亞硝酸鹽含量分光光度法不確定度評定

◎ 司徒茵，凌育昕

（1.廣東省食品工業(yè)研究所有限公司，廣東 廣州 511442；2.廣東省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗站，廣東 廣州 511442；3.廣東省食品工業(yè)公共實驗室，廣東 廣州 511442）

亞硝酸鹽是一種比較典型的肉制品護(hù)色劑，在對其進(jìn)行應(yīng)用的過程中可以和肉類中的肌紅蛋白發(fā)生相應(yīng)的反應(yīng)，呈現(xiàn)出比較明顯的色澤優(yōu)化效果，同時也可以使肉的風(fēng)味得到進(jìn)一步的豐富和完善，另外還可以起到防腐的效果。部分不法商家添加過量的亞硝酸鹽，導(dǎo)致食物中毒事件頻發(fā)，迫切需要為檢驗人員提供具有指導(dǎo)性的控制要點，從而提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。要建立腌臘肉制品中亞硝酸鹽分光光度法測定不確定度的數(shù)學(xué)模型，通過數(shù)學(xué)模型對測定中不確定度來源進(jìn)行分析計算，為有效控制腌臘肉制品中亞硝酸鹽含量測定的質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

亞鐵氰化鉀溶液（106 g·L-1）：稱取106.0 g亞鐵氰化鉀，用水溶解，并稀釋至1 000 mL。乙酸鋅溶液（220 g·L-1）：稱取220.0 g乙酸鋅，先加30 mL冰乙酸溶解，用水稀釋至1 000 mL。飽和硼砂溶液（50 g·L-1）：稱取5.0 g硼酸鈉，溶于100 mL熱水中，冷卻后備用。對氨基苯磺酸溶液（4 g·L-1）：稱取0.4 g對氨基苯磺酸，溶于100 mL 20%鹽酸中，混勻，置棕色瓶中，避光保存。鹽酸萘乙二胺溶液（2 g·L-1）：稱取0.2 g鹽酸萘乙二胺，溶于100 mL水中，混勻，置棕色瓶中，避光保存。亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液液（100 mg·L-1，以氮計）。

1.2 儀器與設(shè)備

組織搗碎機(jī)，電子天平，分光光度計[1]。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品提取與凈化

取代表性樣品用組織搗碎機(jī)充分搗碎，確稱取已經(jīng)絞碎均勻的試樣5 g（精確至0.001 g），置于250 mL具塞錐形瓶中，加入12.5 mL 50 g·L-1的飽和硼砂，加入70 ℃水150 mL，對其進(jìn)行混合均勻，然后在沸水中對其進(jìn)行加熱處理，大約15 min后取出，冷水中進(jìn)行冷卻，放到室溫的條件下，將提取液轉(zhuǎn)至200 mL容量瓶中，加入5 mL亞鐵氰化鉀（106 g·L-1），再進(jìn)一步搖晃均勻融入5 mL乙酸鋅（200 g·L-1）溶液，使蛋白質(zhì)沉淀下來。加水定容，搖勻，再放置30 min左右，把上面的脂肪進(jìn)行有效去除，同時用過濾液體和濾紙對其進(jìn)行相對應(yīng)的過濾，把初過濾的液體進(jìn)行去除，并且準(zhǔn)備好相對應(yīng)的濾液，為后續(xù)的準(zhǔn)備工作提供必要支持。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

分別吸取0 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL和2.5 mL水中亞硝酸氮標(biāo)準(zhǔn)使用液（相當(dāng)于 0 μg、0.2 μg、0.4 μg、0.6 μg、0.8 μg、1.0 μg、1.5 μg、2.0 μg 和 2.5 μg 水中亞硝酸氮）及 40.0 mL 試樣提取液于50 mL比色管中，于標(biāo)準(zhǔn)管和比色管中分別加入2 mL對氨基苯磺酸（4 g·L-1），混勻，放置3～5 min后各加入1 mL鹽酸萘乙二胺（2 g·L-1），加水至刻度線，搖勻，放置15 min，用1 cm比色皿，以零管調(diào)節(jié)零點，于波長538 nm處測其吸光度，以吸光度A為縱軸，亞硝酸氮的質(zhì)量為橫軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時做試劑空白[2]。

