無前導(dǎo)肽細(xì)菌素研究進(jìn)展及在動物養(yǎng)殖中的應(yīng)用

張曉峰 ， 徐艷超 ， 任蘭蘭 ， 王一博 ， 王海花 ， 潘春梅

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院 ， 河南 鄭州 450046 ； 2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動物醫(yī)藥學(xué)院 ， 河南 鄭州 450046)

抗生素的開發(fā)和應(yīng)用是人類20世紀(jì)最重要的科學(xué)成就，其在動物養(yǎng)殖中的廣泛應(yīng)用，雖然其在促進(jìn)動物生長、提高經(jīng)濟(jì)效益方面發(fā)揮了巨大的作用，但藥物殘留和耐藥性嚴(yán)重威脅人類健康，因此，抗生素替代品的開發(fā)成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。細(xì)菌素是細(xì)菌在代謝過程中由核糖體合成的、對產(chǎn)生菌具有自身免疫性的一類具有抗菌活性的多肽類物質(zhì)，具有體內(nèi)外抑菌活性高，對人體無毒，可選擇性強(qiáng)，不易產(chǎn)生交叉抗性，易于生物改造等特點(diǎn)，是良好的抗生素替代品[1]。然而，細(xì)菌素產(chǎn)量較低，規(guī)模化生產(chǎn)較難，成本較高等因素制約了細(xì)菌素的大范圍應(yīng)用。與大多數(shù)細(xì)菌素不同，無前導(dǎo)肽細(xì)菌素是一類由核糖體合成、翻譯后不進(jìn)行任何修飾即具有活性的細(xì)菌素[2]，該類細(xì)菌素遺傳結(jié)構(gòu)簡單，易在其他微生物細(xì)胞中表達(dá)，便于通過生物工程進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)，抗菌機(jī)制獨(dú)特，有巨大的商業(yè)應(yīng)用潛能。本文對無前導(dǎo)肽細(xì)菌素的類型、理化特性、來源、結(jié)構(gòu)特征、生物合成、抗菌機(jī)制及在動物養(yǎng)殖中的應(yīng)用及發(fā)展前景進(jìn)行了綜述。

1 無前導(dǎo)肽細(xì)菌素類型、理化特征、來源及結(jié)構(gòu)特征

Cotter等[3]根據(jù)細(xì)菌素結(jié)構(gòu)特征將其分為兩大類：翻譯后修飾細(xì)菌素(I類細(xì)菌素)和翻譯后非修飾細(xì)菌素(II類細(xì)菌素)，其中I類細(xì)菌素又分為12小類，II類細(xì)菌素又分為5小類，細(xì)菌素類型及結(jié)構(gòu)特征見表1。

表1 細(xì)菌素類型及結(jié)構(gòu)特征

按上述分類系統(tǒng)，無前導(dǎo)肽細(xì)菌素屬翻譯后非修飾IId類細(xì)菌素。自1998年第1個(gè)無前導(dǎo)肽細(xì)菌素Enterocin L50報(bào)道以來，至今已鑒定出11種不同種屬33個(gè)無前導(dǎo)肽細(xì)菌素。該類細(xì)菌素通常含27～53個(gè)氨基酸殘基，分子量相對較小，富含賴氨酸而缺少半光氨酸殘基，帶2～8個(gè)不等正電荷，有較高等電點(diǎn)，通常在N端甲?；纬杉柞＜琢虬彼醄4-8]。按其氨基酸序列的保守性可分為四類，見表2。

表2 無前導(dǎo)肽細(xì)菌素類型及結(jié)構(gòu)特征

2 無前導(dǎo)肽細(xì)菌素的生物合成

通常，細(xì)菌素的生物合成分為3個(gè)過程，首先合成無活性的、N端含有前導(dǎo)肽序列的前體肽，然后前體肽在修飾酶的作用下進(jìn)行翻譯后修飾，最后除去前體肽中的前導(dǎo)肽序列從而變?yōu)橛谢钚缘某墒祀?圖1)。前導(dǎo)肽是細(xì)菌素生物合成酶的識別位點(diǎn)，是酶-底物相互作用所必需的，并對細(xì)菌素產(chǎn)生菌有保護(hù)作用。大部分細(xì)菌素前導(dǎo)肽的切割和分泌需要其專門的前導(dǎo)肽序列，前導(dǎo)肽在細(xì)菌素的生物合成中起重要作用[9]。長時(shí)間以來，人們認(rèn)為前導(dǎo)肽是細(xì)菌素生物合成所必需的，然而，無前導(dǎo)肽細(xì)菌素的生物合成過程卻不形成前導(dǎo)肽序列，在翻譯后不經(jīng)任何修飾即轉(zhuǎn)變有活性的成熟肽。

