在與變應(yīng)性鼻炎比較中探索局部變應(yīng)性鼻炎模型的建立

曹文燦,蔣明君,馮勝嵐,敬 然,李林霜,李玖林,劉 洋,李昕蓉?

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻喉科,成都 610072;2.成都中醫(yī)藥大學(xué),成都 610072)

局部變應(yīng)性鼻炎(local allergic rhinitis,LAR)是具有典型變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis,AR)癥狀,血清特異性IgE(allergen specific IgE,sIgE)及變應(yīng)原皮膚點刺實驗(skin prick test,SPT)陰性,而變應(yīng)原鼻腔激發(fā)試驗陽性、鼻腔局部sIgE 陽性的I 型變態(tài)反應(yīng)性疾病[1]。 有研究顯示47%~62.5%的SPT 和外周血sIgE 陰性患者可能為LAR,過去的部分非變應(yīng)性鼻炎(non-allergic rhinitis,NAR)或特發(fā)性鼻炎可能實際上是LAR[2]。 雖然LAR 確切發(fā)病率有待進(jìn)一步研究,但近年臨床流行病學(xué)調(diào)查則提示我國華南地區(qū)鼻炎患者中14.3%為LAR[3],Rondon 等[4]則發(fā)現(xiàn)西班牙鼻炎患者中LAR 約占25.7%,LAR 的流行率總體呈高發(fā)趨勢,隨著環(huán)境惡化及空氣污染的加劇可能進(jìn)一步升。 LAR 逐漸成為一個常見但未被充分認(rèn)識的疾病,其發(fā)病機制及病理學(xué)研究還有待進(jìn)一步深入[5],LAR 動物模型則是最有效的研究手段之一。

相對LAR,AR 的動物模型及發(fā)病機制研究較為深入。 1988 年首次應(yīng)用甲苯二異氰酸酯(2,4-tolylenediisocyanate,TDI)成功制成的豚鼠AR 模型問世后[6],AR 動物模型研究便未停下腳步。 由于AR 動物模型研究的成熟性及LAR 與AR 的相似性,LAR 動物模型的建立在一定程度上借鑒了AR造模經(jīng)驗,這使得LAR 與AR 動物造模既有關(guān)聯(lián)又有區(qū)別。 本文在與AR 動物模型的對照中,就LAR動物模型的研究進(jìn)展做如下綜述。

1 動物模型建立方法

1.1 動物選擇

選用無特定病原體動物(specific pathogen flee animal,SPF)以消除其他無相關(guān)因素對實驗的影響是動物選擇的前提[7]。

既往AR 造模多用豚鼠。 使用豚鼠造模的優(yōu)勢在于其血清補體豐富,易致敏而產(chǎn)生IgE、IgG 等高效價抗體而誘發(fā)速發(fā)相反應(yīng)和遲發(fā)相反應(yīng)[8],豚鼠對抗過敏藥物敏感,因此經(jīng)常被用于過敏性疾病的發(fā)生機制以及藥物治療效果方面的研究。 但豚鼠飼養(yǎng)成本高,環(huán)境控制要求較為嚴(yán)格,且致敏的豚鼠極易激活補體系統(tǒng)釋放過敏毒素C3a 和C5a 等導(dǎo)致因毛細(xì)血管通透性增加、支氣管平滑肌痙攣致死而影響建模成功率,增加實驗成本[9]。

小鼠也是AR 常用且理想的造模選擇。 相對于豚鼠,小鼠價格低廉、飼養(yǎng)簡單、對變應(yīng)原反應(yīng)較為迅速,且基因圖譜已被科學(xué)家研究繪制完成、分子免疫學(xué)也已被深入的研究。 不同小鼠品系具有不同氣道反應(yīng)性、T 淋巴細(xì)胞免疫等方面特點,可根據(jù)不同的變應(yīng)原選擇小鼠品系,如:C57BL/6 小鼠對塵螨和豚草抗原的反應(yīng)性較強,而BALB/c 小鼠較易產(chǎn)生針對卵白蛋白(OVA)和花粉的高滴度IgE 等[10]。

