豬流行性腹瀉病毒GDsg株的分離鑒定及遺傳進化分析

董建國 ， 饒 丹 ， 陳明睿 ， 何書海 ， 焦鳳超 ， 陳 斌 ， 易本馳 ， 黃 立 ， 趙攀登

(1.信陽農(nóng)林學(xué)院牧醫(yī)工程學(xué)院 ， 河南 信陽 464000 ； 2.河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院動物醫(yī)學(xué)院 ， 河南 鄭州 450046)

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一種腸道致病性疾病，其臨床主要表現(xiàn)為腹瀉、嘔吐和脫水，以及造成小腸腸道擴張，腸絨毛萎縮、脫落，腸壁彈性消失等病理變化[1]。該病對哺乳仔豬致死性高，死亡率可達100%[2-3]。1971年，英國首次暴發(fā)PED，隨后在歐洲和亞洲許多國家相繼報道[4]。2010 年，PEDV變異毒株在我國出現(xiàn)，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成重大損失[5]。

PEDV屬于尼多病毒目(Nidovirales)冠狀病毒科(Coronaviridae)冠狀病毒屬(Coronavirus) α冠狀病毒亞屬，為單股正鏈RNA病毒[6]。PEDV全基因組約為28kb，依次由5′端帽子結(jié)構(gòu)(Cap)、7個開放閱讀框(Open reading fragment,ORFs) 以及含PolyA尾的3′端組成[7]。7個ORFs編碼情況為：ORF1a和ORF1b位于5′端后，約占全基因組的2/3，編碼非結(jié)構(gòu)蛋白；其余5個開放閱讀框依次為S基因編碼結(jié)構(gòu)蛋白S(Spike)、ORF3基因編碼非結(jié)構(gòu)蛋白ORF3、E基因編碼包膜蛋白E、M基因編碼膜蛋白M、N基因編碼核衣殼蛋白N[8]。S蛋白表面包含多種抗原表位，在病毒識別進入宿主細胞中具有重要作用[9-10]。具有代表性的抗原表位主要為：中和抗原表位COE(499～638 aa)、2個B細胞抗原表位S1D5(744～759 aa)和S1D6(756～771 aa)、2個線性抗原表位SS2(748～755 aa)和SS6(764～771 aa)[11]。基于S基因的同源性分析可將其分為S1和S2兩個區(qū)域。S基因具有很強的變異性，且其變異性主要集中在S1的N端，根據(jù)其變異性可將PEDV分為經(jīng)典型和變異型2種類型[12]。因此，S基因在PEDV的研究中具有重要意義，其被廣泛地應(yīng)用于亞單位疫苗、基因工程疫苗及PEDV抗體檢測試劑盒的研發(fā)當中。

為了解我國廣東地區(qū)PEDV的流行及變異情況，本實驗室于2015年1月從廣東省韶關(guān)市某中大型養(yǎng)豬場大面積暴發(fā)仔豬腹瀉死亡的腸道及糞便樣本中檢測出PEDV陽性，并成功在Vero細胞上分離出PEDV毒株并命名為GDsg株。通過對其全基因測序并與其他PEDV代表性毒株進行序列比對及進化樹分析，進而分析其與我國現(xiàn)流行毒株的相似性，從而了解廣東省PEDV的流行趨勢。

1 材料與方法

1.1 病料采集 廣東省韶關(guān)市2015年疑似暴發(fā)PEDV某豬場自然發(fā)病仔豬，采集小腸及內(nèi)容物于-80 ℃儲存。

1.2 細胞、菌體及載體 本試驗使用Vero細胞由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心豬病防控研究室保存；克隆宿主菌Trans5α化學(xué)感受態(tài)細胞和pEASY-Blunt Simple Cloning Kit?克隆載體，均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 試劑 病毒DNA/RNA提取試劑盒，購自廣州Magen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和Wizard SV Geland PCR Clean-Up System 膠回收試劑盒，均購自Promega公司；DNA Marker DL2 000，購自廣州東盛生物科技有限公司；EB替代染料，購自廣州華奇盛有限公司；全基因序列擴增高保真酶PrimeSTAR?HS DNA Polymerase，購自TaKaRa生物工程公司；DMEM細胞培養(yǎng)液、澳洲胎牛血清、雙抗、無EDTA胰酶，均購自Thermo Fisher生物公司。

1.4 引物設(shè)計合成 根據(jù)GenBank上發(fā)布的PEDV序列，通過生物信息學(xué)分析選取S基因保守區(qū)間設(shè)計特異性鑒定引物(表1)對PEDV進行鑒定。并根據(jù)已發(fā)表的CV777毒株等PEDV全基因序列及參考相關(guān)文獻設(shè)計用于PEDV全基因擴增的14對引物[13](表2)。引物均由生工生物工程上海(股份)有限公司合成。

