高效液相色譜法測(cè)定番茄醬中乙二胺四乙酸二鈉

◎ 烏吉木

（巴彥淖爾市產(chǎn)品質(zhì)量計(jì)量檢測(cè)中心，內(nèi)蒙古 巴彥淖爾 015000）

乙二胺四乙酸二鈉，也可稱作EDTA-2Na，是一種重要的絡(luò)合劑，能絡(luò)合亞鐵離子。它不僅能作為真空采血管中的血液抗凝劑，還可以用在食品添加劑方面，控制聚合反應(yīng)快慢，通常作為螯合劑、防腐劑和抗氧化劑等來(lái)使用。EDTA-2Na不僅能阻止食品由于金屬離子作用而出現(xiàn)的腐敗、變質(zhì)，還能有效地遏制維生素C被氧化，減少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失，同時(shí)還能夠阻止油脂的過(guò)氧化值升高、口感變差。

但是過(guò)量乙二胺四乙酸二鈉對(duì)人體有害，其每日允許最大攝入量為0.205 mg·kg-1。美國(guó)對(duì)乙二胺四乙酸二鈉有嚴(yán)格的限量要求，如液體狀多種維生素制劑不得超過(guò)150 mg·kg-1（與鐵離子一起作為液體狀多種維生素制劑中維生素B12的穩(wěn)定劑）、罐裝黑斑豆不得超過(guò)145 mg·kg-1（護(hù)色）、罐裝菜豆不得超過(guò)165 mg·kg-1（護(hù)色）?！妒称钒踩珖?guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）規(guī)定醬菜和罐頭不得超過(guò)0.25 g·kg-1[1]。在不同介質(zhì)中乙二胺四乙酸二鈉的測(cè)定方法有比色法、滴定法、高效液相色譜法以及離子色譜法等[2-5]。比色法和滴定法無(wú)法定性只能定量，高效液相色譜法既能定性又能定量，因此本文通過(guò)高效液相色譜法對(duì)乙二胺四乙酸二鈉-Fe標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)外標(biāo)法定性定量，根據(jù)方程計(jì)算出乙二胺四乙酸二鈉-Fe絡(luò)合物的含量，也就是乙二胺四乙酸二鈉的含量[6-13]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇，色譜級(jí)；乙酸，色譜級(jí)；鹽酸，分析純；四丁基溴化銨，分析純；乙酸鈉，分析純；三氯甲烷，分析純；三氯化鐵，分析純；水，去離子水。

乙二胺四乙酸二鈉標(biāo)準(zhǔn)品，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，編號(hào)GBW（E）060025d，批號(hào)1504，規(guī)格40 g，純度99.95%

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260高效液相色譜儀（配有二極管陣列檢測(cè)器）；電子天平，感量為0.1 mg和0.01 g；離心機(jī)，轉(zhuǎn)速≥7 500 r·min-1；渦旋振蕩器；超聲波清洗機(jī)；微孔濾膜（0.45 μm）。

1.3 儀器條件

色譜柱：Agilent XDB-C18，柱長(zhǎng)250 mm，內(nèi)徑4.6 mm，粒徑5.0 μm；流動(dòng)相比例：A-四丁基溴化銨-乙酸鈉混合溶液90%，B-甲醇10%；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：10～20 μL；柱溫：35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 試劑配制

（1）三氯化鐵溶液。將0.54 g三氯化鐵，溶于90 mL去離子水中，加入0.1 mL鹽酸，100 mL容量瓶定容充分搖勻。

（2）四丁基溴化銨-乙酸鈉混合溶液。稱取6.45 g四丁基溴化銨、2.46 g乙酸鈉加20 mL乙酸,用水定容至1 000 mL。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

（1）標(biāo)準(zhǔn)液的制備。乙二胺四乙酸二鈉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1 000 μg·mL-1）：精確稱取 0.1 g（精確至0.000 1 g）乙二胺四乙酸二鈉標(biāo)準(zhǔn)品，放入100 mL容量瓶，用去離子水溶解并定容。

