外傷性視神經(jīng)病變動物模型的研究進展

孫 武,周 劍,巢國俊,廖 良,謝 琦,尚孟秋

(1.北京中醫(yī)藥大學,北京 100029;2.北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院,北京 100078;3.中國中醫(yī)科學院眼科醫(yī)院,北京 100040)

外傷性視神經(jīng)病變(traumatic optic neuropathy,TON)是一類通常由眼眶、眼睛或頭面部創(chuàng)傷引起的疾病,可導致嚴重的、不可逆轉的視力喪失。 國際視神經(jīng)創(chuàng)傷研究結果發(fā)現(xiàn),TON 患者的平均年齡為34 歲,患病最常見的原因是機動車、自行車事故,以及襲擊和跌倒事故[1]。 在閉合性顱腦損傷的患者中,TON 發(fā)病率為0.5%~5%[2]。 TON 根據(jù)引起損傷的機制分為直接外傷性視神經(jīng)病變(direct traumatic optic neuropathy,DTON)和間接外傷性視神經(jīng)病變( indirect traumatic optic neuropathy,ITON)。 DTON 多由槍彈、骨碎片,以及創(chuàng)傷造成的撕脫力或局部出血直接引起[2],ITON 則常繼發(fā)于眶上緣和額顳部顱骨區(qū)鈍傷,眶尖或視神經(jīng)管上傳遞的力會引發(fā)ITON[3]。 TON 目前尚無有效的治療措施,目前針對疾病治療的研究方向主要集中在視神經(jīng)的修復與再生[4-6]。 合適的動物模型是進行研究的重要手段,根據(jù)臨床損傷類型,目前模型大體分為兩種:直接損傷模型和間接損傷模型。

1 直接損傷模型

1.1 視神經(jīng)橫斷模型(軸切模型)

視神經(jīng)橫斷(optic nerve transection,ONT)模型造成的損傷屬完全性視神性損傷,接近臨床視神經(jīng)斷裂傷,該方法操作簡單易行,可保證實驗動物的損傷量一致。 步驟如下:沿頭部中線從眼睛前方0.5 cm 至后方1 cm 切開后,分離筋膜至眼眶骨,清理周圍組織。 逐一暴露眼部肌肉(上斜肌、內(nèi)直肌、提上瞼肌和上直肌)后進行牽引,顯示包繞視神經(jīng)的脂肪鞘。 剝離周圍結締組織,縱向切開脂肪鞘并去除脂肪,可見腦膜鞘包裹的視神經(jīng)。 旋轉視神經(jīng),于腦膜鞘無血管區(qū)域縱向切割,暴露白色視神經(jīng),將視神經(jīng)剪斷形成動物模型[7]。

ONT 模型主要用于研究視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglion cell,RGC)的凋亡和存活。 研究發(fā)現(xiàn),視神經(jīng)橫切術后14 d 損失了90%的RGC[8-10],死亡的主要機制是凋亡。 此外,軸切術后RGC 的細胞凋亡被延遲了大約4 d,為實驗操作留下了時間窗口[7]。 該模型另一個優(yōu)點是損傷后RGC 細胞存活率容易被定量化。 通過在切斷視神經(jīng)時將熒光示蹤劑(3% 熒光金)應用于視神經(jīng)斷端,或在軸突切斷前一周將示蹤劑注入上丘,可以隨時間追蹤RGC的存活情況。

作為研究RGC 細胞凋亡的可復制模型,ONT 模型容易建立,受損標準統(tǒng)一。 易于定量RGC 存活率的同時,具有高度可重現(xiàn)的細胞死亡時間過程。 在該模型基礎上可運用多種方法將靶標靶向視網(wǎng)膜或受損的RGC,以測試實驗性治療對眼底細胞存活的影響[11-16]。 此外,ONT 模型還能用于研究視神經(jīng)的完全橫斷對神經(jīng)系統(tǒng)其他部分造成的后續(xù)影響。作為直接損傷的典型模型,ONT 模型被廣泛運用于DTON 的相關研究,但造模過程中損傷引起的炎癥反應很難被減輕,對于后續(xù)藥物或其他治療措施的修復治療研究較為局限。 同時它不能作為一個理想模型進行ITON 的相關研究。