大鼠是現(xiàn)今常用的AR 造模動物。 大鼠兼有小鼠和豚鼠的優(yōu)點,繁殖力強,產(chǎn)仔多,生長發(fā)育快,對吸入性刺激物易敏,易產(chǎn)生IgE 并表現(xiàn)出明顯的遲發(fā)相反應(yīng),且遺傳性狀穩(wěn)定。 但大鼠的體重有較大的差別,應(yīng)按體重分組使用,避免應(yīng)大鼠體重造成的實驗誤差。

基于AR 建模經(jīng)驗,目前LAR 動物模型更多地選用了小鼠。 陳柏文等[11]選用BALB/c 小鼠經(jīng)1%OVA 滴鼻10 d 后成功建立LAR 動物模型,出現(xiàn)明顯噴嚏及鼻中隔嗜酸性粒細(xì)胞浸潤,鼻腔灌洗液IL-5、IL-13 增高但不伴有血清sIgE 增高。 Kato 等[12]使用野生型BALB/c 小鼠并以豚草花粉(1 mg/20 μL 磷酸緩沖液)分3 個階段(第0~5,7~12,14~17天)間斷性滴鼻建立LAR 動物模型,即便變應(yīng)原刺激停止1 周,小鼠仍表現(xiàn)出噴嚏等過敏癥狀而不伴有血清sIgE 的增高,成功建立LAR 小鼠模型。

對LAR 的探索動物模型的探索已不止于僅建立有鼻部AR 癥狀且血清sIgE 陰性的動物,而是深入到LAR 免疫過程的動態(tài)觀察、揭示該過程中炎性細(xì)胞的網(wǎng)狀關(guān)聯(lián)作用以尋求LAR 免疫反應(yīng)的核心環(huán)節(jié)。 為研究LAR 免疫反應(yīng)過程中IgE 與B 細(xì)胞、肥大細(xì)胞等炎性細(xì)胞的交互作用,Kato 等[12]采用基因敲除小鼠,對缺乏IgE 高親和受體(Fcer1a-/-)及B 細(xì)胞缺乏(lghm-/-,μMT)的BALB/c 小鼠行豚草花粉致并與野生型小鼠相對照。 結(jié)果提示Fcer1a-/-及l(fā)ghm-/-( μMT) 小鼠噴嚏明顯減弱,但不論Fcer1a-/-還是野生型小鼠在致敏早期(致敏第7 天)或是致敏晚期(致敏3 周)頸部淋巴結(jié)(cervical lymph node,cLN)細(xì)胞產(chǎn)生的Th2 細(xì)胞因子及嗜酸性粒細(xì)胞浸潤均出現(xiàn)類似變化,說明IgE 對于炎性細(xì)胞的招募及激活并非必需。

為進(jìn)一步證實固有免疫反應(yīng)抑或是獲得性免疫反應(yīng)是LAR 更為重要的病理過程,Kato 等[12]進(jìn)一步使用了B 細(xì)胞和T 細(xì)胞缺如的Rag2-/-BALB/c小鼠,結(jié)果提示Rag2-/-較Rag2+/+小鼠噴嚏頻率隨時間推移明顯減少,且CD45+CD3-B220-細(xì)胞中CCD3+Singlec-F+中的比例也明顯減少,說明T 細(xì)胞對于肥大細(xì)胞及嗜堿性粒細(xì)胞功能的維持具有重要作用,且獲得性免疫可能是LAR 核心病理環(huán)節(jié)也可能是將來LAR 的治療調(diào)節(jié)靶點。

總體說來,LAR 作為一個待深入的研究目標(biāo),所選動物種類較為局限,還有待更為豐富的造模物種類型。

1.2 變應(yīng)原選擇及致敏方法

LAR 已成功造模的變應(yīng)原主要有豚草花粉、卵清蛋白(ovalbumin,OVA)。 豚草花粉對人體有較強的致敏作用,是主要的吸入過敏源之一;OVA 是一種具有載體活性的抗原蛋白質(zhì),具有很強的免疫原性,OVA 致敏后產(chǎn)生的抗體具有持久性。 兩者均廣泛的應(yīng)用于建立LAR、AR 動物模型。

在致敏方法上,LAR 與AR 出現(xiàn)了較大的不同:

AR 致敏常分為基礎(chǔ)致敏、加強致敏和局部激發(fā)3 個階段,各階段采用的致敏方式稍有不同。 AR基礎(chǔ)致敏可用腹腔注射、皮下注射、灌胃和滴鼻。腹腔注射與皮下注射能快速建模,其中腹腔致敏最為常用。 但隨研究深入,發(fā)現(xiàn)腹腔注射致敏的建模方式與自然病程存在差異。 與之相比,滴鼻雖需花費更長時間,但更接近自然發(fā)病進(jìn)程,因此滴鼻致敏越來越受研究者的青睞。 AR 加強致敏常用方法有滴鼻、霧化吸入、皮下注射。 因霧化吸入容易導(dǎo)致OVA 吸入下呼吸道引發(fā)哮喘,因而加強致敏普遍使用變應(yīng)原滴鼻。 目前國內(nèi)外AR 動物模型流程沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),但基本共識是低濃度腹腔注射基礎(chǔ)致敏,后高濃度滴鼻激發(fā),一般需要2~6 周[13]。

與AR 造模相比,LAR 致敏時間更短,致敏部位也更為局限,不采用全身致敏,常直接以變應(yīng)原滴鼻實現(xiàn)鼻敏化。 Kato 等[12]以1 mg 豚草花粉混懸于20 μL 磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)制成致敏液,采用“三階式”致敏法:第一周和第二周連續(xù)6 d、第三周連續(xù)4 d,即第0~5 天、第7~12 天和第14~17 天滴鼻,同時以PBS 單獨滴鼻作為對照;或者豚草花粉(1 mg 加入20 μL PBS)致敏液持續(xù)滴鼻于第3、5、7天間斷滴鼻或無間隙連續(xù)滴鼻10 d,但具體的滴鼻劑量及滴鼻細(xì)節(jié)未行進(jìn)一步介紹。 陳柏文等[11]以PBS 配置1% OVA(V 級,Sigma 公司,美國),0.22 μm 尼龍網(wǎng)過濾后分裝于1.5 mL 離心管-20℃保存,隨后分別采用兩種方式制作LAR 小鼠模型:一是“二段分割式”,首周以1% OVA 溶液連續(xù)滴鼻5 d,間隔2 d 后次周連續(xù)滴鼻4 d 結(jié)束造模,即第0~5天、第8~11 天;另一種方法是“五天三步式”,即第1、2 周每周5 d,歇1 周,第4 周5 d。 為精細(xì)化每次滴鼻劑量,該課題組以碳素墨水滴鼻發(fā)現(xiàn)當(dāng)每側(cè)鼻孔滴鼻劑量大于5 μL(7.5 μL,10 μL)時,解剖小鼠發(fā)現(xiàn)氣管和食道中出現(xiàn)肉眼可見的墨水痕跡,因此5 μL 為每側(cè)滴鼻推薦劑量。

此外,為避免因滴鼻藥液倒流致嗆咳使藥液進(jìn)入肺部和食道而增加肺部炎癥及增強細(xì)胞因子的表達(dá),滴鼻時可稍反折小鼠頸部,緩慢滴鼻,5 μL 分3~4 次,至小鼠完全吸收再滴入下一滴,滴完一側(cè)再操作另一側(cè),避免引起嗆咳,影響實驗準(zhǔn)確性[7]。

2 AR、LAR 造模的實驗評價方法

LAR 動物造模參照AR 模型評價方式,包括表觀指標(biāo),病理指標(biāo)和生化指標(biāo),其中生化指標(biāo)包括血清學(xué)測定和細(xì)胞因子檢查,血清學(xué)測定是確定建模成功關(guān)鍵而有效的方式。

2.1 表觀指標(biāo)-行為學(xué)評價

動物行為學(xué)評分僅作為建模成果與否的初評參考。 該法較為簡單,但易受主觀因素影響,故不建議單獨使用判斷是否建模,可作為第一步判斷建模是否成功的方法與其他方法一起聯(lián)合使用。

AR 建模成功與否的行為學(xué)評分可參照2018 年中華中醫(yī)藥學(xué)會中藥實驗藥理專業(yè)委員會擬定標(biāo)準(zhǔn)[14]:從每次致敏開始根據(jù)出現(xiàn)鼻癢、噴嚏、鼻清涕及鼻塞等鼻變態(tài)反應(yīng)癥狀等進(jìn)行積分累加,共30 min。 主要表觀指標(biāo)的分類見表1。