1.5 病料處理及PCR檢測 將采集的發(fā)病仔豬小腸及內(nèi)容物剪碎，加入1 mL PBS研磨，研磨液移至1.5 mL離心管中。4 ℃下12 000 r/min離心10 min，取上清液于0.22 μm 微孔濾器過濾除菌。取濾液220 μL用于病毒DNA/RNA的提取，剩余濾液存儲于-80 ℃中。對提取的病毒核酸進行有關(guān)PEDV、PRRSV、PPV和CSFV的RT-PCR檢測以及PRV、PCV2和PCV3的常規(guī)PCR檢測。

1.6 病毒分離純化及間接免疫熒光試驗 在37 ℃含5% CO2細胞培養(yǎng)箱下使用12孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)Vero細胞，待細胞長至單層鋪滿時棄上清，PBS洗3次，接種50 μL濾膜過濾無菌的病料研磨液，加入100 μL無血清、含2%雙抗的DMEM培養(yǎng)液，37 ℃ 5% CO2細胞培養(yǎng)箱下培養(yǎng)，72 h后約90%細胞出現(xiàn)明顯細胞病變效應(yīng)(CPE)。收集細胞并對細胞反復(fù)凍融3次，離心后棄掉細胞碎片，將收集的病毒進行蔗糖密度梯度離心純化，并存儲于-80 ℃。為了進一步鑒定出現(xiàn)CPE的細胞感染了PEDV，同時將做的重復(fù)孔細胞用無水乙醇固定20 min，PBS洗滌3次，每次3 min；加入抗PEDV M蛋白單克隆抗體，室溫孵育1 h；PBS洗滌3次，每次3 min；加入FITC標記的二抗，避光，室溫孵育1 h；PBS洗滌3次，每次3 min；加入熒光猝滅劑，制作片子并在熒光顯微鏡下觀察。

1.7 病毒接毒傳代 在37 ℃含5% CO2細胞培養(yǎng)箱下使用25 mL細胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)Vero細胞。待細胞長至單層鋪滿時棄上清，PBS洗3次，接種200 μL病毒液，加入100 μL無血清、含2%雙抗的DMEM維持液5 mL，置于37 ℃ 5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3～5 d后約90%細胞出現(xiàn)明顯CPE。反復(fù)凍融3次收樣并存儲于-80 ℃。重復(fù)此方法對病毒進行傳代。

1.8 病毒RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 取在Vero細胞上分離到的第3代GDsg株200 μL，根據(jù) Magen 公司產(chǎn)品試劑盒進行病毒核酸提取，然后根據(jù)Promega 反轉(zhuǎn)錄試劑盒對所提取的病毒核酸進行反轉(zhuǎn)錄。

1.9 PEDV GDsg株全基因組擴增 使用 TaKaRa 生物工程公司PrimeSTAR?HS DNA Polymerase高保真酶對目的片段進行擴增。擴增體系為 50 μL：PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5 μL，5×PrimeSTAR Buffer 10 μL，dNTP Mixture 4 μL，cDNA 模板 4 μL，上游引物 2 μL，下游引物 2 μL，RNase Free H2O 27.5 μL。PCR 擴增程序：98 ℃預(yù)變性 2 min；98 ℃變性 10 s，56 ℃退火 60 s，72 ℃延伸 30 s/kb，35 個循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。將 PCR 產(chǎn)物進行 1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.10 PEDV GDsg株全基因組測序 PCR 擴增產(chǎn)物通過 1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，使用膠回收試劑盒對目的片段進行膠回收。然后連接到pEASY-Blunt Simple Cloning Vector 上。經(jīng)過轉(zhuǎn)化挑菌鑒定后送往測序公司進行測序。

1.11 序列比對分析 利用 DNASTAR.Lasergene.v 7.1、Mega 5.0及Clustal X 軟件將分離的毒株全基因組與國內(nèi)外分離毒株進行序列比對并構(gòu)建進化樹，并分別將S基因序列和氨基酸序列與其他國內(nèi)外代表毒株的S基因序列和氨基酸序列進行比對分析。PEDV 代表毒株基因序列均來源于GenBank。

2 結(jié)果

2.1 病料樣品RT-PCR檢測 使用PEDVS基因檢測引物S1將采集樣品處理好后提取核酸進行RT-PCR檢測，通過瓊脂糖凝膠電泳證明檢測結(jié)果為陽性(圖1)。

圖1 PEDV S基因的擴增Fig.1 Amplification of PEDV S geneM：DNA分子質(zhì)量標準； 1：樣品； 2：陰性對照M:DNA marker DL2 000; 1：Sample; 2:Negative control

2.2 病毒分離純化與鑒定 將處理好的病料濾液接種至Vero細胞上，傳代培養(yǎng)至第4代，Vero細胞出現(xiàn)明顯CPE時進行免疫熒光鑒定，結(jié)果顯示接毒組細胞出現(xiàn)特異性的熒光(圖2)，表明病毒分離成功。收集細胞液進行蔗糖密度梯度離心純化，將純化獲得的病毒提取核酸進行全基因測序。

圖2 PEDV致Vero細胞病變Fig.2 Cytopathic effect of PEDV on Vero cellA：正常細胞； B：接種病豬腸道內(nèi)容物的細胞A:Normal cell; B:Cells inoculated with intestinal contents of diseased pigs

