糧食中嘔吐毒素的檢測(cè)能力驗(yàn)證結(jié)果分析

◎ 劉天左，戚培培，周 露，王 林，張冰清

（國(guó)家有機(jī)食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（江蘇），江蘇 揚(yáng)州 225800）

嘔吐毒素，又稱脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，縮寫DON），化學(xué)名稱3α,7α,15-三羥基-12,13-環(huán)氧單端孢霉-9-蒽-8-酮，屬單端孢霉稀族化合物。嘔吐毒素是鐮刀菌屬的菌種引起的谷物赤霉病的重要指示性毒素，因其可引起豬的嘔吐而得名嘔吐毒素[1-2]。嘔吐毒素的污染狀況與產(chǎn)生毒素的毒株、溫度、濕度、通風(fēng)以及日照等因素有關(guān)。嘔吐毒素屬于劇毒或中等毒物，當(dāng)人攝入了被嘔吐毒素污染的食物后，可能會(huì)導(dǎo)致嘔吐、腹瀉、頭疼以及頭暈等以消化系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)為主的中毒癥狀，嚴(yán)重時(shí)損害造血系統(tǒng)造成死亡，其慢性毒性對(duì)胃癌細(xì)胞、免疫系統(tǒng)有一定影響，且有明顯胚胎毒性和一定致畸作用。由于中國(guó)傳統(tǒng)飲食習(xí)慣中糧谷比例大大高于西方，使得嘔吐毒素的危害尤為突出。1998年，在國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)公布的評(píng)價(jià)報(bào)告中，嘔吐毒素被列為3類致癌物[3]。因此，對(duì)嘔吐毒素的檢測(cè)關(guān)系到糧食、食品、飼料多個(gè)領(lǐng)域的安全問(wèn)題。

目前，我國(guó)現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2017）規(guī)定谷物及其制品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的限量為1 000 μg·kg-1，《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》（GB 13078—2017）規(guī)定植物性飼料原料中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的限量為5 mg·kg-1。目前，嘔吐毒素的常見的檢測(cè)方法有薄層色譜法（TLC）、高效液相色譜法（HPLC）、柱凈化法結(jié)合電子捕獲檢測(cè)器的氣相色譜法（GC/ECD）、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）、放射性免疫測(cè)定法（RIA）以及酶聯(lián)免疫吸附篩查法（ELISA）等[4]。而此次能力驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)采用的方法是免疫親和層析凈化高效液相色譜法。

能力驗(yàn)證是指利用實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)，按照預(yù)先制定的計(jì)劃來(lái)評(píng)價(jià)參加者的一項(xiàng)外部質(zhì)量控制活動(dòng)。參加能力驗(yàn)證不僅能夠確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室自身的技術(shù)能力，還能通過(guò)與外部實(shí)驗(yàn)室的橫向比對(duì)，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室自身存在的問(wèn)題并加以整改，以進(jìn)一步提升檢測(cè)能力[5]。本次實(shí)驗(yàn)室參加的能力驗(yàn)證計(jì)劃由國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局組織，大連海關(guān)技術(shù)中心負(fù)責(zé)協(xié)調(diào)及實(shí)施。參加本次能力驗(yàn)證目的是了解和評(píng)價(jià)本實(shí)驗(yàn)室對(duì)糧食及食品中嘔吐毒素含量檢測(cè)的能力和水平，促進(jìn)和提升本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)糧食及食品中嘔吐毒素的技術(shù)能力和水平，規(guī)范實(shí)驗(yàn)室管理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米粉，4份：由大連海關(guān)技術(shù)中心提供的能力驗(yàn)證樣品，計(jì)劃編號(hào)CNCA-21-03，樣品編號(hào)分別為39906、54202、03311、17610，其中39906號(hào)和54202號(hào)用于檢驗(yàn)?zāi)芰υu(píng)估，03311號(hào)和17610號(hào)為干擾樣品。質(zhì)控樣品：玉米粉中嘔吐毒素含量檢測(cè)質(zhì)控樣品（1.4±0.4）mg·kg-1，k=2，大連海關(guān)技術(shù)中心。

甲醇，色譜級(jí)，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；聚乙二醇（相對(duì)分子質(zhì)量為8 000；阿拉?。徊ＡЮw維濾紙（WHATMAN）；嘔吐毒素免疫親和柱（ROMER DON StarTM)；磷酸鹽緩沖溶液（以下簡(jiǎn)稱PBS）：稱取8.00 g氯化鈉、1.20 g磷酸氫二鈉、0.20 g磷酸二氫鉀、0.20 g氯化鉀，用900 mL水溶解，調(diào)pH=7.0，用水定容到1 000 mL；標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)品：嘔吐毒素（1ST7213-100A-S070305，F(xiàn)irst Standand）。

1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜儀配二極管陣列檢查器（Agilent 1200，美國(guó)安捷倫）；C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；混合圓周振蕩器（KS-60，德國(guó)IKA）；高速離心機(jī)（BIOFUGE STRATOS，Thermo Fisher）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 檢測(cè)方法

按照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙?；苌锏臏y(cè)定》（GB 5009.111—2016）第二法免疫親和層析凈化高效液相色譜法[6]，并參照作業(yè)指導(dǎo)書要求。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

