超高效合相色譜法對(duì)克倫特羅對(duì)映體的拆分及其在豬尿中的殘留分析

張文華，侯建波，榮杰峰，汪 鵬，謝 文，徐敦明，李 可，郗存顯，韓 超

（1.杭州海關(guān)技術(shù)中心，浙江 杭州 310016；2.廈門海關(guān)，福建 廈門 361001；3.重慶海關(guān)技術(shù)中心，重慶400020；4.浙江樹人大學(xué)，生物與環(huán)境工程學(xué)院 浙江 杭州 310015）

克倫特羅，俗稱“瘦肉精”，是一種選擇性β2受體激動(dòng)劑，含有1個(gè)手性中心［1］，存在一對(duì)對(duì)映體，分別為（+）－克倫特羅和（－）－克倫特羅（圖1）。人工合成的克倫特羅以外消旋體形式為主，克倫特羅能夠改變牲畜體內(nèi)養(yǎng)分的代謝途徑，促進(jìn)動(dòng)物肌肉生長(zhǎng)，加速牲畜體內(nèi)脂肪的分解代謝，促進(jìn)骨骼肌蛋白質(zhì)的合成，提高動(dòng)物的瘦肉率［2－3］。但在動(dòng)物組織中的克倫特羅殘留已發(fā)生多次中毒事件，引起了人們的高度重視。近年來，克倫特羅在中國(guó)已被禁止作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑使用。關(guān)于克倫特羅殘留的危害及分析已有不少文獻(xiàn)報(bào)道［4－5］，由于不同結(jié)構(gòu)對(duì)映體存在不同的毒性、藥理活性和代謝差異［6－7］，然而大多數(shù)的文獻(xiàn)在分析克倫特羅危害時(shí)，通常不能精確評(píng)估克倫特羅兩個(gè)對(duì)映體的具體危害，將其視為同一物質(zhì)來對(duì)待，必然導(dǎo)致對(duì)其危害評(píng)估不準(zhǔn)確。為了進(jìn)一步研究克倫特羅對(duì)映體之間的生物活性差異，迫切需要建立一種克倫特羅對(duì)映體的高效分離分析方法。

目前，高效液相色譜法［8-9］、毛細(xì)管電泳法［10-11］、液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法［12－15］等方法被廣泛用于克倫特羅對(duì)映體的分析。但這些方法通常存在分離度不佳、分析時(shí)間過長(zhǎng)、色譜峰形較差、有機(jī)試劑用量大等問題。近年來超高效合相色譜法（UPC2）受到了廣泛關(guān)注，該技術(shù)將傳統(tǒng)超臨界流體色譜技術(shù)（SFC）與超高效液相色譜技術(shù)（UPLC）的優(yōu)勢(shì)相互補(bǔ)充［16］，利用超臨界CO2與少量有機(jī)試劑（甲醇、乙腈、乙醇、異丙醇等）為流動(dòng)相，通過精確調(diào)節(jié)兩種流動(dòng)相之間的比例、系統(tǒng)動(dòng)態(tài)背壓和柱溫獲得所需的系統(tǒng)分辨率，從而精確調(diào)控目標(biāo)化合物對(duì)映體的分離度和保留時(shí)間，在手性分離上具有顯著的優(yōu)勢(shì)而被廣泛應(yīng)用［17］。近年的研究顯示，相比傳統(tǒng)色譜技術(shù)，UPC2技術(shù)更適合于分析傳統(tǒng)液相色譜難以分離的手性對(duì)映體及類似物，并已被廣泛應(yīng)用于酚酸類化合物［18］、三唑類農(nóng)藥［19］、酚類精油［20－21］、色素［22］、甘油三酯［23］等的分離。目前，UPC2技術(shù)應(yīng)用于克倫特羅對(duì)映體的拆分及含量測(cè)定未見報(bào)道。

本研究建立了超高效合相色譜法拆分和測(cè)定克倫特羅對(duì)映體的方法。實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了克倫特羅對(duì)映體的儀器色譜分離條件和豬尿中克倫特羅對(duì)映體的凈化條件，并對(duì)所采購的克倫特羅外消旋體標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行拆分，對(duì)豬尿樣品中克倫特羅對(duì)映體的含量進(jìn)行測(cè)定。該方法具有分離效果好、分析速度快、有機(jī)溶劑用量少等特點(diǎn)，可為進(jìn)一步研究克倫特羅的藥理和開發(fā)副作用更小的新藥提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、材料與試劑