2.3 PEDV GDsg株全基因進化樹構(gòu)建分析 運用生物進化分析軟件Mega 5.0和Clustal X對GDsg株進行全基因進化樹構(gòu)建(圖3)。進化樹構(gòu)建所使用國內(nèi)外參考毒株均從GenBank上下載。如圖3進化樹分析所示，分離株GDsg株與GII型GIIa亞型的代表毒株AJ1102距離較近，應(yīng)屬于GII型GIIa亞型毒株，屬于流行變異毒株。

圖3 PEDV GDsg株全基因組進化樹分析Fig.3 Analysis of whole-genome evolutionary tree of PEDV GDsg strain●：本試驗分離的毒株●:The strains isolated in this experiment

2.4 PEDV GDsg株全基因組同源性分析 運用生物進化分析軟件DNASTAR.Lasergene.v 7.1中的MegAlign對PEDV GDsg株進行全基因組同源性進化分析(圖4)。GDsg株與經(jīng)典株GIa亞型代表毒株CV777的同源性為96.6%，同源性最低；與經(jīng)典株GIb亞型代表毒株attenuated DR13同源性為97.1%；與變異株GIIa亞型代表毒株GHGD-01同源性為98.2%，同源性最高。此結(jié)果進一步證明GDsg株屬于變異株GIIa亞型毒株。

圖4 PEDV GDsg株全基因組同源性分析Fig.4 Homology analysis of whole-genome of PEDV GDsg strain

2.5 PEDV GDsg株S基因氨基酸抗原表位分析 運用生物進化分析軟件DNASTAR.Lasergene.v 7.1中的MegAlign對PEDV GDsg株的S基因氨基酸序列進行比對分析。結(jié)果顯示，與經(jīng)典株GIa亞型代表毒株CV777相比，在中和抗原表位COE區(qū)間GDsg有6個氨基酸突變，分別為522(A/S)、526(H/Y)、554(T/S)、599(G/S)、634(P/T)和638(Q/E)，無氨基酸插入和缺失；在線性表位SS2區(qū)間GDsg無氨基酸突變、插入和缺失；在線性抗原SS6區(qū)間GDsg有1個氨基酸發(fā)生突變，為769(L/S)，無氨基酸插入和缺失。

3 討論

自1971年P(guān)ED首次感染育肥豬在英國報道后，很快就傳播至歐洲其他國家及亞洲國家[3]。2010年10月，變異型PEDV毒株在我國南方出現(xiàn)并迅速傳播至全國各地，造成大面積哺乳仔豬死亡，死亡率高達80%～100%，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟損失[5]。目前，PEDV的防控主要通過疫苗免疫和生物安全兩方面來進行。用于PEDV防控的疫苗有基于經(jīng)典毒株和變異毒株的滅活疫苗、弱毒疫苗、亞單位疫苗等多種，但至今尚無有效的疫苗能夠控制PEDV的傳播。另一方面，由于PEDV為RNA病毒，疫苗的混亂使用反而加劇其不斷變異的可能性，這也可能是造成2010年變異毒株出現(xiàn)的原因，也使得PEDV的防控更加艱難[14-15]。

本試驗在Vero細胞中成功分離出PEDV GDsg毒株，通過RT-PCR進行全基因序列的分段擴增并克隆至測序載體上進行全基因測序。最后通過生物學(xué)進化分析軟件，與GenBank上已發(fā)布的相關(guān)PEDV毒株進行基因進化分析及同源性分析。分析結(jié)果顯示，GDsg株與PEDV變異株GIIa亞型代表毒株AJ1102同源性最高，為98.3%，且進化分析位于同一分支上。表明PEDV在廣東地區(qū)變異毒株流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成防控壓力，并隨著其傳播有增大PEDV變異的可能性。

PEDV變異毒株的出現(xiàn)主要是由于S基因的變異所造成的。S基因編碼的蛋白成為纖突蛋白，位于病毒粒子的最外層，為I型跨膜糖蛋白。由于其位于病毒粒子的最外層，PEDV的抗原表位主要集中在S蛋白表面[16-17]。通過對S蛋白氨基酸序列比對分析得出，與經(jīng)典毒株CV777相比，GDsg株在中和抗原表位COE區(qū)間有6個氨基酸的發(fā)生突變，分別為A522S、H526Y、T554S、G599S、P634T和Q638E；在線性抗原表位SS6區(qū)間有1個氨基酸發(fā)生突變，為L769S。這些突變可能會影響免疫原性，從而導(dǎo)致疫苗免疫失敗，造成PED的暴發(fā)，進而造成更大的變異。

本試驗結(jié)果表明，GDsg株為PEDV變異株GIIa亞型毒株。通過對GDsg株的測序比對分析，一方面可對廣東省PEDV的流行狀況進行了解，根據(jù)其變異趨勢提出合理有效地防控方案；另一方面可根據(jù)其抗原表位的突變情況設(shè)計相應(yīng)合理的亞單位疫苗方案，從而有效地阻止PEDV的傳播。