病理檢測過表達白血病抑制因子對子宮內(nèi)膜癌細胞耐受化療藥物的作用分析

李丹（天津市寶坻區(qū)人民醫(yī)院 天津醫(yī)科大學寶坻臨床學院,天津 301800）

子宮內(nèi)膜癌屬于臨床上較為常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，且隨著人們生活方式的不斷改變以及生活壓力的與日俱增，該病的發(fā)病率正呈逐年攀升趨勢，已成為嚴重威脅女性生命健康的重大疾病之一[1-2]。該病多見于絕經(jīng)后女性，其中3/4的患者均在50歲以后發(fā)病，年輕患者的占比為2%-14%，近年來有年輕化趨勢[3]。由于該病發(fā)病早期具有極強的隱匿性，絕大部分患者一經(jīng)確診便已是中晚期，喪失了手術根治的最佳時期，化療是目前臨床上用以治療中晚期子宮內(nèi)膜癌患者的關鍵方法[4]。其中鉑類與紫杉醇類聯(lián)合是臨床上首選的化療方案，但其普遍存在化療不敏感以及誘導耐藥情況，晚期患者經(jīng)治療后5年總生存率在25%左右[5]。因此，如何有效解決患者化療耐受的方法顯得尤為重要，亦是目前臨床研究的熱點。有研究表明，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生和生長因子調(diào)節(jié)密切相關，多種生長因子及其相關肽類、子宮內(nèi)膜各類細胞和卵巢分泌激素之間形成了互聯(lián)網(wǎng)絡，實現(xiàn)了對子宮內(nèi)膜周期性改變起到復雜而有序的調(diào)控[6]。白血病抑制因子（LIF）屬于白細胞介素-6（IL-6）家族重要成員之一，具有較為廣泛的生物學活性，已被證實和多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關[7]。鑒于此，本文通過研究病理檢測過表達LIF對子宮內(nèi)膜癌細胞耐受化療藥物的作用，以期為該病患者的治療方案制定提供科學依據(jù)，繼而改善患者預后?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑 ①儀器：Synergy2多功能酶標儀；Mini Protean電泳、Mini Trans-Blot轉(zhuǎn)膜設備以及CFX9熒光定量PCR系統(tǒng)（BIO-RAD）；多功能成像系統(tǒng)（UVITEC）；Gallios流式細胞儀（Beckman Coulter）。②試劑：胎牛血清、100×青霉素-鏈霉素（P/S）以及DMEM/F12培養(yǎng)液均購自ThermoFisher；胰島素（Merck）；順鉑及紫杉醇（阿拉?。?；CCK-8試劑盒（同仁）；Annexin V-FITC/PI檢測試劑盒（凱基）；JC-1檢測試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒以及RIPA裂解液（碧云天）；Bcl-2、Bcl-XL、Bax抗體（Cell Signal）。