吸取1 mL嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品（100 μg·mL-1）于10 mL容量瓶中，用甲醇-水（20∶80，V/V）定容為10 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)使用液，吸取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)使用液0.1 mL、0.4 mL、1 mL、2 mL、5 mL分別到10 mL容量瓶中用甲醇 -水（20∶ 80，V/V）定容，得到 0.1 μg·mL-1、0.4 μg·mL-1、1 μg·mL-1、2 μg·mL-1、5 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：C18，4.6 mm×150 mm，5 μm；柱溫：35 ℃；流動(dòng)相：甲醇-水（20∶80，V/V）；流速：1 mL·min-1；進(jìn)樣量：50 μL；檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器（DAD）；檢測(cè)波長(zhǎng)：218 nm。

1.3.4 樣品提取

稱取25 g左右玉米粉樣品于100 mL具塞三角瓶中，加入5 g聚乙二醇，加100 mL水，混勻，混合圓周振蕩器振蕩20 min，以玻璃纖維濾紙過(guò)濾至濾液澄清，收集濾液于干凈的離心管中，10 000 r·min-1離心5 min。

1.3.5 樣品凈化

事先將低溫下保存的免疫親和柱恢復(fù)至室溫，待免疫親和柱內(nèi)原有液體流盡后，準(zhǔn)確移取上述濾液2.0 mL于免疫親和柱中。調(diào)節(jié)下滴速度，控制樣液以每秒1滴的流速通過(guò)免疫親和柱，直至空氣進(jìn)入親和柱中。用5 mL PBS緩沖鹽溶液和5 mL水先后淋洗免疫親和柱，流速約為每秒1～2滴，直至空氣進(jìn)入親和柱中，棄去全部流出液，抽干小柱。準(zhǔn)確加入2 mL甲醇洗脫親和柱，控制每秒1滴的下滴速度，收集全部洗脫液至試管中，在50 ℃下用氮?dú)饩従彽貙⑾疵撘捍抵两?，加?.0 mL甲醇-水（20∶80，V/V）溶液，渦旋30 s溶解殘留物，0.45 μm濾膜過(guò)濾，收集濾液于進(jìn)樣瓶中以備進(jìn)樣。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)選擇濃度線性范圍為0.1～5 μg·mL-1，將嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)系列溶液按照濃度由低到高依次注入液相色譜儀，以目標(biāo)物嘔吐毒素的濃度（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。濃度與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為y=53.764 68x+1.073 46，相關(guān)系數(shù)為0.999 92。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 質(zhì)控樣品測(cè)定

為驗(yàn)證方法的可靠性，稱取玉米粉質(zhì)控樣按照上述實(shí)驗(yàn)條件測(cè)定玉米粉質(zhì)控樣品中嘔吐毒素的含量。質(zhì)控樣品平行進(jìn)樣2次，測(cè)定結(jié)果見表1。檢測(cè)結(jié)果在質(zhì)控范圍內(nèi)，滿足實(shí)驗(yàn)要求。

表1 質(zhì)控樣品測(cè)定結(jié)果表

2.3 能力驗(yàn)證結(jié)果

測(cè)試結(jié)果以μg·kg-1為單位上報(bào)，保留到小數(shù)點(diǎn)后一位，每份樣品重復(fù)測(cè)定兩次，取平均值。樣品編號(hào)分別為 39906、54202、03311、17610，其中 39906號(hào)和54202號(hào)用于檢驗(yàn)?zāi)芰υu(píng)估，03311號(hào)和17610號(hào)為干擾樣品，嘔吐毒素能力驗(yàn)證報(bào)告也給出了干擾樣品的Z值參考。

能力驗(yàn)證結(jié)果見表2。能力驗(yàn)證評(píng)定原則為|Z|小于3時(shí)，參加機(jī)構(gòu)的結(jié)果合格，因此根據(jù)嘔吐毒素能力驗(yàn)證結(jié)果報(bào)告給出的本實(shí)驗(yàn)室結(jié)果的Z值，本次能力驗(yàn)證結(jié)果為合格。

表2 嘔吐毒素能力驗(yàn)證結(jié)果表

3 結(jié)論與討論

對(duì)能力驗(yàn)證結(jié)果影響的因素有很多，實(shí)驗(yàn)前應(yīng)充分考慮到人、機(jī)、料、法、環(huán)及測(cè)各個(gè)環(huán)節(jié)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，安排經(jīng)驗(yàn)豐富的實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行試驗(yàn)，本次嘔吐毒素測(cè)定時(shí)要注意以下幾方面。

（1）收到樣品后應(yīng)該避光密封保存，開封后，應(yīng)該旋緊封蓋，并置于密封袋中，防止樣品被污染。

（2）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在定量分析中有至關(guān)重要的作用，本次實(shí)驗(yàn)室參加能力驗(yàn)證使用了有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，純度符合要求定量時(shí)測(cè)試樣品濃度落在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。

（3）嘔吐毒素樣品前處理過(guò)程中主要有兩個(gè)方面對(duì)結(jié)果影響較大，一方面是提取過(guò)程，振蕩或超聲的時(shí)間一定要夠，如果可以的話，上均質(zhì)機(jī)均值會(huì)更好；另一方面是免疫親和柱的選擇，本次實(shí)驗(yàn)采用的是ROMER的DONStarTM免疫親和柱，柱容量高達(dá)2 500 ng，因此能完全適用本次能力驗(yàn)證，如果使用柱容量較小的免疫親和柱，會(huì)使測(cè)試的結(jié)果偏低。

（4）為保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，本次能力驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)室在操作中采用了同時(shí)帶質(zhì)控樣品的形式進(jìn)行質(zhì)量控制。

（5）嘔吐毒素有較強(qiáng)的毒性并且是3類致癌物，因此實(shí)驗(yàn)人員在操作時(shí)必須進(jìn)行必要的個(gè)人防護(hù)，同時(shí)妥善處理好試驗(yàn)后的廢棄物，以防二次污染。