召等[8]研究發(fā)現(xiàn)，AMI患者病情的嚴(yán)重程度，可依據(jù)Lp-PLA2的表達(dá)水平來進(jìn)行判斷。Cahyaningtias等[9]研究也證實(shí)，AMI患者的病情越嚴(yán)重，Lp-PLA2和hs-CRP的水平就越高。此外，Lp-PLA2可介導(dǎo)血管的新生，但Lp-PLA2和hs-CRP在心肌梗死血漿中的表達(dá)情況尚不清楚，因此本文用沙庫巴曲纈沙坦對(duì)心肌梗死大鼠進(jìn)行干預(yù)治療，并觀察其對(duì)AMI大鼠的心功能和Lp-PLA2表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量220 g～240 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SCXK(滬)2017-0005。常溫下飼養(yǎng)大鼠，讓大鼠適應(yīng)7 d新環(huán)境。

1.2 試劑和儀器 Novartis公司生產(chǎn)的沙庫巴曲纈沙坦；Gibco公司生產(chǎn)的DMEM；武漢天源生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的TTC溶液；動(dòng)物心電圖機(jī)和動(dòng)物呼吸機(jī)均由浙江醫(yī)科大學(xué)醫(yī)療儀器設(shè)備廠提供；SANYO公司生產(chǎn)的低溫冰箱；美國Sigma公司生產(chǎn)的臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)；沈陽龍騰電子有限公司生產(chǎn)的電子天平。

1.3 動(dòng)物分組與模型建立 把30只大鼠隨機(jī)分為Sham組(假手術(shù)組)；AMI組(急性心肌梗死大鼠模型組)；VALS組(給予沙庫巴曲纈沙坦干預(yù)的急性心肌梗死大鼠模型組)，每組10只。麻醉所有大鼠后進(jìn)行氣管插管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)和動(dòng)物心電圖機(jī)。消毒手術(shù)部位，于左側(cè)第3、4肋骨間打開胸腔，暴露左心耳邊緣區(qū)域，用5-0帶線縫合針結(jié)扎左心耳前下方2 mm部位。當(dāng)觀察到大鼠左室前壁的心肌部分發(fā)白，收縮功能明顯變?nèi)酰碾妶D機(jī)上顯示ST段有顯著的升高時(shí)，說明成功造模。Sham組除了對(duì)左冠狀動(dòng)脈前降支不接扎外，其它的手術(shù)步驟和其它兩組相同。手術(shù)后3組大鼠連續(xù)注射3 d青霉素溶液，以防止術(shù)后有感染情況發(fā)生。

造模成功后，VALS組大鼠給予20 mg/kg沙庫巴曲纈沙坦灌胃干預(yù)治療， Sham組和AMI組大鼠給予等體積的生理鹽水，3組大鼠均按照1 d 1次進(jìn)行連續(xù)干預(yù)4周。

1.4 標(biāo)本采集 心功能測定后，分別采取3組大鼠尾靜脈血液0.5 mL，離心后收集大鼠血清，-70 ℃保存?zhèn)溆谩Ｌ幩来笫蠛笕〈笫笮募〕霈F(xiàn)梗死的組織，Sham組大鼠取相同部位組織，固定于4 %多聚甲醛溶液中，用于心肌組織形態(tài)學(xué)觀察。

1.4.1 大鼠心功能指標(biāo)測定 給藥結(jié)束后麻醉所有大鼠，檢測大鼠心功能指標(biāo)，包括LVEDD、LVESD、LVEF和LVFS，以上4項(xiàng)指標(biāo)均測量3 次，取平均值。

1.4.2 大鼠血漿Lp-PLA2、hs-CRP水平的測定 給藥結(jié)束后1 d，分別取出3組大鼠的靜脈血，測定血漿中的Lp-PLA2、hs-CRP水平。分別檢測3 次，最后取平均值。實(shí)驗(yàn)步驟均按照說明書嚴(yán)格進(jìn)行。

1.4.3 大鼠體重、左心室質(zhì)量、左室質(zhì)量指數(shù)測定 分別測量3組大鼠的體重后，均靜脈注射3 mL的氯化鉀溶液，直到心臟停止在舒張期后，打開胸部并取出心臟，剪掉左心房、右心房和大血管，用生理鹽水沖洗，取出的游離壁，濾紙吸干左心室上面的水分，再次稱取質(zhì)量。

1.4.4 心肌組織病理學(xué)形態(tài)觀察 心臟檢測后，處死各組大鼠，取出大鼠梗死組織，用多聚甲醛進(jìn)行固定，24 h后把固定好的組織進(jìn)行石蠟包，切片，切片的厚度為4 μm，脫蠟后進(jìn)行HE染色并進(jìn)行觀察。