1.2 研究方法 ①細胞培養(yǎng)：對子宮內(nèi)膜癌細胞RL95-2實施規(guī)范培養(yǎng)、傳代擴增處理，最后保存在醫(yī)院中心實驗室液氮罐內(nèi)。完全培養(yǎng)基為含10%胎牛血清、5mg/L胰島素以及1%P/S的DMEM/F12培養(yǎng)液。其中細胞換液、傳代、凍存以及復蘇具體操作均遵循常規(guī)規(guī)范完成，細胞培養(yǎng)環(huán)境為5%CO2，37.5℃恒溫。②細胞模型構建：轉(zhuǎn)染前夜進行消化傳代293FT細胞處理，并將其接種在明膠包被的培養(yǎng)介質(zhì)中，放置在5%CO2，37℃條件下培養(yǎng)過夜。之后根據(jù)15∶8∶12比例充分混合pLVX-IRES-Puro、PMD2.G以及psPAX2，具體操作以說明書為準。采用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染混合物，5%CO2，37℃條件下培養(yǎng)6h。除去培養(yǎng)液，采用PBS重復沖洗3次，并加入完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染過夜之后采集培養(yǎng)液上清，經(jīng)0.2μm微孔濾膜過濾之后，直接轉(zhuǎn)染細胞、正常培養(yǎng)。定時6-10h更換1次含病毒的培養(yǎng)液，持續(xù)3d。感染結(jié)束之后，更換完全培養(yǎng)液實施1d培養(yǎng)，待細胞恢復并長至90%融合度時，傳代、凍存。針對傳代過夜細胞，予以0.1-10mg/L的含Puro篩選培養(yǎng)液。③CCK-8法檢測細胞活性：以96孔板為介質(zhì)，以5000個細胞/孔的標準將細胞接種至孔板內(nèi)，并放置在5%CO2，37℃條件下培養(yǎng)6h。培養(yǎng)完成之后，每孔內(nèi)加入1/10培養(yǎng)液體積的CCK-8溶液，孵育60min后以酶標儀測定450nm處的吸光度。繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h、72h后完成上述操作，測定各孔450nm處的吸光度，并計算相對吸光度。④Annexin V-FITC/PI法檢測細胞凋亡情況：采用Annexin V-FITC/PI檢測試劑盒完成，相關操作以試劑盒說明書為準，借助流式細胞分析儀實現(xiàn)細胞凋亡情況的檢測。⑤JC-1法檢測細胞線粒體膜電位情況：相關操作以試劑盒說明書為準，即根據(jù)實驗分組處理細胞后，采集細胞孵育JC-1染液，采用流式細胞分析儀檢測，調(diào)整并采集所有樣品前散射光、側(cè)散射光、綠光以及紅光通道信號，以前散射光/側(cè)散射光做散點圖標記主細胞群，隨后以綠光/紅光對上述主細胞群作圖分成綠光以及紅光陽性的高線粒體膜電位細胞。⑥免疫印跡法檢測Bcl-2家族蛋白表達水平：采用BCA蛋白定量試劑盒完成，相關操作以試劑盒說明書為準，以多功能成像儀自動成像觀察蛋白相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)處理工具選擇SPSS22.0軟件，計量數(shù)據(jù)以（±s）表示，開展正態(tài)性檢驗及方差齊性檢驗，符合正態(tài)分布，行t檢驗。計數(shù)資料的表示方式為[n(%)]，開展χ2檢驗。以P＜0.05為判定差異有統(tǒng)計學意義的標準。

2 結(jié)果

2.1 兩組細胞體外活性的影響 兩組細胞24h、48h、72h相對吸光度對比均不明顯（均P＞0.05）。見表1。

表1 兩組細胞體外活性的影響（±s）

表1 兩組細胞體外活性的影響（±s）

組別 例數(shù) 24h相對吸光度 48h相對吸光度 72h相對吸光度過表達組 3 2.31±0.32 4.71±0.41 9.01±0.42對照組 3 2.25±0.31 4.34±0.32 8.82±0.36 t-0.310 1.232 0.595 P-0.772 0.285 0.584

2.2 兩組化療藥物殺傷腫瘤細胞能力對比 過表達組子宮內(nèi)膜癌細胞在順鉑及紫杉醇作用下的細胞凋亡率分別低于對照組（均P＜0.05）。見表2。

表2 兩組化療藥物殺傷腫瘤細胞能力對比（±s,%）

表2 兩組化療藥物殺傷腫瘤細胞能力對比（±s,%）

組別 例數(shù) 順鉑 紫杉醇過表達組 3 27.58±2.69 31.26±2.78對照組 3 68.73±11.27 74.92±12.06 t-6.151 6.110 P-0.004 0.004

2.3 兩組化療藥物破壞腫瘤細胞線粒體膜電位的作用效果對比過表達組子宮內(nèi)膜癌細胞在順鉑及紫杉醇作用下的細胞線粒體膜電位分別高于對照組（均P＜0.05）。見表3。

表3 兩組化療藥物破壞腫瘤細胞線粒體膜電位的作用效果對比（±s,%）

表3 兩組化療藥物破壞腫瘤細胞線粒體膜電位的作用效果對比（±s,%）

組別 例數(shù) 順鉑 紫杉醇過表達組 3 42.38±6.29 31.89±4.56對照組 3 17.26±3.12 12.74±2.15 t-6.197 6.579 P-0.003 0.003