（2）標(biāo)準(zhǔn)工作液。分別吸取乙二胺四乙酸二鈉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.05 mL、0.02 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.50 mL及1.00 mL，分別用水定容至100 mL、10 mL、10 mL、10 mL、10 mL 及 10 mL，配制成 0.5 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1、50.0 μg·mL-1及100.0 μg·mL-1濃度的乙二胺四乙酸二鈉標(biāo)準(zhǔn)系列溶液（配制系列需加FeCl3溶液1 mL，再用水定容）。

1.4.3 樣品處理

（1）樣品提取。準(zhǔn)確稱取5 g（精確至0.01 g）試樣于50 mL離心管中，加入15 mL水，渦旋混合提取10 min，然后加三氯甲烷20 mL溶液，渦旋混合提取10 min，4 000 r·min-1離心 10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL玻璃具塞比色管（容量瓶）中，再用15 mL水重復(fù)提取2次，合并提取液于50 mL具塞玻璃比色管中[14]。

（2）樣品衍生化。向上述樣品提取液中加1mL FeCl3溶液渦旋混合、超聲20 min，用水定容至刻度。

（3）樣品凈化。準(zhǔn)確移取10 mL上述衍生化樣品溶液于50 mL具塞玻璃離心管中，加入5 mL三氯甲烷，在渦旋混合器上混合10 min，4 000 r·min-1離心5 min。上清液用0.45 μm濾膜過(guò)濾，濾液供液相色譜測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系

如圖1所示，在上述方法條件下，標(biāo)準(zhǔn)系列在0.5～100.0 μg·mL-1呈線性關(guān)系，通過(guò)計(jì)算峰面積（y）與濃度（x，μg·mL-1）得線性方程公式為y=14.698 36x+0.395 69，相關(guān)系數(shù)r=0.999 992，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明線性范圍良好。

圖1 標(biāo)液線性關(guān)系圖

2.2 空白及乙二胺四乙酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2、圖3所示，在上述試驗(yàn)儀器條件下，試劑空白圖無(wú)雜峰出現(xiàn)，標(biāo)液出峰良好，理論塔板高。

圖2 乙二胺四乙酸二鈉空白色譜圖

圖3 乙二胺四乙酸二鈉標(biāo)液出峰色譜圖

2.3 精密度及回收率

空白番茄醬樣品中加入濃度為1 000 μg·mL-1的乙二胺四乙酸二鈉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.15 mL和1.00 mL，進(jìn)行2個(gè)水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，測(cè)定含量分別為0.03 g·kg-1和0.20 g·kg-1。每個(gè)濃度試樣水平平行測(cè)定8次，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），見(jiàn)表1。當(dāng)加標(biāo)濃度為 0.03 g·kg-1時(shí)，8 次測(cè)量平均值為 0.024 90 g·kg-1，回收率平均值為82.93%；當(dāng)加標(biāo)濃度為0.20 g·kg-1時(shí)，8次測(cè)量平均值為0.183 0 g·kg-1，回收率平均值為91.48%。

表1 番茄醬加標(biāo)回收數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表

2.4 檢出限的測(cè)定

以儀器的S/N=3計(jì)算，測(cè)得該方法乙二胺四乙酸二鈉的最低檢出限，結(jié)果如表2所示。用外延法計(jì)算該實(shí)驗(yàn)室本檢驗(yàn)方法檢出限。用番茄醬加標(biāo)0.01 g·kg-1進(jìn)行檢出限測(cè)定，乙二胺四乙酸二鈉方法檢出限是0.002 g·kg-1。