圖1 細(xì)菌素生物合成示意圖[8]修飾的殘基

無前導(dǎo)肽細(xì)菌素簡單的遺傳結(jié)構(gòu)使其很容易與其他微生物蛋白的N端擴(kuò)展融合，因此也更容易被其他細(xì)菌、真菌或真核細(xì)胞表達(dá)。如來源于乳酸乳球菌的Lactcin Q和來源金黃色葡萄球菌的Aureocin A53能夠在大腸桿菌(E.coli) BL21中大量表達(dá)，來源E.faeciumL50的雙肽細(xì)菌素Enterocin L50A和Enterocin L50B已經(jīng)在釀酒酵母和畢赤酵母中成功表達(dá)[10],除此之外，細(xì)菌素Lactcin Q也已在枯草芽胞肝菌中成功表達(dá)[11]。枯草芽胞桿菌在動物腸道中能夠發(fā)揮重要的促進(jìn)作用，其作為益生菌廣泛應(yīng)用于動物養(yǎng)殖業(yè)，酵母菌也是常用于動物養(yǎng)殖的腸道益生菌。細(xì)菌素在腸道益生菌中的成功表達(dá)能夠增強(qiáng)益生菌的競爭優(yōu)勢，促進(jìn)其在腸道中的定植。另外，無前導(dǎo)肽細(xì)菌素簡單的遺傳結(jié)構(gòu)也便于進(jìn)行分子改造，生產(chǎn)出新型的、更具優(yōu)勢功能的細(xì)菌素，同時(shí)進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)。如在菌株Lc.garvieae基因組中增加無前導(dǎo)肽細(xì)菌素Garvicin KS基因簇的拷貝數(shù)、優(yōu)化培養(yǎng)基成分、優(yōu)化培養(yǎng)條件可使該細(xì)菌素產(chǎn)量增加2 000倍[12]。

3 無前導(dǎo)肽細(xì)菌素的抗菌機(jī)制

通常細(xì)菌素通過與靶標(biāo)細(xì)胞膜上特定受體結(jié)合形成“孔道”結(jié)構(gòu)破壞細(xì)胞膜或抑制細(xì)胞壁形成發(fā)揮作用，如羊毛硫細(xì)菌素Nisin和細(xì)菌素Pediocin PA-1[13-14]。無前導(dǎo)肽細(xì)菌素通常帶正電荷，能與帶負(fù)電荷的靶標(biāo)細(xì)胞膜相互作用形成“孔道”結(jié)構(gòu)，使靶標(biāo)細(xì)胞核酸、細(xì)胞質(zhì)及相關(guān)離子等重要內(nèi)容物泄露，膜電位消失、大分子合成終止而殺死細(xì)菌(圖2)。同時(shí)，疏水作用在與靶標(biāo)細(xì)胞膜的相互作用過程中也發(fā)揮了重要作用，因此，大多數(shù)無前導(dǎo)肽細(xì)菌素如Enterocin 7A、Enterocin 7B、Aureocin A53及Lactcin Q發(fā)揮抑菌作用不需要任何受體參與，抑菌譜較廣[15-16]。如Lactcin Q首先通過靜電吸引與靶標(biāo)細(xì)胞膜結(jié)合，然后通過滲透在靶標(biāo)細(xì)胞膜上形成“環(huán)形孔”使細(xì)胞內(nèi)容物泄露從而殺死細(xì)菌[17]。Enterocin 7A、Enterocin 7B同樣通過靜電吸引和疏水作用與靶標(biāo)細(xì)胞膜結(jié)合，隨后α-螺旋解旋，疏水核暴露并插入膜靶標(biāo)細(xì)胞膜中[18]。