2 數(shù)學(xué)模型

式中：X-試樣中亞硝酸鈉的含量，mg·kg-1；A-試樣中亞硝酸鈉的吸光度值對應(yīng)的亞硝酸鈉的質(zhì)量，μg；V1-測定用樣液的體積，mL；V2-試樣處理液總體積，mL；m-取樣量，g；69/14-換算系數(shù)；1 000-換算系數(shù)。結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。

3 不確定度來源分析

3.1 配制亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度引入的不確定度

儲備液使用有證標(biāo)物，其擴(kuò)展不確定度為Urel（c1）=0.03、濃度c=100 mg·L-1，k1=2。

標(biāo)準(zhǔn)使用液要用儲備液稀釋100倍，其中用的1 mL移液管、100 mL容量瓶、有檢定證書可得到其允許的最大誤差值（Maximum Permissible Error，MPE）（管1）=0.008、MPE（容1）=0.1，移液管和容量瓶的分辨力δ為0.01mL，

儀器的校準(zhǔn)溫度為T1=20.0 ℃，實驗室的溫度在T2=20.0 ℃，水的體積膨脹系數(shù)a=2.1×10-4/℃，服從矩形分布，

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度

通過相對應(yīng)的實驗，可以有效明確相對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)質(zhì)量濃度點，然后進(jìn)一步有效測量不同的物質(zhì)濃度點，測量3次左右，一共獲得27個數(shù)值，即n=27。用xi為橫坐標(biāo)，yi縱坐標(biāo)繪制擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，y=0.075x-0.000 5，由此得出a+bxi，見表1。由上可知，標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度測量的試驗標(biāo)準(zhǔn)差為S，計算如下：

表1 亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)表

標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的相對不確定度計算如下：

式中：Urel（x0）-樣液亞硝酸鹽含量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度；S-標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度測量的試驗標(biāo)準(zhǔn)差；b-擬合曲線的斜率；x0-樣品溶液中亞硝酸鹽含量的平均值，μg；p-樣品溶液測定的次數(shù)，p=2；m-標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的個數(shù)，m=9；xi-各標(biāo)準(zhǔn)溶液中亞硝酸鹽的含量，μg；標(biāo)準(zhǔn)溶液中亞硝酸鹽含量的平均值μg。

3.3 天平稱量所引入的不確定度

由天平說明書得到電子天平在0～50 g時MPE值為±5 mg，服從矩形分布，k2=。重復(fù)稱量同一樣品8次得到稱樣量分別為5.220 2 g、5.220 3 g、5.220 0 g、5.219 8 g、5.220 3 g、5.220 2 g、5.220 1 g、5.220 1 g。

3.4 樣品稀釋引入的不確定度

樣品稀釋用了20 mL移液管、200 mL容量瓶、50 mL容量瓶，有檢定證書可得到其允許的最大誤差值MPE（ 管2）=0.03、MPE（ 容2）=0.15、MPE（ 容3）=0.05，移液管和容量瓶的分辨力δ為0.01mL，k2=。儀器的校準(zhǔn)溫度為T1，實驗室的溫度在T2，水的體積膨脹系數(shù)a=2.1×10-4/℃，服從矩形分布，k2=。

3.5 紫外分光光度計引入的不確定度

紫外分光光度計由檢定證書得透光率的擴(kuò)展不確定度為u（A）=0.004，k=2，（在同一波長下測定，波長不確定度忽略不計），則紫外分光光度計引入的不確定度為：

4 合成不確定度

由上述的分析可知，分光光度法測定亞硝酸鹽中引入不確定度的來源有5個，分別是配制亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度引入的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度、天平稱量引入的不確定度、樣品稀釋引入的不確定度、紫外分光光度計引入的不確定度。綜合以上5個合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度，亞硝酸鹽的合成相對擴(kuò)展不確定度為[3-6]：

5 結(jié)論

通過對分光光度法測定亞硝酸鹽含量的不確定度進(jìn)行相對應(yīng)的分析和評定，可以進(jìn)一步充分明確，影響最終不確定度結(jié)果的主要為測量重復(fù)性所產(chǎn)生的不確定度。正因為主要來源由測量重復(fù)性產(chǎn)生的，所以需要在測定亞硝酸鹽的過程中嚴(yán)格控制樣品前處理和測量過程，并多次重復(fù)測量，以降低檢測結(jié)果的不確定度。