1.2 視神經(jīng)擠壓模型

視神經(jīng)擠壓傷(optic nerve crush,ONC)損傷模型是用于TON 的重要實驗模型,主要用于進行RGCs 存活和軸突再生方面的研究:施用示蹤染料3 d 后,于4 點鐘位置切開眼結膜。 鈍性分離外直肌,向前牽拉眼球,暴露白色視神經(jīng)。 借助交叉鉗在距眼球約2 mm 處對視神經(jīng)進行擠壓,持續(xù)3 s[17]。 造模中需注意擠壓神經(jīng)用力不可過大,時間不可太長,以免造成眼動脈損傷,從而導致隨后的視網(wǎng)膜缺血。 此外,在暴露視神經(jīng)時勿損壞周圍血管。

目前ONC 模型造模過程中的擠壓時間差異較大,從3 s 到60 s 不等[18-24]。 根據(jù)動物類型、模擬損傷程度或造模后的分析方法不同,時間各有差異。 ONC 模型對視神經(jīng)造成的擠壓傷會導致RGC逐漸凋亡,可用于研究視神經(jīng)元死亡和存活的一般過程。 另外,該模型在TON 的實驗性藥物研究中運用普遍,常被用來鑒定和測試潛在的治療劑,以治療不同類型的視神經(jīng)病變。 ONC 模型操作簡單,創(chuàng)傷較小,損傷明確,術后動物存活率高,具有高度可重復性。 相對于ONT 模型更為溫和,可保持視神經(jīng)鞘膜完整性。 該模型與ONT 模型由于操作簡單、造模設備易獲取等原因,是目前最常用的TON 模型。但ONC 模型仍存在夾持時間差異大、夾力大小不易控制、損傷程度難以精準定量等問題。

1.3 視神經(jīng)牽拉傷模型

視神經(jīng)牽拉傷動物模型類似于手術牽拉傷及部分外傷性損傷,按損傷方向可分為與視神經(jīng)管平行或與之垂直。 前者類似視神經(jīng)彌漫性軸索損傷,后者與視神經(jīng)管骨折所致的切割傷相似。Gennarelli 等[25]利用豚鼠制作牽拉損傷模型,將豚鼠全麻后暴露視神經(jīng),固定于立體定位架上,利用汽缸-吊帶-視神經(jīng)的傳動裝置將視神經(jīng)拉直,進行造模。 該模型模仿了視神經(jīng)彌漫性軸索損傷。 王開仕等[26]對該模型進行簡化:將大鼠球結膜切開1/4,用血管鉗分離至球后,將眼球向外托出至球后與眶前骨緣齊平,隨后立即恢復眼球至正常解剖位置。 該模型也出現(xiàn)了類似TON 的神經(jīng)纖維超微結構變化,并伴有相應的電生理表現(xiàn)。 目前興起的橫向定量牽拉法,暴露視神經(jīng)后,用聚酯縫合線于球后1~2 mm 處圈住視神經(jīng)并打結,縫線另一頭連接橫向張力計,以不同拉力垂直于視神經(jīng)方向水平牽拉并持續(xù)一定時間,進行造模。 該方法損傷易于定量,視神經(jīng)受力均勻,對視網(wǎng)膜各個部位的損傷基本相同,且所需器械簡單易控,是較理想的視神經(jīng)損傷模型[27]。 但此種方法操作相對復雜,對術者要求較高,易出現(xiàn)手術副損傷。

目前視神經(jīng)牽拉傷模型,不同動物種類的牽拉方法和作用力存在較大差別[28]。 作用力大小和作用時間缺乏統(tǒng)一規(guī)范,是此類模型的局限。

