芹菜素對帕金森模型細胞氧化應(yīng)激水平的影響及機制的研究

張躍其,胡炳蕾,王默然,馬海強,張 君,陳學叢?

(1.濰坊市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,山東 濰坊 261000;2.濰坊市中醫(yī)院婦科,山東 濰坊 261000;3.濰坊市中醫(yī)院老年科,山東 濰坊 261000;4.濰坊市中醫(yī)院骨科,山東 濰坊 261000;5.山東第一醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,濟南 250013)

帕金森氏病(Parkinson’s disease, PD)是一種神經(jīng)退行性疾病,主要表現(xiàn)為靜息性震顫、姿勢異常、肢體僵硬和運動障礙,60 歲以上的人群中患病率約為1%[1],而未來20 年罹患人數(shù)將增加一倍,全世界PD 患者預(yù)計將超過1400 萬[2],因此,針對PD 治療措施的研究具有重要的社會及臨床意義。PD 的神經(jīng)化學特征包括活性氧生成、線粒體功能障礙、炎癥、錯折疊蛋白的積累和泛素蛋白酶體系統(tǒng)功能障礙。 目前研究發(fā)現(xiàn)自噬途徑調(diào)控異常在PD 的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[3],其參與了PD 患者中多種病理過程,最終出現(xiàn)清除受損蛋白質(zhì)和/或細胞器功能異常。

芹菜素(4’、5、7-三羥基黃酮,apigenin, AGN)是存在于水果和蔬菜(例如洋蔥,橙子)中的類黃酮的一個子類[4],而類黃酮可以保持黑質(zhì)紋狀體的完整性和功能性[5]。 AGN 在各種細胞類型中具有多種生物活性,例如抗氧化、抗炎和抗腫瘤發(fā)生[4]。研究發(fā)現(xiàn)AGN 可保護腦神經(jīng)血管抵抗淀粉樣蛋白-β25-35誘導(dǎo)的小鼠神經(jīng)毒性[6],此外AGN 可預(yù)防小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的炎癥毒性,并維持適當?shù)纳窠?jīng)膠質(zhì)神經(jīng)元相互作用[7]。 AGN 可以作為潛在的神經(jīng)保護劑來對抗與PD 相關(guān)的病理過程[4]。 自噬是細胞降解自身受損細胞器和大分子物質(zhì)的生理過程,其與PD 的發(fā)展密切相關(guān)[8],目前尚未有關(guān)于AGN 對PD 細胞模型中的神經(jīng)保護作用及自噬影響的報道。 因此,在本研究中,我們研究了AGN 對MPP+誘發(fā)的PD 模型中細胞自噬、氧化應(yīng)激的影響及神經(jīng)保護作用,為新的PD 臨床治療措施提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 細胞

人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y 細胞購自美國ATCC(ATCC-CRL-2260TM)公司。

1.2 主要試劑與儀器

芹菜素購自Sigma-Aldrich 公司(純度98%,12806KH);胎牛血清(FBS)以及DMEM 培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司;鏈霉素及青霉素購自美國Invitrogen 公司;CCK-8 試劑盒購自上海碧云天公司;凋亡檢測試劑盒購自法國Transgene 公司;Capase-3 兔單克隆抗體、Bcl-2 兔單克隆抗體及Beclin 兔單克隆抗體購自美國Abcam 公司;LC3-II兔單克隆抗體、Bax 兔單克隆抗體、ULK1 兔單克隆抗體、β 單克隆抗體-鼠單克隆抗體購自美國CST公司;二抗及ECL 發(fā)光試劑盒購自上海碧云天公司;PVDF 膜購自美國Millipore;蛋白電泳系統(tǒng)購自北京六一儀器廠;酶標儀購自美國Bio-Rad;激光共聚焦顯微鏡購自德國Leica 公司;流式細胞儀購自美國BD(FACSAria III)公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)