圖2 無前導(dǎo)肽細(xì)菌素抗菌機(jī)制示意圖

4 無前導(dǎo)肽細(xì)菌素在動物養(yǎng)殖中的應(yīng)用

細(xì)菌素是細(xì)菌在代謝過程中由核糖體合成的、對產(chǎn)生菌具有自身免疫性的一類具有抗菌活性的多肽類物質(zhì)[19]。細(xì)菌素在生物合成、作用模式、抗性機(jī)制及抗菌活性方面與抗生素存在明顯不同。細(xì)菌素是由微生物細(xì)胞核糖體合成機(jī)制產(chǎn)生的一種抗菌肽，而抗生素是由細(xì)胞產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物；與抗生素生產(chǎn)菌不同，細(xì)菌素產(chǎn)生菌能夠耐受其所產(chǎn)細(xì)菌素的影響；多數(shù)細(xì)菌素不需要任何受體，可以與靶標(biāo)細(xì)胞上任何部位作用，通過與靶標(biāo)細(xì)胞膜的相互作用產(chǎn)生空隙，使細(xì)胞內(nèi)容物泄露而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，而抗生素通常通過抑制細(xì)胞壁的合成，阻斷細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的表達(dá)，破壞DNA和RNA的復(fù)制來殺死靶標(biāo)細(xì)胞；抗生素耐藥性的增加取決于遺傳因素的變化，能夠從一代傳遞到下一代，而細(xì)菌素靶標(biāo)細(xì)胞對細(xì)菌素的抗性主要與靶標(biāo)細(xì)胞膜的化學(xué)組成相關(guān)，傳遞到下一代的可能性較小。細(xì)菌素?zé)o毒，易被蛋白酶降解而不殘留，對很多抗生素抗性菌株有作用，可原位生產(chǎn)使其產(chǎn)生菌更具競爭優(yōu)勢，許多腸道細(xì)菌需要細(xì)菌素的產(chǎn)生才能定植[20]，腸道益生菌通過細(xì)菌素的產(chǎn)生更易定植于宿主而發(fā)揮作用。無前導(dǎo)肽細(xì)菌素遺傳結(jié)構(gòu)簡單，易于在益生菌中表達(dá)，便于規(guī)?；a(chǎn)，該類細(xì)菌素抑菌譜范圍較窄但種類多樣，能夠在其發(fā)揮抑菌作用的同時(shí)較少影響宿主共生微生物，維持腸道菌群平衡，同時(shí)，多數(shù)無前導(dǎo)肽細(xì)菌素是由分離自食品或動物腸道的乳酸菌所產(chǎn)生，這些產(chǎn)生菌本身就是益生菌，具有天然的安全性。如無前導(dǎo)肽細(xì)菌素Garvicin KS、LsbB是從商品牛奶中分離到的乳酸菌所產(chǎn)生，Enterocin Q是從碎牛肉中分離到的糞腸球菌所產(chǎn)生，這些特性使無前導(dǎo)肽細(xì)菌素在動物養(yǎng)殖中的應(yīng)用更具優(yōu)勢。

