基于貝爾曼漏斗法的土壤線蟲最優(yōu)分離時長探究

普國慶，羅 丹，趙成法，譚 坤，劉碩然，肖 文，李延鵬*

（1.大理大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南大理 671003；2.云南省富源縣第一中學(xué)，云南曲靖 655500；3.大理大學(xué)東喜瑪拉雅研究院，云南大理 671003）

土壤是生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)能量循環(huán)的重要載體，是生物圈中最為重要的生態(tài)系統(tǒng)之一，也是綠色植物生長的基礎(chǔ)〔1〕。土壤生態(tài)系統(tǒng)中存在著世界上最大的動物類群——土壤動物，土壤線蟲是土壤動物中的優(yōu)勢類群，在土壤食物網(wǎng)中占據(jù)多個營養(yǎng)級地位〔2〕，其群落組成能夠反映氣候條件、土壤質(zhì)地、土壤有機(jī)質(zhì)輸入以及自然和人為的擾動情況〔3〕。它們被視為一個地區(qū)生物多樣性及其可持續(xù)性的指示生物，尤其是運(yùn)用其評價土壤健康程度、土壤動物學(xué)效應(yīng)、生態(tài)系統(tǒng)演替或外界干擾強(qiáng)度等〔4〕。

土壤線蟲類群龐大、物種數(shù)量巨大，傳統(tǒng)分類工作較為困難。線蟲分離是對土壤線蟲分類、進(jìn)行形態(tài)和生態(tài)學(xué)研究的基礎(chǔ)，分離率也限制了后續(xù)的研究〔5〕。根據(jù)不同的研究目的及原理，目前國內(nèi)外對土壤線蟲分離的方法主要分為3類：過篩法、懸浮法、貝爾曼漏斗法〔5〕，前兩類分離方法得到的線蟲懸液含有較多的土壤礦質(zhì)顆粒和有機(jī)物殘體，貝爾曼漏斗法分離得到的線蟲懸液幾乎無雜質(zhì)，蟲體干凈完整、活性高，操作簡單，方便后續(xù)的計數(shù)和鑒定，能大大降低實驗的前期投入，被視為最節(jié)省時長，分離過程最簡便，分離后雜質(zhì)最少的分離方法〔5〕。該方法利用線蟲的趨水性和自身重力，脫離土壤進(jìn)入水中，因此分離率受時長的影響較大〔6〕。目前使用貝爾曼漏斗法對土壤線蟲進(jìn)行分離沒有較為統(tǒng)一的分離時長，利用中國知網(wǎng)和Web of Science，本研究隨機(jī)搜集了100項采用貝爾曼漏斗法分離線蟲的研究，統(tǒng)計其使用的分離時長。結(jié)果發(fā)現(xiàn)各研究中分離時長極不統(tǒng)一（12～168 h），其中24 h和48 h使用頻率較多，分別占40%和50%。見圖1。

圖1 100項研究中不同分離時長的使用頻率

對貝爾曼漏斗法的最優(yōu)分離時長選擇、兼顧研究需求的同時減少不必要的時間投入等問題尚無系統(tǒng)研究。為探究貝爾曼漏斗法在土壤線蟲分離過程中的最優(yōu)分離時長，本研究基于貝爾曼漏斗法，對所采集的土壤樣品進(jìn)行線蟲分離，分離過程中連續(xù)72 h收集分離出來的線蟲，比較12、24、36、48、60、72 h分離時長下的累積分離率與分離種類，為貝爾曼漏斗法提取土壤線蟲時分離時長的設(shè)定提供參考依據(jù)，幫助研究人員快速有效地完成實驗，促進(jìn)土壤線蟲及其相關(guān)生態(tài)學(xué)的研究。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況樣品采集地點蒼山位于云南省大理市（99°58'～100°27'E，25°34'～26°00'N），地處低緯度山區(qū)，屬亞熱帶高原季風(fēng)氣候，南北長950 km，東西寬19 km，總面積950 km2，海拔1 980～4 122 m。植被囊括云南松林及灌叢草坡帶、華山林人工帶、常綠櫟類、杜鵑箭竹灌叢林、蒼山冷杉林帶、高山杜鵑灌叢草甸。生物多樣性極為豐富獨特，并具有明顯的植物垂直分布帶譜，使蒼山成為南北生物交匯過渡帶，生物的分布和分化中心，為全球生物多樣性最為豐富的地區(qū)之一〔7〕。

