蒸汽爆破技術(shù)對(duì)杜仲木脂素類(lèi)成分的影響

潘夢(mèng)華 蘇亞菲 李 桑 李 濤 王志芳 白孟鑫 張瑤新李 欽丁艷霞*孫志強(qiáng)

1.河南省杜仲栽培與利用工程實(shí)驗(yàn)室，河南 開(kāi)封 475000；2.河南大學(xué) 民生學(xué)院，河南 開(kāi)封 475000；3.國(guó)家林業(yè)局泡桐研究開(kāi)發(fā)中心，鄭州450000

0 引言

杜仲為杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoidesOliv.的干燥樹(shù)皮，是中國(guó)傳統(tǒng)藥材，在我國(guó)有兩千多年的用藥歷史。《神農(nóng)本草經(jīng)》中將其列為上品，性溫，味甘，歸肝、腎經(jīng)，具有補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨，安胎的功效。用于治療肝腎不足，腰膝酸痛，筋骨無(wú)力，頭暈?zāi)垦＃焉锫┭?，胎?dòng)不安等［1］。杜仲中的化學(xué)成分主要有黃酮類(lèi)、木脂素類(lèi)、環(huán)烯醚萜類(lèi)、酚酸類(lèi)、萜類(lèi)、甾體類(lèi)和多糖類(lèi)等。具有降壓、調(diào)節(jié)血脂、降血糖、抗炎、肝保護(hù)和抗腫瘤等藥理作用，廣泛應(yīng)用于中醫(yī)臨床復(fù)方及多種中成藥中［2］。

蒸汽爆破簡(jiǎn)稱(chēng)汽爆，是一種新興的生物質(zhì)預(yù)處理技術(shù)。其原理是通過(guò)將滲進(jìn)植物組織內(nèi)部的蒸汽分子瞬時(shí)釋放完畢，使蒸汽內(nèi)能轉(zhuǎn)化為機(jī)械能并作用于生物質(zhì)組織細(xì)胞層間，從而用較少的能量將原料分解。蒸汽爆破預(yù)處理是木質(zhì)纖維原料轉(zhuǎn)化領(lǐng)域最有前景的預(yù)處理技術(shù)之一，具有能耗低、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)［3］。由于杜仲各部位均富含杜仲膠，膠絲嚴(yán)重干擾杜仲活性成分的溶出，因此，考慮利用爆破預(yù)處理技術(shù)破壞杜仲?gòu)?fù)雜的結(jié)構(gòu)，打開(kāi)活性成分溶出的通道。已經(jīng)有研究［4］表明，杜仲采用爆破預(yù)處理后，明顯提高了杜仲黃酮和綠原酸的得率。但是，對(duì)于有明顯藥效活性的木脂素類(lèi)成分的變化，目前尚未涉及。本研究主要考察蒸汽爆破預(yù)處理工藝條件對(duì)杜仲木脂素類(lèi)成分的影響。

1 材料

1.1 藥材

杜仲樹(shù)皮和杜仲葉：樣品信息及處理方法見(jiàn)表1。

表1 樣品信息表

1.2 對(duì)照品

松脂素二糖苷（批號(hào)：DST191025?013，含量≥98%）、松脂素（批號(hào)：DST190115?208，含量≥98%）、丁香脂素二糖苷（批號(hào)：DST?200413?055，含量≥98%）、丁香脂素（批號(hào)：DST200515?171，含量≥98%）、中脂素（批號(hào)：DST190326?084，含量≥98%）均購(gòu)自成都德思特生物科技有限公司，中脂素二糖苷（批號(hào)：20031903，含量≥98%）購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司。

1.3 試劑

甲醇（天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司），乙腈（天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司），均為色譜級(jí)。磷酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司），濃硫酸（中國(guó)平煤神馬集團(tuán)開(kāi)封東大化工有限公司），變色酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

1.4 儀器

LC?20AT 型高效液相色譜儀（日本島津），紫外分光光度計(jì)（島津UV?2600），M150A 型分析天平（瑞士梅特勒?托利多儀器有限公司），SB?5200DTDN超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司），

2 方法

采用紫外分光光度法測(cè)定杜仲爆破前后總木脂素的含量［5］。高效液相色譜法測(cè)定木脂素主要成分丁香脂素二糖苷、松脂素二糖苷、中脂素二糖苷、丁香脂素、松脂素、中脂素的含量。