細(xì)菌素既可以通過添加到飼料或直接飼喂動物而發(fā)揮作用，也可以通過添加產(chǎn)細(xì)菌素的益生菌來發(fā)揮作用。從內(nèi)蒙古牛、羊腸道中篩選的乳酸菌N8603可產(chǎn)生對強(qiáng)毒沙門桿菌、強(qiáng)毒雞白痢桿菌、強(qiáng)毒大腸桿菌、腐生葡萄球菌等腸道致病菌有抗菌活性的細(xì)菌素，該細(xì)菌素有望開發(fā)為動物飼料添加劑[21]。來源于枯草芽胞桿菌的細(xì)菌素對魚的4種致病菌有很好的活性，能夠有效降低印度鯉科魚類細(xì)菌致病性[22]。細(xì)菌素Subtilosin A來源于同時(shí)能夠產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶及脂肪酶的1株枯草芽胞桿菌，該細(xì)菌素可有效減少肉雞腸道致病菌的感染[23]。細(xì)菌素Lacticin 3147的攝入能有效降低動物鏈球菌的感染，能夠用于奶牛乳腺炎的治療，飼喂分離純化自商業(yè)肉雞盲腸中唾液乳桿菌所產(chǎn)的細(xì)菌素可以明顯減低雛雞腸道中的空腸彎曲桿菌[24-25]。同時(shí)，將產(chǎn)細(xì)菌素益生菌應(yīng)用于動物養(yǎng)殖中不僅可以抑制腸道致病菌的增殖，而且能夠增強(qiáng)益生菌的定植能力，促進(jìn)益生菌的作用效果。研究證實(shí)，枯草芽胞桿菌能夠在動物腸道中完成由芽胞營養(yǎng)體到芽胞的過程，能產(chǎn)生細(xì)菌素的枯草芽胞桿菌可以使其在與其他腸道菌群競爭中獲得優(yōu)勢而定植[26]。另外，由于部分細(xì)菌素抑菌譜較窄而不易破壞宿主原菌群結(jié)構(gòu)，如細(xì)菌素Thuricin CD與萬古霉素、甲硝唑的抗菌活性相當(dāng)，但Thuricin CD并不改變宿主共生菌結(jié)構(gòu)，而萬古霉素、甲硝唑的使用卻使宿主變形桿菌門的細(xì)菌明顯增加而其他細(xì)菌減少[27]。

研究表明，不同類型無前導(dǎo)肽細(xì)菌素對部分病原菌有協(xié)同作用，如Garvicin KS與Polymyxin B聯(lián)合使用對不動桿菌和大腸桿菌有協(xié)同抑菌活性，Garvicin KS與Polymyxin B、Nisin聯(lián)合使用能夠快速殺滅并完全根除不動桿菌和大腸桿菌，Garvicin KS與Nisin聯(lián)合使用對金黃色葡萄球菌有協(xié)同作用，Garvicin KS與Nisin、金合歡醇聯(lián)合使用在低濃度下能快速根除黃色葡萄球菌[28]。

5 存在問題及展望

細(xì)菌素作為抗生素的替代品已廣泛應(yīng)用于動物養(yǎng)殖行業(yè)，然而多數(shù)僅對其抑菌活性及在動物養(yǎng)殖中的促生長作用進(jìn)行了研究，而對其氨基酸序列、空間結(jié)構(gòu)及作用機(jī)制并沒有深入開展。對于無前導(dǎo)肽細(xì)菌素而言，目前分離和鑒定的數(shù)量很少，源于益生菌的無前導(dǎo)肽細(xì)菌素更少，源于動物腸道益生菌的無前導(dǎo)肽細(xì)菌素幾乎沒有，且僅有Aureocin A53、Lactcin Q、LsbB及Enterocin 7四種無前導(dǎo)肽細(xì)菌素的三維結(jié)構(gòu)獲得解析，其生產(chǎn)、調(diào)節(jié)及作用方式的分子機(jī)制尚未完全了解，這將會限制無前導(dǎo)肽細(xì)菌素在動物養(yǎng)殖中的應(yīng)用。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，大量微生物基因組的公布和細(xì)菌素在線比對工具的應(yīng)用，越來越多的無前導(dǎo)肽細(xì)菌素將會被發(fā)現(xiàn)和鑒定，更多的無前導(dǎo)肽細(xì)菌素空間結(jié)構(gòu)及作用機(jī)制也將會揭示[29]。因來源于動物腸道的益生菌具有原位定植和促進(jìn)動物腸道健康的優(yōu)勢，源自動物腸道益生菌的無前導(dǎo)肽細(xì)菌素能夠發(fā)揮更好的原位抑菌效果，因此將源于不同種類動物腸道益生菌的無前導(dǎo)肽細(xì)菌素應(yīng)用于原宿主是細(xì)菌素在動物養(yǎng)殖應(yīng)用中的發(fā)展方向，加之該類細(xì)菌素遺傳結(jié)構(gòu)簡單、易于進(jìn)行分子改造，易于在其他微生物或益生菌中表達(dá)，易于利用生物工程進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)，這些特性使其在未來的動物養(yǎng)殖業(yè)中有更廣泛的應(yīng)用前景。