1.2 研究方法

1.2.1 樣點設(shè)置及樣品采集在蒼山黑龍溪海拔2 300 m處（100°14'E，25°67'N）設(shè)置3個采樣點，每個采樣點利用劈裂式采樣器（直徑38 mm）分別采集3個樣品，樣品僅選取土柱5～10 cm處的土壤，共采集土壤樣品9份〔8〕。

1.2.2 土壤線蟲分離將直徑為10 cm的玻璃漏斗置于木架上，在漏斗內(nèi)鋪墊濾網(wǎng)，漏斗下管連接長約10 cm的橡膠管，距離橡膠管最末端1～2 cm處用止水夾夾緊。把每份土壤樣品混勻后，去除肉眼可見的大石子和樹根等雜質(zhì)，平行稱取50 g的土壤樣品3份，分別置于加墊濾網(wǎng)的漏斗中，加入超純水使土壤全部浸潤，1 h后打開漏斗下端的止水夾收集分離出來的土壤線蟲，然后關(guān)閉止水夾，再加入超純水使土壤全部浸潤。重復(fù)上述操作，每隔1 h取樣1次〔8〕，直至72 h。將收集到的線蟲溶液放置于100 mL的血清瓶中，72 h線蟲收集完成后將線蟲溶液定容至100 mL。

1.2.3 計數(shù)將血清瓶中溶液搖勻后，用移液槍吸取10 mL的線蟲溶液至蛇形計數(shù)板中，在體視鏡下用解剖針挑取線蟲至細(xì)胞板中保存并用計數(shù)器計數(shù)。當(dāng)所挑取的線蟲數(shù)量大于150條/10 mL時，重復(fù)計數(shù)3次，取平均值后計算每個樣品的線蟲總數(shù)（100 mL線蟲溶液中的線蟲數(shù)量即為對應(yīng)樣品中的線蟲總數(shù)）；若每次所取樣品挑取的線蟲數(shù)量不足150條/10 mL時則需完全取樣，直至全部線蟲溶液被挑取計數(shù)完畢為止。

1.2.4 裝片制作將石蠟放置于培養(yǎng)皿中并在電熱板上加熱至融化，用自制的中空玻璃印章蘸取融化的石蠟，迅速蓋在載玻片上，冷卻后在載玻片中央形成一個密閉的石蠟圈，之后在石蠟圈中央滴1滴甘油，挑取不多于10條的線蟲到甘油中，輕輕蓋上蓋玻片，并置于電熱板上使石蠟融化，融化后移開電熱板冷卻，冷卻后固化的石蠟將載玻片與蓋玻片黏合，在制作好的裝片上標(biāo)記樣品編號及裝片編號后待檢。

1.2.5 拍照與鑒定用CCD成像顯微鏡（尼康E100+奧林巴斯DP26 CCD采集器）拍攝土壤線蟲的形態(tài)（唇、口針、食道球、生殖腺、陰門、尾及尾腺），同時測量線蟲的體長、口針長度、最大體寬、體前端至食道與腸連接處的距離、尾長，并計算a=體長/最大體寬；b=體長/體前端至食道與腸連接處的距離；c=體長/尾長，用來輔助鑒定。分類鑒定參考《長白山森林土壤線蟲》〔8〕《中國土壤動物檢索圖鑒》〔9〕及De nematoden van Nederland〔10〕，鑒定至屬。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計對分離得到的線蟲進(jìn)行累積計數(shù)（即2 h的結(jié)果為第1 h與第2 h結(jié)果的加和，3 h的結(jié)果為第1、2、3 h結(jié)果的加和，以此類推，直到第72 h），分別計算12、24、36、48、60、72 h的累積分離率。累積分離率=該時長累積分離線蟲數(shù)量/72 h累積線蟲總數(shù)量×100%。