超高效合相色譜儀（美國(guó)Waters 公司）；臺(tái)式離心機(jī)（美國(guó)Thermo 公司）；AE260 電子天平（瑞士Mettler公司）；R215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司）；超純水凈化系統(tǒng)（英國(guó)Elga公司）；MS2渦旋混勻器（上海醫(yī)大儀器廠）；氮吹儀（日本東京理化公司）；S220酸度計(jì)（瑞士Mettler公司）。

聚合物固相萃取小柱（Oasis HLB 3 mL，60 mg，杭州金譜科學(xué)儀器有限公司）；混合型強(qiáng)陽離子交換固相萃取柱（Oasis MCX 3 mL，60 mg）、混合型弱陽離子交換固相萃取柱（Oasis WCX 3 mL，60 mg）（美國(guó)Waters 公司）；混合型陽離子交換固相萃取柱（Agela PCX 3 mL，60 mg，天津博納艾杰爾公司）；柱子使用前依次采用3 mL甲醇、3 mL水和3 mL 10 mmol/L鹽酸對(duì)其進(jìn)行活化。

手性分離色譜柱：多糖衍生物耐溶劑型手性色譜柱CHIRALPAK IA－3（4.6 mm×100 mm，3μm），（大賽璐藥物手性技術(shù)（上海）有限公司）。

克倫特羅外消旋體（CAS 號(hào)：129138－58－5，純度≥98.0%，BePure 公司）。兩種克倫特羅對(duì)映體：（+）－克倫特羅、（－）－克倫特羅（純度均大于98.0%，上海勤路生物技術(shù)有限公司）。乙腈、甲醇、甲酸、乙醇、異丙醇、正庚烷（色譜純，西班牙Scharlau 公司）；醋酸銨（分析純，廣東光華科技股份有限公司）、氨水（分析純，杭州高晶精細(xì)化工有限公司），氫氧化鈉（分析純，西隴科學(xué)股份有限公司）；水為超純水；其他實(shí)驗(yàn)所用試劑除特殊說明外均為分析純。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液及工作液的配制

1.2.1 外消旋體標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液準(zhǔn)確稱取0.01 g（精確至0.1 mg）克倫特羅外消旋體標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容至10 mL，配成1.0 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.2.2 對(duì)映體標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別準(zhǔn)確稱取0.01 g（精確至0.1 mg）（+）－克倫特羅和（－）－克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容至10 mL，配成1.0 g/L的克倫特羅對(duì)映體標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

克倫特羅對(duì)映體的混合工作溶液：準(zhǔn)確吸取一定量的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用正庚烷逐級(jí)稀釋成50、100、200、1 000、5 000、10 000μg/L的混合工作溶液。

1.3 樣品前處理

1.3.1 樣品提取準(zhǔn)確吸取10 mL豬尿于50 mL塑料離心管中，加入20 mL 0.02 mol/L醋酸銨溶液，渦旋混勻后，加入2.5 mL 50%三氯乙酸溶液，渦勻，8 500 r/min離心5.0 min，過濾，分別采用20 mol/L和2 mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)濾液pH 值至10.0 ± 0.05，加入20 mL 乙酸乙酯，渦勻，4 700 r/min 離心3.0 min，取上層清液于100 mL濃縮瓶中。重復(fù)提取一次，合并有機(jī)相，濃縮至干，用3 mL 2%甲酸水溶液溶解，待凈化。

1.3.2 凈 化取待凈化溶液于活化好的PCX陽離子固相萃取柱中，上樣后，依次用3 mL 2%甲酸水溶液和3 mL 甲醇淋洗，棄去淋洗液，抽干后，用6 mL 氨水－甲醇溶液（1∶19，體積比）洗脫，在40 ℃水浴中氮?dú)獯蹈缮鲜鱿疵撘海嚬芾鋮s后準(zhǔn)確加入0.2 mL正庚烷復(fù)溶，渦勻，過0.22μm 有機(jī)系濾膜后，再裝入有內(nèi)襯管的進(jìn)樣小瓶中，待測(cè)。

1.4 分析條件

色譜柱：CHIRALPAK IA－3（4.6 mm×100 mm，3μm）；流動(dòng)相：A 為CO2，B 為含10 mol/L 醋酸銨的甲醇溶液（0.5∶99.5，體積比，下同）；梯度洗脫程序：0～2.0 min，7%B；2.0～2.1 min，7%～20%B；2.1～6.0 min，20%B；6.0～6.1 min，20%～7%B；6.1～8.0 min，7%B；系統(tǒng)背壓：13.8 MPa；流速：2.0 mL/min；進(jìn)樣量：10μL；柱溫：40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：241 nm。