1.4.5 心肌梗死面積測定 在-20 ℃的環(huán)境中冷藏各組大鼠心臟，15 min后取出心臟。把心臟切成薄片，每片的厚度在2 mm之內(nèi)，用TTC溶液染色組織薄片。紅色為正常的心肌組織，灰白色則為梗死的心肌組織。用軟件對(duì)大鼠的心肌圖像進(jìn)行分析，測定梗死區(qū)的面積，Sham組測定相同位置，計(jì)算心肌梗死區(qū)的面積及占左心室面積的百分比。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠心功能指標(biāo)比較 AMI組大鼠的LVEDD和LVESD值明顯高于Sham組，VALS組LVEDD和LVESD值顯著低于AMI組(P<0.05)；AMI組大鼠的LVEF和LVFS水平顯著降低，VALS組LVEF和LVFS水平較AMI顯著增加(P<0.05，見表1)。

表1 3組大鼠心功能比較

2.2 3組大鼠血漿Lp-PLA2、hs-CRP水平比較 Sham組大鼠Lp-PLA2和hs-CRP水平分別為(260.6±25.3)ng/mL和(1.52±0.72)mg/L；和Sham組相比較，AMI組大鼠Lp-PLA2水平(447.3±50.3)ng/mL、hs-CRP水平(9.01±6.82)mg/L顯著升高(P<0.05)；和AMI組相比，干預(yù)后的VALS組大鼠血漿中Lp-PLA2水平(365.5±37.6)ng/mL、hs-CRP水平(2.78±0.76)mg/L均得到明顯抑制(P<0.05，見圖1)。

A：Lp-PLA2濃度；B：hs-CRP濃度；*：與Sham組相比，P<0.05；#：與AMI組相比，P<0.05。

2.3 3組大鼠大鼠體重、左心室質(zhì)量及左室質(zhì)量指數(shù)比較 和Sham組相比，AMI組大鼠的體重、左心室質(zhì)量和左室質(zhì)量指數(shù)明顯增加(P<0.05)；VALS組大鼠體重、左心室質(zhì)量和左室質(zhì)量指數(shù)明顯低于AMI組(P<0.05，見表2)。

表2 各組大鼠體重、左心室重量、左室重量指數(shù)

2.4 3組大鼠心肌組織病理學(xué)形態(tài)比較 圖2A、B、C分別是Sham組、AMI組、VALS組 3組大鼠心肌組織HE染色。結(jié)果顯示：和Sham組大鼠相比，AMI組大鼠梗死區(qū)可見典型的心肌損傷，大量的心肌細(xì)胞出現(xiàn)腫脹，細(xì)胞核出現(xiàn)了嚴(yán)重的破裂，心肌纖維斷裂和間質(zhì)充血嚴(yán)重，有大量的炎性細(xì)胞浸潤到梗死區(qū)周圍組織；而VALS組大鼠的心肌組織情況比AMI組明顯改善(見圖2)。

A：Sham組；B：AMI組；C：VALS組。

2.5 3組大鼠心肌梗死面積比較 與Sham組相比，AMI組大鼠心肌梗死面積及心肌梗死面積/左心室面積均升高(P<0.05)；和AMI組相比，VALS組心肌梗死面積顯著減少，心肌梗死面積/左心室面積的百分比也明顯降低(P<0.05，見圖3)。

A：心肌梗死面積；B：心肌梗死面積/左心室面積； *：與Sham組相比，P<0.05；#：與AMI組相比，P<0.05。

3 討論

急性心肌梗死后的心力衰竭與心室重構(gòu)密切相關(guān)，及時(shí)的心肌缺血再灌注治療可有效預(yù)防心肌梗死后心室重構(gòu)，從而改善患者的心功能和預(yù)后[10-11]。然而，心肌梗死患者即使已接受PCI治療，心肌梗死后心衰的發(fā)生率仍然很高，其中一個(gè)重要的原因是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)、交感神經(jīng)系統(tǒng)與利鈉肽(NP)系統(tǒng)等神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的激活[12]。沙庫巴曲纈沙坦由ARB類藥物纈沙坦與腦啡肽酶抑制劑沙庫巴曲兩種成分以1∶1摩爾比例結(jié)合而成，可以對(duì)抗RAAS系統(tǒng)，提高體內(nèi)利鈉肽水平，從而預(yù)防、延緩或逆轉(zhuǎn)急性心肌梗死后的心室重構(gòu)[13-14]。