線蟲種類的鑒定每隔24 h鑒定1次，分別鑒定24、48、72 h所收集的每份樣品的線蟲種類。

1.4 營養(yǎng)類群劃分依據(jù)Yeates等〔11〕的方法將線蟲劃分為4個營養(yǎng)類群：植食性線蟲、食細(xì)菌線蟲、食真菌線蟲、雜食-捕食線蟲。

2 結(jié)果

2.1 土壤線蟲群落組成及營養(yǎng)類群所有土壤樣品中共分離得到土壤線蟲24 777頭，屬線蟲門2綱6目21科35屬（其中有2科未鑒定到屬）。在所處理的樣品中，稀有類群分布于原桿屬（Protorhabditis）、滑刃屬（Aphelenchus）、螺旋屬（Helicotylenchus）等26個科屬中；常見類群中棱咽屬（Rhabdolaimus）為食細(xì)菌線蟲，其他均為雜食-捕食線蟲；無優(yōu)勢類群。見表1。

表1 實驗樣品中土壤線蟲的群落構(gòu)成

2.2 不同分離時長下土壤線蟲種類的分離差異從線蟲的分離種類看，24 h與48 h之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（21.00±2.54 vs.21.00±1.00，n=9，P=0.817），說明24 h分離時長就可滿足種類分離要求。

2.3 不同分離時長下土壤線蟲的累積分離率實驗結(jié)果顯示在分離時長為12 h時，線蟲的平均累積分離率為75.86%（69.99%～81.11%）；24 h平均累積分離率為97.09%（95.59%～98.35%）；36 h平均累積分離率已經(jīng)到99.63%（99.17%～99.80%）。見圖2。

圖2 不同分離時長土壤線蟲的累積分離率

3 討論

本次收集到的線蟲數(shù)量龐大、類群完整，包括植食性線蟲、食細(xì)菌線蟲、食真菌線蟲、雜食-捕食線蟲，結(jié)論具有普適性且可靠，為貝爾曼漏斗法分離時長的設(shè)定提供了有力支持。就分離的種類而言，24 h的分離時長已經(jīng)滿足了實驗的分離要求；就分離數(shù)量而言，36 h累積分離率達(dá)到99%以上，是最優(yōu)的分離時長。綜合分離種類及數(shù)量兩方面的要求，我們建議貝爾曼漏斗法分離時長為36 h，這個時長與24 h相比，可多收集近3%的個體，分離完整性顯著增加；而與48 h相比，可減少12 h的實驗時長，較大程度降低了分離時間，兼顧了實驗的工作量和可信度。

貝爾曼漏斗法利用線蟲的蠕動和自身重力進(jìn)行分離收集，要求被分離的線蟲相對活躍，時間過長線蟲死亡后也必定會影響分離效果，結(jié)果也顯示36 h后線蟲的累積分離率基本穩(wěn)定。同時受到物種活動特性和樣品送檢時效性的限制，如果需要對土壤線蟲進(jìn)行較精確計數(shù)或采樣送檢時間間隔較長時，建議使用以浮聚為主要原理的線蟲分離方法，雖該原理支持的方法實驗步驟繁雜且耗時長，但對樣品中線蟲的活性沒有要求。

基于分離種類而言24 h就已經(jīng)達(dá)到了最大的分離效率，但基于分離數(shù)量考慮36 h才達(dá)到最佳的分離效率，綜合評價土壤線蟲的分離種類和數(shù)量，推薦貝爾曼漏斗法分離選取36 h的分離時長。本研究也提示，從采樣至送檢間隔時間過長且線蟲活性無法保證的研究不宜使用貝爾曼漏斗法進(jìn)行線蟲分離。

致謝：感謝大理大學(xué)三江并流區(qū)域生物多樣性保護(hù)與利用省創(chuàng)新團(tuán)隊、大理大學(xué)校級創(chuàng)新團(tuán)隊、云南省中國三江并流區(qū)域生物多樣性協(xié)同創(chuàng)新中心和大理大學(xué)東喜瑪拉雅研究院對本文提供的支持和幫助。