SH-SY5Y 細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中。 細胞培養(yǎng)箱孵育條件為37℃、5% CO2。 細胞密度90%時胰酶消化傳代,按照每孔2×103個細胞接種到96 孔板進行后續(xù)相關(guān)實驗。

1.3.2 CCK-8 篩選AGN 有效濃度

以CCK-8 法檢測細胞活力。 向每孔加入CCK-8 溶液20 μL,將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中孵育2 h,用酶標儀測定450 nm 處的吸光度,計算細胞活性。 實驗重復(fù)3 次。 本部分實驗分6 組:①對照組:DMEM 培養(yǎng)基;②MPP+組:DMSO(濃度0.5%)+2.5 mmol/L 的MPP+誘導(dǎo)細胞24 h;③A 組:加入AGN 孵育細胞2 h 后再加入MPP+,AGN 終濃度10 μmol/L,MPP+終濃度2.5 mmol/L;④B 組:AGN 終濃度20 μmol/L,MPP+終濃度2.5 mmol/L;⑤C 組:AGN 終濃度40 μmol/L,MPP+終濃度2.5 mmol/L;⑥D(zhuǎn) 組:AGN 終濃度100 μmol/L,MPP+終濃度2.5 mmol/L。

1.3.3 細胞凋亡率檢測

確定AGN 有效濃度后,將細胞分為3 組:對照組、MPP+組及芹菜素有效劑量組。 采用AnnexinV與PI 共染法檢測細胞凋亡。 將細胞培養(yǎng)于96 孔板,每孔加入Annexin V-FITC 結(jié)合液,輕輕重懸細胞,加入5 μL Annexin V-FITC,輕輕混勻,加入10 μL 碘化丙啶染色液輕輕混勻,室溫(25℃)避光孵育20 min,隨后置于冰浴中,用流式細胞儀FITC 和PI 通道檢測細胞凋亡。 實驗重復(fù)3 次。

1.3.4 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測

收集細胞經(jīng)勻漿后,經(jīng)RIPA 法裂解提取蛋白。超聲裂解儀裂解10 次后低溫離心機中離心30 min,取上清并用BCA 法定量蛋白濃度,蛋白經(jīng)SDSPAGE 電泳后電轉(zhuǎn)至PVDF 膜,脫脂牛奶搖床上封閉1 h,加入一抗后置4℃恒溫搖床過夜。 洗膜3 次后室溫孵育二抗1 h,利用化學發(fā)光試劑盒顯影蛋白條帶,采用Image-J 軟件分析定量蛋白條帶,β-actin為內(nèi)參。 實驗重復(fù)3 次。

1.3.5 氧化應(yīng)激檢測

分別收集3 組細胞到離心管內(nèi),離心后超聲波破碎細胞,4℃離心10 min 后取上清,采用丙二醇(malonaldehyde, MDA)檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)檢測試劑盒和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GPX)檢測試劑盒用來檢測各組中氧化應(yīng)激相關(guān)底物的改變,分光光度計檢測吸光度,具體方法參照試劑盒說明書。 每組實驗均重復(fù)3 次。

1.3.6 GFP-LC3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

將SH-SY5Y 細胞按照每孔2×105個接種6 孔板,每孔轉(zhuǎn)染2 μg GFP-LC3 質(zhì)粒,孵育6 h 更換新培養(yǎng)基,加入相應(yīng)的藥物處理24 h 后進行GFP-LC3斑點計數(shù)分析。 在胞漿及胞核中GFP-LC3 散在分布的細胞為自噬陰性細胞,出現(xiàn)GFP-LC3 斑點聚集的為自噬陽性細胞,各組計數(shù)至少100 個自噬陽性細胞中的GFP-LC3 斑點。 于激光共聚焦顯微鏡下掃描轉(zhuǎn)染細胞。 實驗重復(fù)3 次。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21 軟件進行統(tǒng)計分析。 計量資料用平均數(shù)±標準差(±s)表示,多樣本均數(shù)的比較采用ANOVA 分析檢驗,事后各組間的兩兩比較采用Tukey 法,P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 AGN 對MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細胞的保護作用