2.1 供試品溶液的制備

精密稱(chēng)取樣品粉末0.4 g，置于50 mL 具塞錐形瓶中，加入25 mL 甲醇，加入后加蓋密塞，稱(chēng)定重量，超聲30 min，冷卻后再次稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足重量，抽濾，取濾液1 mL 于5 mL 容量瓶中用甲醇定容，搖勻，過(guò)0.22 μm 的微孔濾膜，即得。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取丁香脂素二糖苷、松脂素二糖苷、中脂素二糖苷、丁香脂素、松脂素、中脂素對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，置10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解，定容，搖勻，制成每1 mL 含丁香脂素二糖苷0.007 5 mg、松脂素二糖苷0.003 25 mg，中脂素二糖苷0.005 mg，丁香脂素0.001 75 mg、松脂素0.002 75 mg、中脂素0.004 mg的混合對(duì)照品，保存于4 ℃冰箱中，備用。

2.3 液相色譜條件

色譜柱：Hypersil GOLD C18 色譜柱（250×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相以乙腈為流動(dòng)相A，以0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相B，按表2 進(jìn)行梯度洗脫。流速為1.0 mL／min，檢測(cè)波長(zhǎng)為227 nm，進(jìn)樣量：10 μL，柱溫：30 ℃。

表2 梯度洗脫程序表

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精密吸取混合對(duì)照品溶液1、3、5、8、10、20、30、40 μL，按2.3 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄其峰面積。以進(jìn)樣量（X／μL）為橫坐標(biāo)，色譜峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程見(jiàn)表3。

表3 回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

2.4.2 精密度試驗(yàn)

精密量取混合對(duì)照樣品1 mL，按2.2.3 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5 次，丁香脂素二糖苷、松脂素二糖苷、中脂素二糖苷、丁香脂素、松脂素、中脂素的峰面積的RSD 分別為0.97%、1.00%、0.81%、1.70%、0.88%、0.91%，表明此儀器的精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱(chēng)定同一批樣品（樣品3）粉末5 份，每份約0.4 g，按2.2.1 項(xiàng)下方法制備供試樣品溶液，按2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果丁香脂素二糖苷、松脂素二糖苷、中脂素二糖苷、丁香脂素、松脂素、中脂素的峰面積的RSD 分別為1.80%、2.84%、1.50%、2.42%、2.46%、2.45%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱(chēng)取樣品（3 號(hào)）5 份，按2.2.1 項(xiàng)下方法制成供試樣品溶液，按2.2.3 項(xiàng)下色譜條件分別在0、4、8、12、16、20、24 h 進(jìn)樣10 μL，結(jié)果樣品中丁香脂素二糖苷、松脂素二糖苷、中脂素二糖苷、丁香脂素、松脂素、中脂素的RSD 值分別為0.38%、1.26%、1.35%、0.95%、1.28%、2.05%，表明供試樣品溶液在24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取已知含量的杜仲樣品（10 號(hào)）粉末6份，每份約0.4 g，置于50 mL 量瓶中，分別加入對(duì)照品適量，按2.1 項(xiàng)下方法制成供試品，測(cè)定峰面積，計(jì)算平均回收率和RSD。

3 結(jié)果

3.1 預(yù)爆破前后總木脂素含量

為探究蒸汽爆破預(yù)處理對(duì)杜仲皮木脂素類(lèi)成分的影響，按照1.1 項(xiàng)下各樣品的處理?xiàng)l件對(duì)杜仲進(jìn)行處理，按照2.1 項(xiàng)下的方法制成供試品，采用2.1項(xiàng)下方法測(cè)定杜仲總脂木素含量，重復(fù)三次，取平均值，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 樣品總木脂素含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）

3.2 預(yù)爆破前后木脂素主要成分含量測(cè)定結(jié)果

分別取樣品0.4 g。按2.1 項(xiàng)下方法制成供試樣品溶液，按2.3 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，色譜圖見(jiàn)圖1、圖2 和圖3。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品中丁香脂素二糖苷、松脂素二糖苷、中脂素二糖苷、丁香脂素、松脂素、中脂素的含量，重復(fù)三次，取平均值，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 樣品含量測(cè)定結(jié)果（單位：mg／g）（n＝3）

圖1 生品杜仲高效液相色譜圖

圖2 蒸汽爆破后杜仲高效液相色譜圖

圖3 標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖

表4 加樣回收率實(shí)驗(yàn)（n＝6）

4 討論

依據(jù)表5 結(jié)果可以看出，汽爆后總木脂素含量均明顯降低。對(duì)比汽爆后樣品4、5 的含量發(fā)現(xiàn)，汽爆前球磨和剪碎使原料比表面積增大，汽—質(zhì)接觸充分，有利于木脂素類(lèi)成分的溶出，汽爆后再球磨和剪碎，對(duì)于有效成分的溶出，各樣品間無(wú)顯著性差異。