1.4 視神經(jīng)慢性壓迫損傷模型

視神經(jīng)慢性壓迫損傷模型可模擬外傷后血腫、周圍組織的炎性水腫對視神經(jīng)的慢性壓迫損傷,為TON 的繼發(fā)性損傷研究提供基礎。 呂立權等[29]在貓模型進行造模,取目外眥及耳屏連線皮膚切開,分離肌肉、骨膜后,磨穿顱骨并擴大骨窗。 顯微鏡下切開硬腦膜至骨緣,排除腦脊液后, 抬起顳葉腦組織,沿蝶骨棘深入直至暴露視神經(jīng)。 在視神經(jīng)外側植入不可脫球囊, 然后接導管穿皮下引至頸背部,完成造模。 吳昆旻等[30]在兔模型進行造模,經(jīng)眶上緣分離切斷上、內(nèi)直肌,暴露視神經(jīng)孔,放置一細端直徑2 mm,尾端直徑4 mm,高3 mm 的圓錐軟硅膠于孔內(nèi),對視神經(jīng)進行壓迫造模。

此類造模方法簡單,隨著時間推移,視神經(jīng)受壓迫損傷也逐漸加重,可模擬出外傷后出血、腫脹逐漸加重而導致的軸突變性等病理變化[31]。 但該方法損傷無法定量,同時易于引發(fā)感染。

2 間接損傷模型

2.1 眼沖擊傷模型

眼沖擊傷模型模擬了炸藥傷、爆破傷等產(chǎn)生的沖擊波傷害,對于研究爆炸沖擊傷所造成的TON 研究起到了重要作用。 此模型需要一套特定的操作系統(tǒng),包括加壓空氣罐,連接空氣罐的機槍管彩彈槍,在暴露動物眼睛時保護眼睛不受直接傷害和回彈傷害的密閉空間,以及可對槍管進行操控的移動平臺。 將小鼠眼球位置固定后,調(diào)整預期壓力,操控機槍槍口與鼠眼至合適距離,對準眼睛進行爆破,建立模型[32]。 該操作裝置通過計算預期壓力,然后根據(jù)預期壓力確定最佳壓力傳感器的位置,進而調(diào)整輸出壓力,實現(xiàn)精準沖擊傷。

此系統(tǒng)產(chǎn)生的損傷與眼部沖擊傷患者所受損傷相似,可再現(xiàn)地使眼睛暴露于已知壓力的沖擊波中。 由于身體其余部分都受到了保護,因此所有傷害都是眼睛暴露于加壓空氣沖擊的直接結果,且對側眼大部分不受影響。 但此方法需要專門的操作系統(tǒng),且動物死亡率高,隨壓力變化死亡率達24%~46%不等[32]。 受試眼承受沖擊波損傷的同時會產(chǎn)生嚴重前后節(jié)損傷,視網(wǎng)膜組織破損嚴重,對視網(wǎng)膜組織檢測造成極大干擾。 該模型仍需進一步完善。 盡管如此,這也是一個重要的新模型,可用于觀察封閉式爆炸沖擊波所致TON 的短期和長期病程,研究爆炸損傷引起的病理改變及其分子機制,是檢測爆炸沖擊傷所致TON 的潛在治療方法的理想模型。

2.2 眼部撞擊模型

眼部撞擊模型所受損傷類型,以及之后的病理變化接近于臨床ITON,王一等[33]在兔模型中運用閉合和開放打擊法建立間接損傷視神經(jīng)動物模型:(1)閉合打擊法:將兔頭置于工作臺圓孔窗下,選致傷眼眶上緣切跡內(nèi)、后各0.5 cm 為打擊點,用聚乙烯板保護打擊點,打擊錘自由落體對準打擊點進行打擊造模;(2)開放打擊法:耳緣靜脈注射麻醉后,顯露兩側眶上緣切跡和眶壁,咬骨鉗向視神經(jīng)管方向咬除部分眶壁骨板(深7~8 mm、寬6 mm),兔頭置于致傷管下,致傷卡頭卡在視神經(jīng)孔上方眶板上,調(diào)整卡頭和兔頭角度使卡頭與致傷管成一線,致傷球從管上端自由下落擊于卡頭。 閉合打擊法組織損傷嚴重,對對側眼影響較大,且造模成功率低,不宜推廣。 開放性打擊去處部分眶壁后打擊力量更集中,所需致傷力度小,造模成功率較高。 張琳琳等[34]應用液壓沖擊顱腦損傷儀(fluid percussion brain injury device,FPI)產(chǎn)生的的沖擊力打擊Wistar 大鼠左、右眼眶內(nèi)貼近眼球部的視神經(jīng),建立TON 模型。 造模后的閃光視覺誘發(fā)電位(flash visual evoked potential,F-VEP)、眼眶磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)、視網(wǎng)膜病理等均表現(xiàn)出特征性變化,如F-VEP 主波潛伏期較損傷前延長、振幅降低,眼眶MRI 顯示損傷部位視神經(jīng)信號增高,組織病理學觀測到視網(wǎng)膜神經(jīng)元數(shù)量減少,視神經(jīng)軸索萎縮變性、髓鞘腫脹等,與臨床視神經(jīng)損傷改變相近。