本實驗首先通過CCK-8 法對AGN 的有效保護濃度進行篩選。如圖1所示, 20 μmol/L、40 μmol/L、100 μmol/L 三種濃度的AGN 能顯著降低MPP+誘導(dǎo)的細胞毒性損傷,細胞活性明顯改善(相較MPP+組,P值分別<0.05、<0.01、<0.01)。AGN 濃度在40 μmol/L 時保護作用最強,選擇40 μmol/L 作為最佳藥物保護濃度進行后期實驗研究。

圖1 不同劑量AGN 對MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞活性的影響Note. Compared with the MPP+ group, ?P <0.05, ??P <0.01.Figure 1 Effects of different doses of AGN on the viability of SH-SY5Y cells induced by MPP+

2.2 AGN 對MPP+誘導(dǎo)模型細胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白的影響

后續(xù)實驗分為3 組:對照組、MPP+組、AGN+MPP+組(AGN 40 μmol/L)。 如圖2A、2B 所示,MPP+組細胞凋亡率為11.03%,較對照組升高(P<0.01);AGN+MPP+組細胞凋亡率為6.12%,較MPP+組下降(P<0.05)。 隨后我們比較了各組Caspase3 及Bcl-2、Bax 蛋白的表達。 如圖2C、2D 所示,相較于對照組,MPP+組細胞Caspase3 表達明顯升高,Bcl-2/Bax 值明顯降低(P<0.01);而AGN+MPP+組相較MPP+組,Caspase3 表達降低,Bcl-2/Bax 值明顯升高(P<0.01)。 以上結(jié)果表明AGN 可改善MPP+誘導(dǎo)的細胞凋亡。

圖2 AGN 對細胞模型凋亡及凋亡相關(guān)蛋白的影響Note. A, Apoptotic rate of each group was detected by flow cytometry. B, Comparison of cell apoptosis rate in each group,Compared with control group,??P<0.01. Compared with MPP+ group, #P<0.05. C, Western blot was used to detect the expression of Caspase3, Bcl-2 and Bax protein in each group. D, Comparison of the relative level of Caspase3 and Bcl-2/Bax value in each group. Compared with Control group,??P<0.01. Compared with MPP+ group, ##P<0.01.Figure 2 Effect of AGN on cell apoptosis and apoptosis-related proteins

2.3 AGN 對MPP+誘導(dǎo)模型細胞氧化應(yīng)激的影響

進一步檢測各組中氧化應(yīng)激相關(guān)底物表達及酶活性。 和對照組相比,MPP+促進了MDA 表達(P<0.01),而與MPP+組比較AGN 可抑制MDA 的表達(P<0.05)。 和對照組相比,MPP+組細胞GPX和SOD 活性降低,而與MPP+組比較AGN 能恢復(fù)GPX 和SOD 的活性(P<0.05)。 見圖3。

圖3 AGN 對模型細胞氧化應(yīng)激的影響Note. Compared with Control group, ?P<0.05, ??P<0.01. Compared with MPP+ group, #P<0.01.Figure 3 Effect of AGN on oxidative stress of model cells

