江香薷水提液對(duì)高脂血癥大鼠胃腸生理生化及免疫功能的影響

陳雨然,劉 莉,李龍雪,洪 滔?,劉隆霸,楊志龍,程 洪,劉志勇,3?

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技中心,南昌 330004;2.江西醫(yī)療服務(wù)指導(dǎo)中心,南昌 330006;3.江西省中藥藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南昌 330004)

隨著人類生活水平的提高和生活節(jié)奏的加快,由于長(zhǎng)期的飲食不節(jié),導(dǎo)致肥胖、高脂血癥急劇增加,中醫(yī)認(rèn)為由于肥甘厚膩的飲食導(dǎo)致脾胃運(yùn)化失調(diào),以致攝入的水谷精微不能轉(zhuǎn)化成我們身體需要的能量和營(yíng)養(yǎng),而是轉(zhuǎn)化成痰濕,淤積在體內(nèi),若脾胃功能失常,飲食水谷不能正常的輸布,則聚而成痰、成飲,留貯體內(nèi)漸成肥胖[1-2]。 可見(jiàn)肥胖、高脂血癥的發(fā)生與形成與脾胃關(guān)系密切,“脾主運(yùn)化,輸布水谷精微,胃主受納,腐熟水谷”,脾胃消化、吸收、輸布功能正常,則水液輸布正常,異常則水濕不化,聚而生痰[3-4]。 而中藥江香薷,干燥地上部分入藥,既能調(diào)中溫胃,又能健脾化濕,還能開宣肺氣而利水消腫[5-7],有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)香薷揮發(fā)油能改善由于飲食不節(jié),潮濕環(huán)境,強(qiáng)迫游泳方法建立的濕困脾胃證大鼠的胃腸氣機(jī),調(diào)節(jié)水液代謝和機(jī)體免疫,提高中焦脾胃健運(yùn)發(fā)揮治療作用[8],為探討江香薷水提液是否對(duì)高血脂大鼠的胃腸生理生化、水液代謝和機(jī)體免疫有影響,故而本實(shí)驗(yàn)通過(guò)高脂飼料喂養(yǎng)大鼠形成高脂血癥模型,然后用江香薷水提液灌胃,來(lái)探討江香薷對(duì)高脂血癥大鼠胃腸道生理生化及免疫的影響,為江香薷更好在中醫(yī)藥及中獸藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)大鼠為SPF 級(jí)雌性SD 大鼠30 只,體重200~220 g,由江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(贛)2018-0001],大鼠飼養(yǎng)于江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)科中心無(wú)特定病原體級(jí)屏障系統(tǒng)內(nèi)[SYXK(贛)2017-0004],環(huán)境溫度為(21±1)℃、相對(duì)濕度46%~56%,飲水自由采集。 項(xiàng)目實(shí)施通過(guò)了江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的審查(JZLLSC2019-0157),并嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的3R 原則給予實(shí)驗(yàn)大鼠人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

江香薷(批號(hào):180823)購(gòu)自江西江中中藥飲片有限公司;江香薷水煎液,江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑組代煎,批號(hào):121223,規(guī)格:1 g(生藥)/1 mL,具體制備方法:1000 g 江香薷飲片加水10 L 水,浸泡1 h,煎煮,水提2 次,合并兩次濾液,濃縮至1 ∶1液,即為1 g(生藥)/1 mL 藥液,無(wú)菌密封4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、血清腺苷脫氨酶(ADA)、尿酸(UA)、肌酐(CRE)、尿素(UREA)、總膽汁酸(TBA)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、極低密度脂蛋白(LDL)、巖藻糖苷酶(AFU)、脂蛋白(a)(LP(a))試劑盒由上?？迫A試劑公司提供;血清胃動(dòng)素(MTL)試劑盒、胃泌素(GAS)試劑盒、淀粉酶(AMS)試劑盒、白細(xì)胞介素-6(IL-6)試劑盒、水通道蛋白2(AQP2)試劑盒、Na+-K+-ATP 酶試劑盒由上海赫澎生物科技有限公司提供;2%藍(lán)色葡聚糖2000(DB-2000)。

全自動(dòng)生化儀(貝克曼AU480); 酶標(biāo)儀(Thermo);顯微鏡(IX37 生物顯微鏡);電子天平(AUY120 島津分析天平)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物造模與分組