目前出現(xiàn)了一種微創(chuàng)模型:受控軌道撞擊(controlled orbital impact, COI)模型[35]。 在眼內(nèi)眥切開一個切口,并通過非侵入性眼球牽開器,將眼球從眼眶邊緣牽開,使眼外組織暴露。 用金屬撞擊器尖端對ON 后2~3 mm 的眼眶區(qū)眼外組織進行撞擊,創(chuàng)傷的強度可從輕度調(diào)整到重度。 COI 模型損傷參數(shù)(速度,挫傷深度和挫傷時間)可量化,創(chuàng)傷的強度可人為操控。 此模型能夠?qū)崿F(xiàn)ERG 反應減弱的可重復電生理終點,小鼠體重以及相對應的撞擊速度是成功復制一致TON 結果的關鍵因素。 由于不涉及眼內(nèi)手術,不會產(chǎn)生手術變異性和術中組織損傷的干擾。 沖擊直接作用于眼外部位的軟組織,不涉及眶上脊,因此骨折的可能性以及傳遞到對側眼的創(chuàng)傷影響很小,造模過程不會影響到對側視神經(jīng)。 研究結果亦顯示對側眼與正常小鼠的眼睛沒有顯著差異,可較好地作為內(nèi)部對照,減少小鼠間的個體差異[35]。 且與其他間接TON 模型(如眼沖擊傷模型)相比,很少發(fā)生與損傷相關的眼部合并癥(如白內(nèi)障和角膜浮腫),死亡率低。 COI 模型具有侵入性小,操作簡單,控制精確,重復性好等優(yōu)勢,并能引起不同嚴重程度的TON。 該模型的主要局限性是需要一個兼容軟件包的專用設備設置平臺,以便調(diào)整造模過程所需參數(shù)。

2.3 超聲誘導的TON 模型

最近出現(xiàn)的超聲誘導的 TON 模型[36](sonication-induced TON model,SI-TON),利用超聲波產(chǎn)生的振動波進行造模:小鼠麻醉后,在每只鼠的眶上嵴內(nèi)側2 mm、距離中瞳孔垂直線2 mm 處放置一個帶有微尖探針(直徑3 mm)的實驗室超聲儀。 調(diào)整平臺,使微尖探針與眶上直接接觸,然后激活超聲儀,以35%或40%的振幅發(fā)出500 ms 的電擊進行造模(產(chǎn)生230~250 μm 的振動),對側眼用作對照。 由于眶上嵴是解剖上最易接觸到的刺激視神經(jīng)管的部位,因此超聲脈沖能直接通過視神經(jīng)的骨骼傳遞并被視神經(jīng)吸收,聲能集中在視神經(jīng)管的入口處,造成損傷。