在2018 年中華中醫(yī)藥學(xué)會中藥實驗藥理專業(yè)委員會擬定標(biāo)準(zhǔn)之前行為學(xué)評分已被列為一項觀察指標(biāo),觀察方法同表1 總積分大于5 分便可認(rèn)為造模成功[15],被認(rèn)為客觀性較低。 現(xiàn)改進(jìn)后多采用如下方法[14]:試驗結(jié)束后,行為學(xué)評價各癥狀表觀指標(biāo)權(quán)重系數(shù)為0.4 與炎性細(xì)胞因子測定,組織病理學(xué)觀察和細(xì)胞因子檢查總積分乘以相應(yīng)指標(biāo)的權(quán)重,將指標(biāo)積分相加,即變應(yīng)性鼻炎動物模型制備成功時的總積分。 所得總積分大于0.7,便可認(rèn)為造模成功。

表1 變應(yīng)性鼻炎主觀指標(biāo)評分Table 1 Subjective index score of allergic rhinitis

LAR 行為學(xué)評價仍參照AR 的標(biāo)準(zhǔn)。 但陳柏文等[11]發(fā)現(xiàn)OVA 末次激發(fā)后經(jīng)10 min 觀察,單純鼻腔致敏組與腹腔注射致敏組小鼠的噴嚏數(shù)無統(tǒng)計學(xué)差異。 Kato 等[12]采用豚草花粉第0~5 天、第7~12 天和第14~17 天“三階式”滴鼻法則發(fā)現(xiàn)小鼠從第5 天噴嚏次數(shù)逐漸增多,到第10 天達(dá)到高峰后即維持平穩(wěn)勢態(tài),盡管后續(xù)滴鼻到第17 天,噴嚏仍處于平臺期不再繼續(xù)增加,且到第17 天與腹腔系統(tǒng)致敏組相比噴嚏頻率無統(tǒng)計學(xué)差異。

2.2 生化指標(biāo)

生化指標(biāo)包括免疫球蛋白和細(xì)胞因子檢查,可動態(tài)反應(yīng)造模時機體變化過程。 造模將變應(yīng)性鼻炎動物模型各類指標(biāo)進(jìn)行分類,并確定各類權(quán)重系數(shù),生化指標(biāo)權(quán)重系數(shù)為0.3[14]。

2.2.1 免疫球蛋白測定

變應(yīng)原可引起局部、血清免疫球蛋白E(immunoglobulin E,IgE)升高,特別是特異性IgE(specific immunoglobulin E,sIgE)能夠明確變應(yīng)原種類,因此檢測IgE、sIgE 的濃度可作為判斷AR、LAR建模是否成功的標(biāo)準(zhǔn)。

AR 和LAR 免疫球蛋白測定最大的區(qū)別在于:AR 患者可在血清中發(fā)現(xiàn)slgE,但LAR 僅能在鼻腔局部檢測出。 抽取致敏動物的靜脈血、收集鼻腔灌洗液, 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assays,ELISA)測定BALB/c 小鼠血清和鼻腔灌洗液中的slgE,發(fā)現(xiàn)LAR 血清slgE 表達(dá)偏低,與未致敏小鼠無統(tǒng)計學(xué)差異,而AR 小鼠的血清slgE 明顯高于LAR(均P>0.05)[11]。

為使證據(jù)更加有說服力,Kato 等[12]測定了生殖系轉(zhuǎn)錄本(GLT)和免疫球蛋白轉(zhuǎn)換后成熟轉(zhuǎn)錄本(PST)在小鼠鼻腔和cLN 細(xì)胞中的表達(dá)(鼻豚草致敏誘導(dǎo)cLN-B 細(xì)胞進(jìn)行類開關(guān)重組(CSR)并分化為產(chǎn)生IgE 的血漿細(xì)胞),證明了在小鼠出現(xiàn)鼻炎癥狀的第7 天,產(chǎn)生IgE 的B 細(xì)胞聚集,但血清抗原特異性IgE 為陰性。