30 只大鼠檢疫室里適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d,Excel 輔助下的隨機(jī)數(shù)字法將其分為空白對(duì)照組6 只和余下24 只為高脂模型制作組。 6 只空白組給予湖北萬(wàn)千佳興基礎(chǔ)飼料(蛋白含量為20%),給予模型制作組大鼠高脂飼料,采用湖北萬(wàn)千佳興的基礎(chǔ)飼料,含量為79%,在這個(gè)基礎(chǔ)料的基礎(chǔ)上加入10%高膽固醇的豬油油脂、10%膽固醇、1%膽鹽形成高血脂的造模飼料,四周后眼眶靜脈叢采血檢測(cè)血脂水平,根據(jù)甘油三酯水平留下18 只作為高脂血癥的大鼠模型,再隨機(jī)分為高血脂模型對(duì)照組、江香薷水提液高劑量及其低劑量組,每組6 只。 江香薷水提液高劑量為1 g/kg,低劑量為0.2 g/kg,灌胃量為1 mL/100 g,每天一次,每周記錄一次大鼠體重,并調(diào)整江香薷的給藥量。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物臨床表現(xiàn)的觀察

實(shí)驗(yàn)期間,各組采食、飲水、活動(dòng)正常,但模型組毛發(fā)粗糙,江香薷低、高劑量組毛發(fā)潔白光亮。

1.3.3 血常規(guī)檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束,取血500 μL,5 分類動(dòng)物血球計(jì)數(shù)儀檢測(cè)血常規(guī)。

1.3.4 血清生化指標(biāo)檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束,取血2 mL,貝克曼480 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)肝腎功能,血糖血脂指標(biāo)。

1.3.5 腸胃指標(biāo)的測(cè)定

(1)胃排空及小腸推進(jìn)度試驗(yàn)。 參考文獻(xiàn)[8]方法進(jìn)行。

實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水16 h,然后按每只大鼠0.4 mL 給予2%藍(lán)色DB-2000(葡聚糖2000)灌胃,30 min 后對(duì)胃和小腸進(jìn)行取材。 將取下的小腸攤平于平整的板上,先量取幽門括約肌至色素最前端的距離,然后量取幽門括約肌至盲腸的距離,據(jù)此計(jì)算小腸推進(jìn)率。 小腸推進(jìn)率=小腸內(nèi)色素推進(jìn)的長(zhǎng)度值/全小腸長(zhǎng)度值×100%

(2)腸管含水量的測(cè)定

大鼠取血后處死,取大腸5 cm 左右,在生理鹽水中輕輕晃動(dòng)腸道以洗去腸管中的食物殘?jiān)约皻埩粞?然后用濾紙請(qǐng)按擦干,再放置于一張潔凈的濾紙上,連同濾紙進(jìn)行稱重并記錄,稱重后的腸管標(biāo)本送入烘箱中,60℃下恒溫烘干10 h,10 h 后取出再次連帶濾紙一同稱重并記錄第二次的值,按如下公式計(jì)算即位腸管含的水量。 腸管含水量=(大腸濕質(zhì)量-大腸干質(zhì)量)/大腸濕質(zhì)量×100%。

(3)血清胃動(dòng)素、胃泌素、淀粉酶活性、AQP2 和能量代謝指標(biāo)的檢測(cè)

大鼠采用股動(dòng)脈放血法采血,收集于生化采血管中,室溫下斜面靜置,然后以轉(zhuǎn)速3000 r/min 的離心機(jī)內(nèi)離心10 min,仔細(xì)分離上層血清,置-80℃冰箱保存,按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書操作測(cè)量血清胃動(dòng)素和胃泌素和Na+-K+-ATP 酶、淀粉酶活性和水通道蛋白2(AQP2)測(cè)定。

1.3.6 免疫學(xué)和炎癥因子的檢查

血清免疫球蛋白(IgA、IgM、IgG)、補(bǔ)體(C3、C4)的檢測(cè)。

同上處理的血清,貝克曼全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)IgA、IgM、IgG、C3、C4 水平,按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書操作測(cè)量血清IL-6 和TNF-α 的水平。

1.3.7 胸腺及脾臟器系數(shù)的測(cè)定和主要臟器的病理學(xué)觀察

實(shí)驗(yàn)結(jié)束,胸腺和脾臟器系數(shù)的獲取,動(dòng)物處死后將胸腺及脾及時(shí)取出,分離干凈后用濾紙吸去血污,立即在電子天平上稱取重量,記錄數(shù)值并按如下計(jì)算公式計(jì)算臟器系數(shù):臟器系數(shù)=臟器質(zhì)量(克)/體重(克)×100%。 心、肝、肺、胃、腸道等主要臟器無(wú)明顯大體改變,將解剖后的臟器固定福爾馬林溶液中24 h 之后沖洗、脫水、石蠟包埋固定后制片,蘇木精-伊紅(HE)染色,光學(xué)顯微鏡下觀察臟器是否存在顯微變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)以Excel 建表后,使用IBM SPSS 20 應(yīng)用軟件進(jìn)行組間數(shù)據(jù)顯著性檢驗(yàn),采用單因素ANOVA檢驗(yàn)體重、血常規(guī)、血生化指標(biāo)、ELISA 數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,作圖軟件用GraphPad Prism 8.0.2 應(yīng)用軟件。