SI-TON 模型在正確操作的情況下死亡率低,無眼部并發(fā)癥,并可對RGC 計數(shù)進行量化。 該模型模擬了臨床TON 損傷的機制,實現(xiàn)了RGC 缺失的最終結果,且在觸發(fā)軸突變性和RGC 死亡的同時保留完好的組織超微結構,為評估新的治療策略,促進RGC 存活和軸突再生提供了最寬松的環(huán)境。 損傷后炎癥事件的級聯(lián)序列特征也能幫助更好地理解TON 的病理生理變化。 SI-TON 模型易于實現(xiàn),可重復。 同時,通過定向可調(diào)能量水平和顱骨傳遞,該模型可成為研究涉及單側或雙側視神經(jīng)的不同程度損傷的理想模型。 但此模型所需設備昂貴。 超聲能量從原發(fā)損傷部位散射,可能對對側視神經(jīng)造成損害,尤其在小鼠這樣的小型動物中,會影響對側眼作為完全對照的效果。 此外,操作步驟要求熟練,若定位不準確,超聲微尖端的錯位可導致不同程度的組織損傷,甚至眼球破裂。

3 模型評價方法

總結多種造模方法,目前TON 動物模型主要采用顱前正中矢狀線切口,經(jīng)上瞼結膜入路,通過直接或間接損傷視神經(jīng)眶內(nèi)段進行造模。 次日觀察術眼,如出現(xiàn)眼底缺血、白內(nèi)障等情況,造模失敗;若出現(xiàn)瞳孔散大、眼球無明顯突出、直接對光反射消失、間接對光反射存在,則可視為成功模型。 對于具體的檢測評價方法,根據(jù)需求和研究方向不同,各有選擇。 一般包含RGC 存活率檢測,功能學檢測,形態(tài)學檢測等。 常見的RGC 細胞存活率檢測方法,可選用熒光金標記法[7],或brn3a 免疫熒光檢測[35]。 由于RGC 組織學細胞計數(shù)與視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層(retinal nerve fiber layer,RNFL)和內(nèi)叢狀層(inner plexiform layer,IPL)的厚度相關[37],頻域相干光斷層成像(spectral-domainoptical coherence tomography,SD-OCT)也可通過測量視網(wǎng)膜厚度從側面反應RGC 的丟失,RNFL 和IPL 結合層厚度的減少表明視網(wǎng)膜中RGC 的損失。 功能檢測主要包含ERG 檢測及F-VEP 檢測[32],其中ERG 種類較多,包含pattern ERG、flash ERG 和pSTR 等[35-36,38-40]。透射電鏡、SD-OCT、MRI 等可用于形態(tài)學檢測[34,36]。

4 討論

目前TON 動物模型大致可分為直接損傷和間接損傷模型,盡管臨床中最常見的損傷類型是ITON[41],當下研究普遍運用的還是ONT、ONC 及牽拉傷模型等直接損傷模型,間接損傷模型運用仍因設備缺乏、操作復雜等問題受到限制。 新的模型如SI-TON、COI 等,雖然有部分局限,但對于特定損傷類型的研究,仍提供了較大幫助。 TON 常用的動物模型包括大鼠、兔、貓等。 其中大鼠視網(wǎng)膜易于分離,取材后完整性較好,易鋪片,目前最為常用。 現(xiàn)將常見模型優(yōu)勢及局限列于表1,以供參考。

表1 常見TON 動物模型Table 1 Common TON animal models

理想的TON 損傷動物模型應滿足以下條件:(1)盡可能的復制在人體所患TON 中發(fā)現(xiàn)的病理變化和結局;(2)可量化和可調(diào)節(jié)的外力,能造成精準可控的局灶性視神經(jīng)病變,無眼部其他部位的損傷;(3)操作簡單且可復制;(4)有客觀參數(shù)可量化和展現(xiàn)RGCs 和軸突損傷的時間過程。 對于ITON,還應盡量模擬間接閉合性顱腦外傷的臨床特征,避免手術過程中直接接觸視神經(jīng)而造成額外的視神經(jīng)損傷。

針對具體的TON 病因和研究需求,采用不同的模型是有必要的。 對直接損傷模型中ONC、牽拉模型、慢性壓迫模型等的損傷程度和標準進行統(tǒng)一,對適合ITON 研究的新模型如COI、SI-TON 等模型做出進一步完善,以更好地開展TON 相關研究,是將來TON 動物模型研究的重要研究內(nèi)容之一。