Lueder等[15]利用大鼠進(jìn)行的一項(xiàng)研究顯示，沙庫巴曲纈沙坦和纈沙坦在最高劑量下均對(duì)心臟成纖維細(xì)胞有抑制作用，而在最低劑量時(shí)，添加LBQ657( 沙庫巴曲在體內(nèi)的活性代謝產(chǎn)物) 可以顯著增強(qiáng)最低劑量纈沙坦對(duì)心肌肥大的抑制作用，因此推測ARNI可通過抑制心肌纖維化和心肌肥大來減輕心肌梗死后的心臟重構(gòu)和功能障礙。Kompa等[16]于大鼠身上進(jìn)行的研究表明，與ACEI相比，ARNI在心肌梗死后對(duì)心臟有更好的保護(hù)作用，可以減輕心臟的擴(kuò)張，提高LVEF，改善心臟收縮功能，減少心肌肥大標(biāo)志物的表達(dá)。本研究構(gòu)建急性心肌梗死大鼠模型，心功能指標(biāo)結(jié)果顯示AMI組大鼠的心功能明顯減退。有研究證實(shí)，當(dāng)大鼠出現(xiàn)心肌梗死后，其心室壁的僵硬程度顯著增加，并且大鼠的舒張功能明顯減退。心肌梗死的發(fā)生也會(huì)造成心肌細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的凋亡，進(jìn)而改變心臟收縮壓。本研究對(duì)VALS組大鼠用沙庫巴曲纈沙坦干預(yù)后發(fā)現(xiàn)AMI組大鼠心臟指數(shù)增加，且心肌組織出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷；干預(yù)后的VALS組大鼠的心肌組織比AMI組得到了明顯改善，提示，沙庫巴曲纈沙坦可有效改善心肌梗死大鼠心肌組織所發(fā)生的病理改變，同時(shí)改善左室重塑。牛瀟玉等[17]研究證實(shí)，與培哚普利相比，沙庫巴曲纈沙坦能有效減輕心力衰竭患者的臨床癥狀，進(jìn)而改善心功能。

Lp-PLA2是由炎性細(xì)胞所分泌的一種酶，能激活血管中的炎性反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，AMI組大鼠Lp-PLA2和hs-CRP水平較Sham組明顯升高。急性心肌梗死的發(fā)生會(huì)導(dǎo)致心肌組織發(fā)生缺血、缺氧，同時(shí)激活組織中的各種炎性反應(yīng)，最終導(dǎo)致炎性細(xì)胞浸潤到心肌組織中。當(dāng)心肌組織被單核細(xì)胞浸潤后，其會(huì)逐漸轉(zhuǎn)化成巨噬細(xì)胞，進(jìn)而吞噬壞死的組織碎片[18]。與此同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)氧化低密度脂蛋白會(huì)被巨噬細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的Lp-PLA2完全吸收，進(jìn)而促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)，導(dǎo)致心肌細(xì)胞大量壞死、凋亡。Lp-PLA2在生化代謝過程中相對(duì)穩(wěn)定，所以準(zhǔn)確測量Lp-PLA2水平能有效的判定組織中炎癥反應(yīng)程度[19]。IL-6等多種細(xì)胞炎癥因子能夠通過對(duì)活化巨噬細(xì)胞和肝臟細(xì)胞的刺激生成CRP，對(duì)機(jī)體內(nèi)的炎癥程度能及時(shí)且準(zhǔn)確的反應(yīng)，其中hs-CRP是一種極其敏感的生化指標(biāo)。VALS組大鼠通過沙庫巴曲纈沙坦干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，該組大鼠的Lp-PLA2和hs-CRP水平顯著降低，可見沙庫巴曲纈沙坦可顯著降低大鼠血清中的炎癥因子的表達(dá)，減少炎癥細(xì)胞的浸潤。沙庫巴曲纈沙坦具有雙重作用機(jī)制,其主要成分為沙庫巴曲及纈沙坦，前者為腦啡肽酶抑制劑，可催化降解多種肽類，該藥物可通過前藥沙庫巴曲的活性代謝產(chǎn)物抑制腦啡肽酶，抑制腦利鈉肽(BNP)降解，提升其水平，進(jìn)而改善血壓，抑制心肌肥厚和炎癥因子的表達(dá)，減輕心臟負(fù)荷，后者為血管緊張素受體拮抗劑，抑制血管緊張素Ⅱ依賴性醛固酮釋放，從而降低心血管死亡的風(fēng)險(xiǎn)[20]。張相杰等[21]通過對(duì)心力衰竭患者研究發(fā)現(xiàn)，沙庫巴曲纈沙坦能有效的改善心功能，阻礙心室重塑，降低炎癥因子的表達(dá)，減少心力衰竭的發(fā)生。

綜上所述，沙庫巴曲纈沙坦可改善急性心肌梗死大鼠心功能，抑制血漿中炎性因子Lp-PLA2和hs-CRP的水平，對(duì)心肌組織起到保護(hù)作用。