現(xiàn)測定IgE 濃度一般采用ELISA 和被動皮膚過敏試驗(passive cutaneous anaphylaxis,PCA)。 酶聯(lián)免疫吸附試驗操作簡單,不需特殊實驗設(shè)備,敏感性、特異性都較高,應(yīng)用普遍。 被動皮膚過敏反應(yīng)試驗同樣是一種敏感度較高、特異性較強的方法,廣泛用于許多免疫學(xué)和變態(tài)反應(yīng)研究中。 但若選用大鼠或小鼠為模型則必須使用佐劑,否則會降低實驗的準(zhǔn)確性,而使用佐劑則使實驗成本大增加,同時增加了實驗的復(fù)雜性。 研究員尚在探索PCA的改良方法。

2.2.2 細(xì)胞因子檢查

II 型固有淋巴細(xì)胞產(chǎn)生Th2 細(xì)胞因子IL-5、IL-13[16]。 在小鼠模型中,LAR 小鼠表現(xiàn)為IL-5、IL-13優(yōu)勢性的表達(dá),不僅比未致敏小鼠高,且明顯高于AR 小鼠,其結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)[11],驗證了LAR 是Th2 反應(yīng)占優(yōu)勢的鼻黏膜變態(tài)反應(yīng)性疾病,也提示:LAR 擁有和AR 相似的Th2 及相似的炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子,但LAR 似乎擁有更強的免疫調(diào)節(jié)。 是否可推測,在LAR 個體中,黏膜水平產(chǎn)生的IgE 足以使鼻效應(yīng)細(xì)胞敏感,但血清的IgE 還未達(dá)到檢測水平。

在建模中還發(fā)現(xiàn)局部Th2 細(xì)胞的出現(xiàn)是第一個可檢測的信號,Th2 是一種具有調(diào)節(jié)作用T 細(xì)胞亞群,在疾病的發(fā)病機制中起著中心作用,Rag2 基因敲定小鼠,缺乏Rag2,無法發(fā)育出成熟的T 細(xì)胞,此時盡管給予過敏原刺激,但小鼠噴嚏減少,而肥大細(xì)胞或(和)嗜堿性粒細(xì)胞的活化是誘發(fā)打噴嚏的必要條件,證明T 細(xì)胞可能對維持肥大細(xì)胞或(和)嗜堿性細(xì)胞功能很重要,因此Kato 等[12]認(rèn)為T 細(xì)胞可以作為一個靶向治療LAR 方向。 Th2 參與LAR 免疫反應(yīng),那么Th2 所分泌的2 型細(xì)胞因子IL-5、IL-9、IL-13 是否可作為精準(zhǔn)治療LAR 的靶點呢?有待下一次建模繼續(xù)進(jìn)一步論證。

2.3 病理指標(biāo)-組織病理學(xué)觀察

小鼠受變應(yīng)原刺激后,鼻黏膜組織病理學(xué)檢查可以明確地反映炎癥浸潤程度、直觀說明動物的具體變化情況。 提取LAR 動物模型的鼻部和肺部組織行蘇木精-伊紅染色,鏡下觀察鏡下水腫/炎性細(xì)胞浸潤和周圍血管情況,按照《變應(yīng)性鼻炎動物模型制備規(guī)范》局部鼻黏膜病理指標(biāo)分級為參考標(biāo)準(zhǔn):病理學(xué)指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)0.3,主要分類見表2[14]。

表2 變應(yīng)性鼻炎模型病理指標(biāo)的分類Table 2 Classification of pathological indexes in allergic rhinitis model

Rondón 等[17]發(fā)現(xiàn)致敏組小鼠氣管上皮細(xì)胞排列整齊,氣管形態(tài)完整,LAR(鼻部致敏第10 天)較AR(鼻部致敏25 d)形態(tài)改變較輕,但均出現(xiàn)鼻粘膜上皮紊,杯狀細(xì)胞增生,嗜酸性粒細(xì)胞浸潤等現(xiàn)象,且嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)無統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05),與細(xì)胞因子檢查一致。 該現(xiàn)象似乎證明了LAR 是鼻部發(fā)生了過敏反應(yīng),僅由于其癥狀較輕,未引起質(zhì)變,無全身過敏反應(yīng),是否隨著病程進(jìn)展,將有可能進(jìn)一步發(fā)展成AR?