對(duì)比1、4、5 和2、6、7、8、9 樣品中各成分含量測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，樣品在爆破前球磨，木脂素苷成分下降比未球磨的更明顯，苷元含量的上升也很明顯，但是二者之間不成完全對(duì)應(yīng)關(guān)系。說(shuō)明木脂素苷類(lèi)成分在爆破后并沒(méi)有完全定向轉(zhuǎn)化為其苷元。蒸汽爆破后杜仲（圖2）的色譜峰數(shù)量明顯多于生品杜仲，說(shuō)明杜仲經(jīng)強(qiáng)力爆破后，化合物中的化學(xué)鍵有可能發(fā)生了斷裂和重排，有新的物質(zhì)生成。

空氣-蒸汽爆破預(yù)處理破壞了樣品的纖維網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞壁，改善了提取過(guò)程中溶質(zhì)-溶劑的可及性和內(nèi)部傳質(zhì)。植物材料蒸汽爆炸的典型結(jié)果包括木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)的大量分解、半纖維素化合物的水解和木質(zhì)素化合物的解聚［6］。細(xì)胞壁在高壓蒸煮過(guò)程中，高壓空氣和蒸汽滲入物料，水解反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞壁中的多糖降解和解聚。在壓力突然釋放過(guò)程中，樣品會(huì)受到水熱效應(yīng)和撕裂力的聯(lián)合作用。因此，保留時(shí)間與植物原料的水解和汽-水介質(zhì)的擴(kuò)散有關(guān)，這對(duì)植物的預(yù)處理效率和提取率都有重要影響［7?8］。依據(jù)表6 各木脂素測(cè)定結(jié)果可以看出，木脂素苷的含量爆破后明顯降低，其相對(duì)應(yīng)的苷元含量卻有不同程度的升高。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能為木脂素苷的糖苷鍵受到撕裂和水熱效應(yīng)發(fā)生斷裂，生成對(duì)應(yīng)的苷元。

觀察樣品6、8、9 和7 的總木脂素含量發(fā)現(xiàn)壓強(qiáng)在1.6 MPa 時(shí)，總木脂素含量較高，而當(dāng)壓強(qiáng)升高變?yōu)?.8 MPa 時(shí)，總木脂素含量反而降低，說(shuō)明1.6 MPa 是杜仲木脂素爆破的最佳壓強(qiáng)。進(jìn)一步對(duì)比樣品2、6、7、8、9 中松脂素二糖苷和松脂素的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，在壓強(qiáng)為1.6 MPa 時(shí)松脂素二糖苷幾乎能定向的脫糖轉(zhuǎn)化為松脂素，如樣品6（汽爆前未球磨，爆破壓強(qiáng)1.6 MPa，爆破時(shí)間300 s）松脂素二糖苷定向轉(zhuǎn)化為松脂素，其轉(zhuǎn)化率60.75%。樣品7（汽爆前未球磨，爆破壓強(qiáng)1.6 MPa，爆破時(shí)間220 s）的轉(zhuǎn)化率為68.96%，樣品8（汽爆前未球磨，爆破壓強(qiáng)1.6 MPa，爆破時(shí)間180 s）的轉(zhuǎn)化率達(dá)到78.21%。當(dāng)壓強(qiáng)高于1.6 MPa，如樣品9（汽爆前未球磨，爆破壓強(qiáng)1.8 MPa，爆破時(shí)間300 s）的轉(zhuǎn)化率降為47.41%。說(shuō)明松脂素二糖苷的最佳轉(zhuǎn)化條件是爆破壓強(qiáng)1.6 MPa，爆破時(shí)間180 s。但是在同樣條件下，丁香脂素二糖苷和中脂素二糖苷的轉(zhuǎn)化雖然有苷的降低和苷元含量的上升，但是未發(fā)現(xiàn)準(zhǔn)確規(guī)律，說(shuō)明不同的成分糖苷鍵的斷裂所需要的能量也略有差異。

在萃取過(guò)程中，比表面積對(duì)活性物質(zhì)的傳質(zhì)過(guò)程有重要影響過(guò)程。隨著比表面積的增大，溶劑內(nèi)擴(kuò)散阻力降低，溶劑更容易到達(dá)萃取部位，提高萃取效率［7］。杜仲葉片和皮相比，對(duì)壓力造成的比表面積增加更敏感。已經(jīng)有研究［6］表明，杜仲葉片的比表面積隨壓力的增加先升后降，當(dāng)壓力達(dá)到1.0 MPa，比表面積達(dá)到最大，化合物的提取率也有相似的結(jié)果。所以，在采用和皮同樣的壓力（1.6 MPa，1.8 MPa ）時(shí)，葉片中木脂素含量反而更低。