2.4 兩組Bcl-2家族蛋白表達水平對比 過表達組Bcl-2及Bcl-XL蛋白相對表達量分別高于對照組，而Bax蛋白相對表達量低于對照組（均P＜0.05）。見表4。

表4 兩組Bcl-2家族蛋白表達水平對比（±s）

表4 兩組Bcl-2家族蛋白表達水平對比（±s）

組別 例數(shù) Bcl-2 Bcl-XL Bax過表達組 3 2.71±0.31 1.74±0.12 -1.24±0.08對照組 3 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 t-15.141 25.115 26.847 P-0.000 0.000 0.000

3 討論

有研究表明，功能性LIF屬于分泌型糖蛋白之一，人類LIF基因主要定位于第22號染色體上，基因全長為6.0kb，含有3個外顯子以及2個內(nèi)含子，編碼區(qū)內(nèi)堿基存在較高的保守性[8-10]。LIF作為一種具備多種生物學功能的細胞因子，國內(nèi)對其相關研究主要集中于生殖醫(yī)學方面。LIF在生殖周期中和子宮功能以及調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜生長密切相關，且子宮內(nèi)膜腺上皮細胞是LIF表達的重要部位，LIF表達在一定程度上受月經(jīng)周期變化影響，分泌期表達最高，可能和其在一定程度上受卵巢激素調(diào)節(jié)有關[11-13]。隨著近年來相關研究的日益深入，越來越多的學者發(fā)現(xiàn)LIF存在多個可變剪切體，在功能方面存在一定的差異，而在實體瘤中，LIF主要扮演著功能性細胞因子的角色，促進了腫瘤的惡性進展以及放化療抵抗[14-15]。

本文結(jié)果還顯示了過表達組子宮內(nèi)膜癌細胞在順鉑及紫杉醇作用下的細胞凋亡率均低于對照組。這提示了過表達LIF會增加子宮內(nèi)膜癌細胞對化療藥物的耐受性，增強其對順鉑及紫杉醇的抵抗作用。究其原因，LIF可通過LIF受體增強STAT3的磷酸化水平和轉(zhuǎn)錄水平，繼而對和疾病進展以及化療抵抗相關的基因表達產(chǎn)生調(diào)控作用，進一步增強子宮內(nèi)膜癌細胞對化療藥物的耐受性。這在國外學者YU[16]等人的研究報道中得以佐證：借助逆轉(zhuǎn)錄病毒建立穩(wěn)定過表達LIF的結(jié)直腸癌細胞，可促進細胞大量分泌LIF，并對STAT3信號通路起到激活作用，促使P53蛋白表達水平下降，最終減弱化療藥物對腫瘤細胞的滅殺作用。此外，雖然順鉑及紫杉醇治療子宮內(nèi)膜癌的機制存在根本差異，但其均可對線粒體功能產(chǎn)生破壞，繼而誘導細胞凋亡的發(fā)生，然而過表達LIF可有效穩(wěn)定線粒體膜電位，抑制細胞凋亡。究其原因，可能和過表達LIF可激活STAT3信號通路，調(diào)控凋亡相關蛋白水平有關。由此可見，LIF可能介導了子宮內(nèi)膜癌的惡性進展以及化療抵抗，可能是該病的治療靶點。此外，Bcl-2及Bcl-XL均是目前臨床上應用較為廣泛的抗凋亡蛋白，而Bax屬于促凋亡蛋白。而本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達組Bcl-2及Bcl-XL蛋白相對表達量均高于對照組，而Bax蛋白相對表達量低于對照組。這充分說明了LIF影響子宮內(nèi)膜癌耐受化療藥物的可能機制之一和調(diào)控上述細胞凋亡相關蛋白表達有關。

綜上所述，過表達LIF會在一定程度上增加子宮內(nèi)膜癌細胞對化療藥物的耐受性，增強其對順鉑及紫杉醇的抵抗作用，其主要作用機制可能和上調(diào)Bcl-2及Bcl-XL表達以及下調(diào)Bax表達有關。