2.4 AGN 對MPP+誘導(dǎo)模型細胞GFP-LC3 斑點形成及自噬蛋白的影響

為進一步明確AGN 對MPP+誘導(dǎo)模型細胞自噬的影響,我們進行了GFP-LC3 斑點形成實驗。GFP-LC3 斑點作為胞漿內(nèi)的自噬標志物,可以反映出自噬體對LC3 蛋白的募集情況。 將GFP-LC3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SH-SY5Y 細胞,結(jié)果顯示MPP+組細胞內(nèi)GFP-LC3 斑點較對照組顯著增多(P<0.01),而AGN+ MPP+組細胞內(nèi)GFP-LC3 斑點較MPP+組顯著減少(P<0.05)。 見圖4A、4B。 隨后我們觀察了LC3、Beclin-1 及ULK-1 蛋白的表達水平。 MPP+處理后,LC3-II/LC3-I 比值及Beclin-1、ULK1 表達較對照組顯著增加(P值均<0.01);而對比MPP+組,AGN+MPP+組LC3-II/LC3-I 比值及Beclin-1、ULK1表達顯著降低(P值均<0.05),見圖4C、4D。 以上結(jié)果進一步證明了AGN 可顯著降低MPP+誘導(dǎo)模型細胞的自噬體形成及自噬水平。

圖4 AGN 對GFP-LC3 斑形成及自噬蛋白的影響Note. A, GFP-LC3 spots in each group observed by the confocal laser microscope. B, Comparison of GFP-LC3 spots in each group.Compared with control group, ??P<0.01. Compared with MPP+ group, #P<0.05. C, Western blot was used to detect the expression of LC3, Beclin-1 and ULK1 proteins in each group. D, Comparison of the LC3-II/LC3-I ratio and the expression of Beclin-1, ULK1 in each group. Compared with Control group, ??P<0.01. Compared with MPP+ group, #P<0.05.Figure 4 Effect of AGN on GFP-LC3 plaque formation and autophagy protein

3 討論

PD 病理特征是黑質(zhì)中的多巴胺能神經(jīng)元逐漸喪失,隨后紋狀體中多巴胺水平下降,當神經(jīng)元減少50%~70%時會表現(xiàn)出臨床癥狀[9]。 目前研究證實氧化應(yīng)激是PD 致病機制的重要因素,導(dǎo)致線粒體穩(wěn)態(tài)失調(diào),進而出現(xiàn)細胞凋亡、神經(jīng)元減少[10]。在本研究我們發(fā)現(xiàn)AGN 能減輕MPP+誘導(dǎo)的SHSY5Y 細胞凋亡,增強抗氧化能力,并能降低細胞自噬水平,提示AGN 對帕金森模型細胞的保護作用與降低細胞自噬水平相關(guān)。

氧化應(yīng)激在PD 中的神經(jīng)變性改變起著關(guān)鍵作用,可促炎性細胞因子、活性氧(ROS)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)以及超氧化物的釋放而加速神經(jīng)退行性過程,加劇了多巴胺能神經(jīng)元的損傷[10-11]。PD 患者紋狀體和黑質(zhì)致密部的尸檢表明,氧化應(yīng)激會損害脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA 功能,同時降低SOD、過氧化氫酶和GPX 的含量[12-14]。 SOD 和GPX 是清除活性氧自由基的主要酶,其水平降低會使細胞更容易受到氧化損傷[13]。 PD 患者GPX、SOD 顯著耗竭,蛋白質(zhì)及DNA 氧化水平顯著增加[15]。 人體解剖數(shù)據(jù)表明,氧化應(yīng)激的啟動最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[14]。 另一項臨床研究表明,PD 患者黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的核因子kB(NF-κB)的核易位倍數(shù)增加,并且NF-κB 由氧化應(yīng)激觸發(fā),放大了炎癥和凋亡程序的過程[16]。 因此,具有神經(jīng)保護、抗氧化效能的藥物具有減緩神經(jīng)變性進程的潛力,有助于促進神經(jīng)元細胞存活,從而減輕疾病表現(xiàn)。 在各種PD 實驗?zāi)Ｐ椭?用抗炎藥抑制神經(jīng)炎癥可減輕多巴胺能神經(jīng)退行性變[17]。