2 結(jié)果

2.1 造模分組血脂水平和灌服江香薷后血脂的變化

由表1 可見(jiàn),造模4 周后給藥前各組的TCH 水平明顯高于正常對(duì)照組,灌胃江香薷后TG,TCH 和LDL 水平與模型組比較有所降低,且差異顯著P<0.05,而對(duì)HDL 的影響不大。

表1 造模分組血脂水平和灌服江香薷后血脂的變化Table 1 Blood triglyceride content after model establishment and effects of MCM on reducing blood lipid in rats

2.2 江香薷對(duì)高脂血癥大鼠體重的影響

各個(gè)試驗(yàn)組在給藥期間均無(wú)死亡,各個(gè)試驗(yàn)組在喂養(yǎng)過(guò)程中,體重呈遞增狀態(tài),但是江香薷給藥組在給藥4 周后體重與模型組比較開始呈下降狀態(tài),差異顯著(P<0.05),見(jiàn)圖1。

圖1 各組實(shí)驗(yàn)大鼠實(shí)驗(yàn)期間體重變化Figure 1 Changes in body weight of experimental rats in each group during the experiment

2.3 血液常規(guī)檢測(cè)結(jié)果

血常規(guī)檢查發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比模型組江香薷組大鼠的紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板、均無(wú)明顯變化,見(jiàn)表2。

表2 灌胃江香薷后各組大鼠血常規(guī)的影響Table 2 Effects of blood routine of rats in each group after administering MCM

2.4 血清檢生化指標(biāo)測(cè)結(jié)果

2.5 腸含水量和推進(jìn)度指標(biāo)的變化

高脂飲食導(dǎo)致腸道的水液積聚,含水量增加,推進(jìn)能力減慢,見(jiàn)圖3。 給江香薷后大腸含水量下降,推進(jìn)速度增加。

圖3 各實(shí)驗(yàn)組大鼠在食用江香薷后腸道相關(guān)指標(biāo)的影響Note. Compared with the normal control group, ?P<0.05. Compared with the high fat model group, #P<0.05.Figure 3 Effects of intestinal related indexes of rats in each experimental group after fed with MCM

2.6 血清胃腸動(dòng)力學(xué)指標(biāo)

高脂飲食導(dǎo)致腸道動(dòng)力學(xué)指標(biāo)改變,其中血清胃泌素(GAS)、淀粉酶(AMS)水平下降,而血清胃動(dòng)素水平(MTL)升高,灌服江香薷后血清胃泌素(GAS)、淀粉酶(AMS)水平升高而降低了胃動(dòng)素水平,見(jiàn)圖4。

圖4 江香薷對(duì)高脂血癥大鼠的血清胃腸動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的影響Note. Compared with the control group, ?P<0.05. Compared with the model group, #P<0.05.Figure 4 Effect of MCM on serum gastrointestinal kinetics in hyperlipidemia rats

2.7 腸道水通道蛋白和Na+-K+-ATP 酶含量檢測(cè)結(jié)果

如圖5 所示,與正常對(duì)照組比較,高脂模型組大鼠血清Na+-K+泵的活性減弱,水通道AQP2 含有量增加,差異達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著性差別(P<0.05) ; 與高脂模型組比較,江香薷水提液給藥組大鼠血清Na+-K+-ATP 泵活性有所增加,高劑量的江香薷組與正常對(duì)照組無(wú)差別;AQP2 水平低于模型組(P<0.05) 。

圖2 各組實(shí)驗(yàn)大鼠喂食江香薷后血清生化指標(biāo)的影響Note. Compared with the normal control group, ?P<0.05. Compared with the high fat model group, #P<0.05.Figure 2 Effects of serum biochemical indexes of experimental rats in each group fed with MCM

圖5 江香薷對(duì)各組大鼠血清Na+-K+-ATP 酶活性和AQP2 的影響Note. Compared with the control group, ?P<0.05. Compared with the model group, #P<0.05.Figure 5 Effect of MCM on serum Na+-K+-ATPase activity and AQP2 of rats in each group

