捕食線蟲真菌在無菌土壤中的競爭與共存機制初探

劉李蕾，鄧 巍，楊曉燕，2，3，肖 文，2，3，佘 容，3*

（1.大理大學東喜瑪拉雅研究院，云南大理 671003；2.云南省中國三江并流區(qū)域生物多樣性協同創(chuàng)新中心，云南大理 671003；3.大理大學三江并流區(qū)域生物多樣性保護與利用省創(chuàng)新團隊，云南大理 671003）

物種多樣性的形成和維持機制是生物多樣性研究的核心和前沿問題之一〔1〕。為回答這一問題，生態(tài)學家們進行著不懈的努力，提出了許多理論和假說，但目前仍存在許多爭論，其焦點是物種的競爭與共存的關系〔2〕。傳統(tǒng)的競爭排斥理論認為，如果不出現分化，生態(tài)位完全相同的2個競爭物種就不能穩(wěn)定共存于同一生境中〔3〕?，F代競爭共存理論則提出，即使物種間存在強烈的競爭，如果物種具有相似的競爭能力或競爭被某些外部因素削弱，互相競爭的物種也可以共存〔4〕。

微生物是生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，直接或間接地參與生態(tài)系統(tǒng)的各個環(huán)節(jié)〔5〕，是從微觀角度研究生態(tài)系統(tǒng)動態(tài)變化和功能關系的重要指標〔6-7〕，其群落構建與維持機制已成為目前微生物生態(tài)學研究的重點領域〔8〕。土壤生態(tài)系統(tǒng)中微生物物種多樣性形成和維持的影響因素（生物和非生物）較多〔9〕，土壤生態(tài)系統(tǒng)所含微生物種群結構復雜、數量龐大，絕大部分土壤微生物又難以培養(yǎng)〔7〕，這導致了土壤生態(tài)系統(tǒng)中的微生物種間競爭與共存關系尚存在較大爭議〔4〕，其研究遠滯后于動植物〔6〕。因此，選擇一個易于分離、培養(yǎng)、觀察和計數的微生物類群，在少干擾因素的環(huán)境下逐步開展微生物種間競爭與共存關系的研究是非常必要的。

捕食線蟲真菌（nematode-trapping fungi，NTF）是一類廣泛分布于各種生境的具有生防價值的真菌，其既可營腐生生活，又可以營養(yǎng)菌絲特化形成捕食器官（三維菌網、收縮環(huán)、黏球、非收縮環(huán)、黏性分枝）以捕食線蟲為生〔10〕。該類型真菌生長繁殖速度快、種類少（僅3屬97種，具三維菌網的Arthrobotrys屬有54種；具非收縮環(huán)、黏球的Dactylella屬有29種；具收縮環(huán)的Drechslerella屬有14種）〔11-12〕。實驗室條件下容易分離、培養(yǎng)，低倍鏡下（80×）即可見，易于計數。Arthrobotrys屬因具有生長快和腐生能力強的特點，是各種生境中的優(yōu)勢種屬〔13-14〕。少孢節(jié)叢孢（Arthrobotrys oligospora）、彎孢節(jié)叢孢（Arthrobotrys musiformis）、奇妙單頂孢（Arthrobotrys thaumasium）3種均為該屬中的常見種，相互之間形態(tài)差異較大、易區(qū)分〔11〕。因此，本研究以無菌土為營養(yǎng)基質，將上述3種NTF以單獨、同時和不同順序的植入方式植入到無菌土中，每隔7 d檢測3種NTF的檢出率，連續(xù)檢測11周，分析不同種NTF的競爭與共存關系，研究結果將有助于對微生物多樣性形成和維持機制的了解。

1 材料與方法

1.1 菌株實驗菌株由大理大學東喜瑪拉雅研究院菌種資源中心提供，菌種編號分別為：JA52（A.oligospora）、JA15（A.musiformis）、JA109（A.thaumasium），采用土管法室溫保存于大理大學東喜瑪拉雅研究院菌種資源中心。

1.2 培養(yǎng)基及菌苔制備制備玉米粉瓊脂固體培養(yǎng)基（corn meal agar medium，CMA）：取20 g玉米粉、20 g瓊脂，加入1 000 mL蒸餾水〔11〕，高壓滅菌后冷卻至45℃傾倒于培養(yǎng)皿。將菌種接種于CMA，26.5℃培養(yǎng)7 d后備用。