在本研究中,AGN 作用下SOD、GPX、MDA 水平的改變證實了AGN 對PD 模型細胞具有很好抗氧化應(yīng)激作用。 AGN 是多種植物中存在的多酚類物質(zhì),已知其具有多種生理益處,尤其是在清除自由基、改善認知障礙、改善學習和記憶方面[18]。 有研究對AGN 在轉(zhuǎn)基因帕金森果蠅模型中的治療效能進行了檢測,發(fā)現(xiàn)其可改善果蠅的運動能力[19]。 對小膠質(zhì)細胞的研究證明,AGN 對炎性介質(zhì)具有抑制作用,表明其在神經(jīng)退行性疾病中可能具有神經(jīng)保護作用[18]。 另一項研究表明AGN 能促進成年小鼠的神經(jīng)發(fā)生,提示其具備神經(jīng)保護和神經(jīng)營養(yǎng)能力[20]。

自噬是一種降解和回收細胞組分的溶酶體依賴性的內(nèi)源性過程,目前已經(jīng)證實其與PD 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]。 在本研究中,AGN 在帕金森模型細胞中可抑制LC3-II/LC3-I 比值及Beclin-1、ULK-1,并抑制LC3 斑點形成,減輕自噬水平。 MPP+是線粒體呼吸鏈復(fù)合體的抑制劑,MPP+可模擬PD 病理過程,其誘導(dǎo)的氧化損傷類似于PD 患者大腦中發(fā)現(xiàn)的氧化損傷,損害細胞線粒體功能,而這會觸發(fā)細胞自噬水平[21]。 此外,在PD 患者中線粒體膜上a-Syn 過度積累可導(dǎo)致心磷脂暴露于線粒體外膜,從而募集LC3 連接蛋白,誘導(dǎo)線粒體自噬[22]。Zhu 等[23]在2012 年的一項研究發(fā)現(xiàn),加入ERK 信號通路特異性抑制劑可抑制MPP+導(dǎo)致的自噬水平升高。 以UO126 抑制MPP+所致的自噬水平升高,會出現(xiàn)線粒體膜電位水平升高,線粒體活性氧水平降低[24]。 半胱氨酰白三烯受體拮抗劑可同步抑制花生四烯酸相關(guān)的炎性應(yīng)激及自噬水平,從而保護神經(jīng)元,發(fā)揮對全腦缺血的治療作用[25]。 與上述研究類似,本研究中MPP+可增強自噬及氧化應(yīng)激水平,而AGN 可抑制自噬及氧化應(yīng)激水平。 UNC51樣激酶(ULK1)是啟動自噬級聯(lián)反應(yīng)的絲氨酸/蘇氨酸激酶。 研究發(fā)現(xiàn),miR-132-5p 可靶向抑制ULK1,改善細胞活力并減少MPTP 誘導(dǎo)的SHSY5Y 細胞凋亡[26],百可利能抑制ULK1 蛋白過度活化,減輕自噬水平,使帕金森模型小鼠紋狀體中酪氨酸羥化酶表達上調(diào),改善小鼠的運動障礙[27]。另一項研究表明,在MPP+處理的MN9D 細胞中ULK1 表達增加,而敲低ULK1 則增加了神經(jīng)元細胞的活力[28]。 本研究中AGN 抑制了MPP+誘導(dǎo)的ULK1 表達增高,結(jié)合前述研究結(jié)果分析,AGN 可能是通過調(diào)控自噬通路影響了線粒體的氧化應(yīng)激,進而發(fā)揮細胞保護作用。

綜上,我們的結(jié)果表明,AGN 能緩解MPP+誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激,減輕細胞凋亡,降低細胞自噬水平。本研究揭示了AGN 可能通過影響自噬來降低氧化應(yīng)激水平,從而減弱了MPP+介導(dǎo)的毒性,發(fā)生細胞保護作用。 但由于氧化應(yīng)激的復(fù)雜性及自噬調(diào)控的多樣性,AGN 調(diào)控自噬及氧化應(yīng)激的具體分子機制仍需我們進一步研究,為PD 的轉(zhuǎn)化治療應(yīng)用提供更多理論依據(jù)。