表2 最低檢出限測(cè)定數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表

2.5 樣品處理方法的選擇

根據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中乙二胺四乙酸鹽的測(cè)定》（GB 5009.278—2016）的前處理方法，樣品加入水提取之后絡(luò)合，經(jīng)混合陰離子固相萃取柱凈化時(shí)樣品中的雜質(zhì)與乙二胺四乙酸二鈉競(jìng)爭(zhēng)吸附柱易導(dǎo)致回收不理想。因?yàn)橐叶匪囊宜岫c絡(luò)合物易溶于水，所以用水來(lái)提取效果好，成本也低。由于番茄醬基質(zhì)復(fù)雜，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，不容易分離，還有可能堵塞儀器，故提取液中加入一定量的三氯甲烷，乙二胺四乙酸二鈉不易溶于有機(jī)溶劑，三氯甲烷可以與水分層，溶解樣品中的雜質(zhì)，起到非常好的凈化效果，且提取液中加入還原劑使乙二胺四乙酸二鈉與三氯化鐵形成絡(luò)合物，經(jīng)過(guò)再次凈化去除雜質(zhì)測(cè)定時(shí)能夠達(dá)到很好的回收率和分離效果，見(jiàn)圖4、圖5。

圖4 番茄醬中無(wú)乙二胺四乙酸二鈉出峰色譜圖

圖5 番茄醬中加乙二胺四乙酸二鈉出峰色譜圖

2.6 儀器條件的選擇

根據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中乙二胺四乙酸鹽的測(cè)定》（GB 5009.278—2016）規(guī)定的色譜條件，乙二胺四乙酸二鈉-Fe需要在較低的pH環(huán)境下測(cè)定，本實(shí)驗(yàn)探索了3種流動(dòng)相條件，分別加入磷酸調(diào)節(jié)四丁基溴化銨-乙酸鈉混合溶液的pH=4.0、pH=2.5，加入20 mL乙酸調(diào)節(jié)四丁基溴化銨-乙酸鈉混合溶液進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)表明加入20 mL乙酸沒(méi)有測(cè)定pH的混合溶液對(duì)乙二胺四乙酸二鈉-Fe分離效果最好，見(jiàn)圖2、圖3。

2.7 色譜條件選擇

WatersSunFire-C18、Tnature-C18、Phenomenex-C18和Agilent XDB-C18作為液相色譜柱和A-四丁基溴化銨-乙酸鈉混合溶液、B-甲醇（A∶B=90∶10）作為流動(dòng)相進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明，Agilent XDB-C18對(duì)乙二胺四乙酸二鈉-Fe和干擾物能夠達(dá)到很好的分離效果，通過(guò)調(diào)整流速和流動(dòng)相比例對(duì)EDTA的出峰時(shí)間進(jìn)行調(diào)整。

本試驗(yàn)中標(biāo)液用A-四丁基溴化銨-乙酸鈉混合溶液，B-甲醇（A∶B=85∶15）作為流動(dòng)相，流速0.8 mL·min-1出峰良好，試驗(yàn)中采用以上條件對(duì)未添加乙二胺四乙酸二鈉的番茄原醬進(jìn)行檢測(cè)，譜圖中雜質(zhì)峰與標(biāo)液EDTA峰重合，容易造成誤判。A-四丁基溴化銨-乙酸鈉混合溶液，B-甲醇（A∶B=90∶10）作為流動(dòng)相，流速1.0 mL·min-1可以達(dá)到很好的分離效果。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了高效液相色譜法測(cè)定番茄醬中添加劑乙二胺四乙酸二鈉的前處理方法和高效液相色譜檢測(cè)方法，通過(guò)對(duì)樣品前處理?xiàng)l件的調(diào)整，使樣品只要進(jìn)行溶液渦旋液液萃取加以衍生，即可對(duì)乙二胺四乙酸二鈉的含量進(jìn)行測(cè)定，流動(dòng)相采用乙酸不需要調(diào)節(jié)pH值，且不易造成色譜柱堵塞。本方法簡(jiǎn)單、快速、重復(fù)性和回收率較好，具有較高的準(zhǔn)確度和精密度，能實(shí)現(xiàn)檢測(cè)番茄醬中乙二胺四乙酸二鈉的需要，可為食品中檢測(cè)乙二胺四乙酸二鈉提供實(shí)際操作和技術(shù)參考。