1.3 基質-無菌土壤自大理大學茶園采集土層3～50 cm處的濕潤、肥沃土壤，去除較大的顆粒物及樹根，過20目篩，取篩下土壤密封保存后帶回實驗室，121.3℃高壓滅菌30 min，隔夜再滅菌1次以殺死產芽孢類微生物，獲得無菌土壤。將其分為30份，每份100 g，放入自封袋中，置于陰暗干燥的室溫條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 誘餌線蟲的制備采用燕麥培養(yǎng)基培養(yǎng)全齒復活線蟲（Panagrellus redivivus），貝爾曼漏斗法分離出線蟲后，用無菌水稀釋為5 000條/L的誘餌線蟲懸浮液，備用〔11〕。

1.5 微宇宙實驗以直徑6 mm的無菌打孔器自培養(yǎng)好的CMA培養(yǎng)皿上取菌苔，按不同方式人工植入無菌土壤中。見表1。每種植入方式重復5次，每份無菌土壤中合計植入菌苔15個；混合植入時，每個菌種各植入5個菌苔?；靹蚝笫覝嘏囵B(yǎng)，并以植入菌種時間為起點，每隔7 d對土樣進行NTF檢測，連續(xù)檢測11周，實驗結束時共采集2 750個樣品。見圖1。

表1 菌種植入方式及次序

圖1 微宇宙實驗和取樣方法示意圖

1.6 NTF的檢測用無菌牙簽從人工植入了NTF的無菌土壤中挑取土樣，使用誘餌平板法檢測NTF〔11，15〕。每周取樣時，從每個處理組中重復采集25次樣品，取樣量為1 g/次，培養(yǎng)7 d后置于體視顯微鏡下進行檢測，檢測結果記為土樣檢出或未檢出某個菌種。見圖2。

圖2 捕食線蟲真菌檢測流程圖

1.7 數據分析根據土樣檢出頻次計算每份土樣檢出率。檢出率=（某個種檢出的土樣數/25）×100%，其中，25為總取樣次數。

2 結果

2.1 NTF單獨植入無菌土壤后檢出率變化3種NTF單獨植入無菌土壤后，前5周的檢出率均較高，A.musiformis均為100%，另外2個種檢出率有輕微波動，但也接近100%；6～8周，3個種均呈現波動下降趨勢；之后A.oligospora和A.musiformis波動上升，而A.thaumasium則在第8周快速增加后隨即在第9周急劇下降，第11周接近于0%。見圖3。

圖3 NTF單獨植入后檢出率變化情況

2.2 NTF同時植入無菌土壤后檢出率變化3種NTF同時植入無菌土壤后，A.musiformis檢出率在前7周均保持在85%以上，第8周時降至整個周期的最低點，第9周回升至68%，之后又持續(xù)下降，至檢測結束時檢出率為38%；A.thaumasium在第1周檢出率低于20%，隨后大幅增加至第3周的84%，在第4周開始波動下降，第8周時為最低，至檢測結束時檢出率為16%；A.oligospora第1周檢出率低于20%，隨后大幅增加至第2周的65%，但在第3周又下降至30%，隨后持續(xù)波動，第7周出現高峰，而在第4、8、9、11周基本趨近于0%。整個實驗周期中，A.musiformis的檢出率始終高于其余2種，A.oligospora檢出率在大部分檢測時間點均為最低（僅第2、10周略高于A.thaumasium），且整個周期中的波動幅度最大、頻次最高。見圖4。

圖4 NTF同時植入后檢出率變化情況

2.3 NTF按不同順序植入無菌土壤后檢出率變化按不同順序在無菌土壤中依次植入NTF，3個種在不同時間的檢出率存在明顯差異。見圖5。A.musiformis無論以何種順序植入無菌土壤后其檢出率都基本高于其余2種，且A.musiformis在第2周植入的情況下，3個種在第11周的檢出率均較高（圖5B和D），尤其是按A.thaumasium、A.musiformis和A.oligospora（圖5D）的順序植入后3個種在第11周的檢出率均保持在最高水平，而A.musiformis在第3周加入時，3個種在第11周的檢出率均較低，幾乎接近于0%（圖5A和C）；除j組（圖5F）外，A.oligospora的檢出率在其他2個種加入后的1周均顯示出下降趨勢。