1.5 梯度分離條件

梯度分離條件1：0～2.0 min，7% B；2.0～2.1 min，7%～20% B；2.1～4.0 min，20% B；4.0～4.1 min，20%～7%B；4.1～6.0 min，7%B。

梯度分離條件2：0～2.0 min，7% B；2.0～2.1 min，7%～20% B；2.1～5.0 min，20% B；5.0～5.1 min，20%～7%B；5.1～8.0 min，7%B。

梯度分離條件3：同“1.4”。

梯度分離條件4：0～2.0 min，5% B；2.0～2.1 min，7%～25% B；2.1～6.0 min，25% B；6.0～6.1 min，25%～7%B；6.1～8.0 min，7%B。

2 結(jié)果與討論

2.1 系統(tǒng)背壓的選擇

UPC2采用超臨界狀態(tài)的CO2作為流動(dòng)相，通過系統(tǒng)背壓和溫度的調(diào)整可有效改變CO2的密度，從而改變其對(duì)物質(zhì)的溶解能力、洗脫能力和選擇性。由于CO2只有溫度超過31 ℃且壓力超過7.38 MPa，才會(huì)進(jìn)入超臨界CO2狀態(tài)。因此本實(shí)驗(yàn)以10 mol/L 醋酸銨－甲醇溶液（0.5∶99.5）作為助溶劑，在柱溫40 ℃下考察了4 種不同系統(tǒng)背壓（10.3、13.8、17.2、20.7 MPa）對(duì)克倫特羅對(duì)映體分離的影響（見圖2）。結(jié)果顯示，隨著系統(tǒng)背壓的升高，分析物的保留時(shí)間提前。4種條件下，2種克倫特羅對(duì)映體在系統(tǒng)背壓13.8 MPa時(shí)色譜峰形和分離度均達(dá)到最佳。綜合考慮保留時(shí)間、峰形及系統(tǒng)壓力，本研究選擇系統(tǒng)背壓為13.8 MPa。

圖2不同系統(tǒng)背壓對(duì)（+）－克倫特羅和（－）－克倫特羅對(duì)映體分離效果的影響Fig.2 Effects of different of system back pressures on separation of（+）－clenbuterol and（－）－clenbuterol

2.2 定容試劑的選擇

考察了5種定容試劑（甲醇、乙醇、乙腈、異丙醇、正庚烷）對(duì)10 mg/L克倫特羅對(duì)映體的拆分效果（如圖3）。結(jié)果顯示，當(dāng)采用甲醇和乙醇作為定容試劑時(shí)，目標(biāo)物的峰形和分離度較差；當(dāng)采用乙腈、異丙醇和正庚烷作為定容試劑時(shí)，2種克倫特羅對(duì)映體的色譜峰均在6.0 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了完全分離，但相比于異丙醇和乙腈，采用正庚烷作為定容試劑時(shí)，目標(biāo)物的色譜峰分離度更好，峰形更尖銳。因此，最終確定正庚烷為定容試劑。

圖3 不同定溶劑對(duì)（+）－克倫特羅和（－）－克倫特羅分離效果的影響Fig.3 Effects of different constant volume reagents on separation of（+）－clenbuterol and（－）－clenbuterol

2.3 不同梯度分離條件的影響

為了獲取最佳的梯度分離條件，本文以CO2（A）與醋酸銨－甲醇溶液（0.5∶99.5，B）為流動(dòng)相，分別采用“1.5”中不同梯度分離條件考察了（+）－克倫特羅和（－）－克倫特羅的分離效果。由圖4 可見，采用梯度分離條件4時(shí)，兩種克倫特羅對(duì)映體未完全分離，其他3種梯度分離條件可實(shí)現(xiàn)兩種對(duì)映體的完全分離，且以梯度分離條件3時(shí)兩種對(duì)映體的色譜峰形和基線最佳，故本實(shí)驗(yàn)采用梯度條件3。

圖4 不同梯度條件對(duì)（+）-克倫特羅和（-）-克倫特羅分離效果的影響Fig.4 Effects of different gradient conditions on separation of（+）-clenbuterol and（-）-clenbuterol