2.8 免疫學(xué)檢測(cè)結(jié)果

江香薷對(duì)大鼠血清白介素IL-6、免疫球蛋白IGM、C3 補(bǔ)體的含有量影響,對(duì)疫球蛋白IGA、免疫球蛋白IGG、補(bǔ)體C4 無(wú)影響,與正常對(duì)照組比較,高脂模型組大鼠血清白介素IL-6 增加,免疫球蛋白IGM、C3 補(bǔ)體含量減少,與高脂模型組比較,江香薷給藥組大鼠血清IL-6、IGM、C3 含有量減少,結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 江香薷對(duì)各組大鼠血清免疫及炎癥因子的影響Note. Compared with the control group, ?P<0.05. Compared with the model group, #P<0.05.Figure 6 Effects of MCM on serum immune and inflammatory factors in each group of rats

2.9 脾肝病理組織觀察結(jié)果

各組的脾肝光學(xué)顯微鏡下基本正常,如圖7。

圖7 各組脾和肝均未發(fā)生明顯病理變化。Figure 7 No obvious pathological changes occurred in the spleen and liver in each group

2.10 江香薷對(duì)大鼠胸腺及脾系數(shù)的影響

如圖8 所示江香薷對(duì)大鼠胸腺和脾系數(shù)有影響,與對(duì)照組相比模型組和給藥組的胸腺和脾系數(shù)有所減小,但與模型組相比隨著給藥量的增加胸腺和脾系數(shù)增大,但差異不顯著(P>0.05)。

圖8 江香薷對(duì)各組大鼠的脾和胸腺指數(shù)的影響Figure 8 Effect of MCM on the spleen and thymus index of each group of rats

3 討論

中藥或藥食兩用中藥中有不少具有降血脂作用[9-10],江香薷屬于藥食兩用類中藥[11],它具有溫胃和中、健脾化濕、發(fā)汗利尿等藥理作用,臨床上常用于治療急性腸胃炎[12]、脾胃濕困等。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果高脂飲食后大鼠血脂水平升高,江香薷水提液顯著降低了膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白的水平,體重明顯低于模型組,顯示江香薷水提液可以明顯改善由于高脂飲食導(dǎo)致的癥狀。 高脂飲食導(dǎo)致大鼠胸腺和脾臟體比減少,灌胃不同劑量江香薷水提液后,大鼠胸腺和脾臟體比增加,顯示江香薷可以提高脾和胸腺的臟器系數(shù),提示江香薷有一定的增加免疫器官重量的能力。

小腸推動(dòng)實(shí)驗(yàn)?zāi)芎芎玫姆磻?yīng)大鼠的腸胃動(dòng)力功能,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明高脂飲食后大鼠的腸胃動(dòng)力功能減弱而江香薷能明顯改善模型大鼠的腸胃動(dòng)力功能,提高大鼠脾胃的運(yùn)化功能。 胃動(dòng)素(MTL)是消化道激素之一,可以刺激胃運(yùn)動(dòng),促進(jìn)胃排空,胃泌素(GAS)是一種胃腸黏膜細(xì)胞分泌的胃腸激素,有促進(jìn)食道括約肌收縮以及抑制小腸對(duì)水鹽的吸收作用,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MTL 和GAS 有的上升趨勢(shì),1,4-α-D-葡聚糖水解酶是淀粉酶的全稱,胰腺與唾液腺都分泌,該酶可以催化淀粉及糖原的水解,因而成為反應(yīng)脾胃功能的重要指標(biāo)之一,江香薷水提液灌胃后淀粉酶的活性明顯增強(qiáng),提示江香薷水提液能明顯改善模型大鼠腸胃功能。 Na+-K+-ATP 泵在機(jī)體水液代謝、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、能量轉(zhuǎn)換等生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,且江香薷揮發(fā)油灌胃給藥組大鼠的Na+-K+-ATP 酶活性增加,綜合以上結(jié)果表明江香薷能明顯改善高脂模型大鼠脾胃功能。

江香薷作為一種價(jià)格經(jīng)濟(jì)、自然來(lái)源廣泛的常用中藥,前期的工作發(fā)現(xiàn)香薷揮發(fā)油有很好的藥理藥效作用,能用于改善濕困脾胃中的胃腸道功能,但揮發(fā)油的提取目前得率為0.6%[6],利用揮發(fā)油成本較高,本研究結(jié)果顯示江香薷水提液對(duì)高脂血癥大鼠的脾胃功能同樣具有很好的改善作用,由于水提液的制備和獲取量大,對(duì)江香薷的臨床保健功能開發(fā)和中獸醫(yī)獸藥的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供了良好的技術(shù)支撐。