圖5 NTF按不同順序植入后檢出率變化情況

3 討論

通常情況下，生態(tài)位相近的物種在同一生境下勢必面臨有限資源的競爭，而競爭能力強的物種將在群落構建中占優(yōu)勢〔16〕。本研究中，3個物種在沒有其他生物因素的干擾下，它們同時出現在無菌土壤中時，A.musiformis的檢出率在前6周與單獨存在時無明顯差異，而A.thaumasium和A.oligospora在前6周的檢出率均顯著低于單獨存在時；無論以何種順序添加3個物種到土壤中，A.musiformis都可以在較短時間內獲得生長優(yōu)勢并保持到監(jiān)測結束。以往對不同生境下NTF的資源調查結果顯示，A.oligospora是大多數生境里的優(yōu)勢種〔17〕，而在高海拔區(qū)域、溫泉等惡劣環(huán)境中，A.musiformis表現出了較好的抗逆性，是這些環(huán)境中的優(yōu)勢種〔18-19〕，說明A.musiformis具備較強的競爭能力，在NTF群落構建過程中占據了較明顯的優(yōu)勢。

經典生態(tài)位理論認為，2個物種在沒有生態(tài)位分化的前提下是無法穩(wěn)定共存于同一生境中的〔3〕，但對不同生境中NTF的調查結果顯示，沒有明顯生態(tài)位分化的Arthrobotrys屬NTF能在同一生境下共存，只是不同種的數量存在差異〔20〕。本研究無論是將3個種同時植入或按不同順序植入到無菌土壤后，在不同時間段均能同時檢測到3個種。而且3個種同時定植于土壤后，在第11周的檢出率雖均低于60%，但都有檢出。在單獨植入實驗中A.thaumasium第11周的檢出率為0%，說明生態(tài)位相近的NTF在同一生境中不只存在競爭，也存在協同共存效應。這種協同效應可能是因微生物多樣的代謝途徑和代謝產物使其能夠在競爭中實現共存〔21〕，也可能是相互之間的生活史周期存在交錯從而形成空白斑塊〔22〕，為群落中弱競爭者提供了生存條件，進而實現共存，以提高群落多樣性，促進群落的穩(wěn)定存在。

研究資料顯示，先植入物種因得到更多的生長資源而獲得快速生長的機會，相較于后期植入的物種在數量上占有絕對優(yōu)勢，呈現出群落構建中的優(yōu)先效應〔23〕。本研究中，優(yōu)先植入的物種，因為沒有競爭者，其檢出率在第1周結束時均可達到100%。但隨著其他物種的植入，僅A.musiformis的檢出率沒有受到明顯影響，可以維持較高的檢出率至第10周；而A.oligospora的檢出率會受到后期植入物種的影響急劇下降，A.thaumasium的檢出率也有一定程度下降且后期的物種植入順序對其下降幅度有影響，特別是在植入A.oligospora后再植入A.musiformis。由此可見，在NTF的群落構建中也存在優(yōu)先效應，但優(yōu)先效應的持續(xù)時長受群落中不同物種競爭能力差異影響〔23〕。實驗所使用的3個物種中，A.musiformis競爭能力強，因此能抵抗后期植入物種的競爭長時間保持其優(yōu)先植入的優(yōu)勢。同時，我們發(fā)現，A.thaumasium的植入可以協助A.oligospora抵抗A.musiformis的競爭，使得其優(yōu)先效應幾乎可以保持與A.musiformis相同的時長。因此，優(yōu)先效應的持續(xù)時長還受到物種間協同作用的影響。

4 總結與展望

同屬不同種的NTF在資源有限時相互之間存在競爭作用，但這種競爭作用并不是排除某個物種，而是物種間的競爭性共存。在此過程中，到達生境的先后順序會影響最終群落構成，體現出群落構建的優(yōu)先效應，不過，優(yōu)先效應的持續(xù)時長受物種本身競爭能力和物種間系統(tǒng)作用的影響。本研究只是基于前期對自然環(huán)境中NTF活力監(jiān)測結果而設計的11周連續(xù)檢測，尚缺乏更長期的監(jiān)測數據以更全面了解NTF群落的動態(tài)變化。因此在未來的研究中，我們將增加監(jiān)測時長，并進一步對生成相同捕食器官及不同捕食器官的NTF開展交叉實驗，測定不同的實驗設計下的捕食效率，以探索不同組合下NTF的競爭與協同機制。本研究在推進微生物的競爭與協同機制理解的同時，也可為NTF生防研究提供參考。