2.4 凈化條件的優(yōu)化

對(duì)比了HLB、MCX、PCX 和WCX 固相萃取柱對(duì)豬尿中克倫特羅對(duì)映體的凈化效果（見圖5）。結(jié)果表明，采用HLB 和WCX 柱凈化時(shí)，克倫特羅對(duì)映體在“1.3.2”淋洗條件下幾乎全部流失，造成洗脫液中剩余目標(biāo)物含量較少，回收率低。采用MCX 和PCX 柱凈化時(shí)，2 種克倫特羅對(duì)映體的回收率均達(dá)86.0%以上，且PCX 柱凈化時(shí)，雜質(zhì)峰對(duì)（－）－克倫特羅的干擾更小。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇PCX 柱作為最佳固相萃取柱。

圖5 固相萃取柱對(duì)(+)－克倫特羅和（-）-克倫特羅凈化效果的影響Fig.5 Effects of solid phase extraction columns on the purification and recoveries of（+）－clenbuterol and（－）－clenbuterol

2.5 線性范圍與定量下限

將（+）－克倫特羅和（－）－克倫特羅的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)。結(jié)果表明，兩種對(duì)映體均在50～10 000μg/L 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r2）分別為0.999 9、0.999 8。通過在不含有克倫特羅的豬尿空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)品，按照本方法進(jìn)行測(cè)定，以信噪比（S/N）=10 計(jì)算定量下限（LOQ），得到兩種對(duì)映體的LOQ均為1.0μg/L。

2.6 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

采用分別在不含克倫特羅的豬尿空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法進(jìn)行回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）的測(cè)定，兩種克倫特羅對(duì)映體的加標(biāo)水平分別為1.0、5.0、20.0 μg/L，每濃度水平平行測(cè)定6 次，計(jì)算加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見表1。兩種克倫特羅對(duì)映體的回收率為76.4%～94.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=6）為3.6%～6.6%。該回收率和RSD 符合SN/T 0001－2016［24］的要求，能夠滿足豬尿樣品的分析要求，可用于日常檢測(cè)。

表1 豬尿空白樣品中2種克倫特羅對(duì)映體的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 1 Spiked recoveries and relative standard deviations of 2 kinds of clenbuterol stereoisomers in swine urine（n=6）

2.7 方法的應(yīng)用

2.7.1 實(shí)際樣品的測(cè)試為了考察本方法的有效性和實(shí)用性，應(yīng)用所建立的方法對(duì)20 份從養(yǎng)豬場(chǎng)抽取的豬尿樣品中（+）－克倫特羅和（－）－克倫特羅的含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，20份豬尿樣品中均未檢出（+）－克倫特羅和（－）－克倫特羅。

2.7.2 外消旋體標(biāo)準(zhǔn)品的拆分采用本方法對(duì)所采購的克倫特羅外消旋體標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行拆分及測(cè)定，如圖6 所示，2 種克倫特羅對(duì)映體在6.0 min 內(nèi)實(shí)現(xiàn)有效拆分，色譜峰的保留時(shí)間順序依次為：（+）－克倫特羅、（－）－克倫特羅。根據(jù)上述繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用外標(biāo)定量法計(jì)算克倫特羅外消旋體標(biāo)準(zhǔn)品中兩種克倫特羅對(duì)映體的含量，其中（+）－克倫特羅的含量為5.6 mg/L，（－）－克倫特羅的含量為5.5 mg/L。該計(jì)算結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道工業(yè)品克倫特羅外消旋體中（+）－克倫特羅與（－）－克倫特羅的比例為1.02∶1.00基本相符［13］。

圖6 克倫特羅外消旋體拆分的色譜圖Fig.6 Chromatograms for separation of standard clenbuterol racemate

3 結(jié) 論

本文優(yōu)化了豬尿樣品中克倫特羅對(duì)映體的凈化方法、分離條件等主要參數(shù)，建立了超高效合相色譜法拆分克倫特羅對(duì)映體及測(cè)定其在豬尿中含量的分析方法。同時(shí)還利用所建立的優(yōu)化方法對(duì)克倫特羅外消旋體標(biāo)準(zhǔn)品和實(shí)際豬尿樣品進(jìn)行分析測(cè)定。研究結(jié)果表明，本方法具有分離效果好、分析速度快、綠色環(huán)保、靈敏度高等特點(diǎn)，能夠滿足豬尿樣品中克倫特羅對(duì)映體含量測(cè)定的需求。