3 LAR 與AR 動物模型傳變關(guān)聯(lián)性的研究

LAR 動物模型持續(xù)滴鼻是否會導(dǎo)致LAR 向伴有系統(tǒng)過敏的AR 轉(zhuǎn)變? LAR 是獨立疾病還是僅為AR 的早期階段? 曾有研究以LAR 和健康人群為對象進(jìn)行5 年期隨訪,發(fā)現(xiàn)5 年后LAR 和健康人群分別有4.5%及6.81%出現(xiàn)系統(tǒng)過敏表現(xiàn),組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義,提示LAR 與AR 是不同的疾病[18]。有人對LAR 患者和健康患者進(jìn)行10 年隨訪,觀察其演變?yōu)锳R 的比率。 5 年的隨訪結(jié)果顯示發(fā)生率與健康對照組接近(<7%),十年的隨訪結(jié)果顯示LAR 患者AR 的長期發(fā)展率(9.7%)和健康對照組AR 的長期發(fā)展率(7.8%)相似[4],毋庸置疑LAR 是有別于AR 作為一種單獨的鼻炎表性存在的,并非其病程進(jìn)展中的一環(huán)。

LAR 與AR 動物模型的關(guān)聯(lián)性研究為澄清二者關(guān)系提供了直接手段。 Kato 等[12]以豚草花粉或PBS(對照組)于第0~5 天、第7~12 天和第14~17天對小鼠行“三階”滴鼻后,于第18 天處死小鼠,發(fā)現(xiàn)豚草花粉組小鼠血清總IgE 和豚草花粉特異性IgE 和IgG1 均出現(xiàn)升高,組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。此外,豚草花粉致敏組小鼠頸部淋巴結(jié)的豚草花粉特異性Th2 細(xì)胞因子明顯升高,且鼻黏膜出現(xiàn)上皮細(xì)胞多層化和杯狀細(xì)胞化生、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤,這似乎提示LAR 可能會向經(jīng)典AR 演化。 對于這個與臨床研究較為矛盾的結(jié)論,Kato 等[12]則指出還有待大樣本、長期隨訪研究的進(jìn)一步證實。 陳柏文等[11]發(fā)現(xiàn)“二段分割式”滴鼻組OVA 滴鼻10 d 后,LAR 小鼠血清OVA-sIgE 無升高,而“五天三步式”滴鼻組OVA 滴鼻15 d 后血清OVA-sIgE 出現(xiàn)了升高,這提示持續(xù)抗原接觸可使小鼠血清OVA-sIgE升高并表現(xiàn)出典型AR 癥狀。

雖然現(xiàn)有的“LAR-AR”動物模型的關(guān)聯(lián)性研究均有一定局限性,但目前證據(jù)顯示嚴(yán)格把控抗原持續(xù)刺激時間,防止LAR 向AR 的傳變?nèi)允窃炷５年P(guān)鍵質(zhì)控環(huán)節(jié)。

綜上,AR 建模手段較為成熟,迄今為止已成功用豚鼠、大鼠、小鼠、新西蘭兔等多種動物建立實驗?zāi)Ｐ汀?LAR 動物模型多依據(jù)AR 制定,其中LAR 小鼠模型因與患者相似性好、執(zhí)行簡單易復(fù)制、合乎經(jīng)濟(jì)價值,成為了優(yōu)秀的實驗動物選擇。 目前,AR變應(yīng)原種類多、致敏方法趨近統(tǒng)一、實驗評價方法成熟,但LAR 實驗動物和使用變應(yīng)原較單一、造模方式不盡相同,故實驗流程仍需進(jìn)一步優(yōu)化。 盡管LAR 被認(rèn)為是一種獨立的疾病,但在造模中出現(xiàn)了LAR 向AR 轉(zhuǎn)變的現(xiàn)象,且臨床研究中也發(fā)現(xiàn)了部分患者存在明顯的哮喘演變,LAR 是否可能進(jìn)化為系統(tǒng)性的過敏性疾病? 這仍然是一個有爭議的課題。 因此,未來更大規(guī)模、更長時間的人類研究和動物研究是必不可少的。