萘乙酸多孔磁性分子印跡聚合物微球的制備

談曉佩，李珊珊，石海珠，張純姑*，封 順*

（1.西南交通大學 生命科學與工程學院，四川 成都 610031；2.烏魯木齊市第十五中學，新疆 烏魯木齊 830046）

萘乙酸（α-Naphthylacetic，NAA）是一種廣譜、高效的植物生長調(diào)節(jié)劑，具有促進植物生根、抽芽、開花，防止落花落果，促進果實成熟和增產(chǎn)等調(diào)節(jié)作用，廣泛用于小麥、水稻、棉花、番茄等農(nóng)作物中［1］。NAA 具有神經(jīng)毒性和急性毒性，其在農(nóng)作物中的殘留進入人體后可使人的生殖和發(fā)育受損，甚至導致癌癥［1－3］。因此許多國家和組織將NAA 列入限制使用的農(nóng)藥名單。我國（GB 2763－2019［4］）和歐盟（EC 396/2005［5］）分別規(guī)定NAA在食品中的最大殘留限量（MRL）為100μg·kg－1和60μg·kg－1。

針對NAA 的測定，目前已發(fā)展了熒光分光光度法［6－7］、氣相色譜法［8－9］、高效液相色譜法（HPLC）［10－13］、色譜－質(zhì)譜聯(lián)用［14－17］等技術(shù)。但由于NAA 的殘留量相對較低，且樣本基質(zhì)復雜，為提高檢測結(jié)果的可靠性和準確性，實現(xiàn)高通量分析，開發(fā)新的樣本前處理技術(shù)具有實際應用價值。

分子印跡聚合物（Molecular imprinted polymers，MIPs）對待測化合物具有特異性識別能力，兼具實用性高、分離速度快、制備方便等優(yōu)點，近年來被廣泛應用于天然產(chǎn)物、食品、生物和環(huán)境樣品中目標化合物的選擇性識別［18－22］。NAA 的分子印跡聚合物目前也得到了應用，但其制備步驟繁瑣、耗時［23－24］。

本文將磁分離技術(shù)引入MIPs 中，發(fā)展了一種無皂液乳化技術(shù)制備NAA 磁性分子印跡聚合物多孔微球的方法。以甲基丙烯酸－苯乙烯聚合物前驅(qū)體為功能單體，NAA為模板分子，與Fe3O4磁流體和引發(fā)劑偶氮二異丁腈混合，采用“一鍋法”快速制得NAA－mMIPs 微球。該制備方法簡便、快捷，同時賦予微球多孔結(jié)構(gòu)，有利于提高傳質(zhì)速率，增加實際結(jié)合位點數(shù)量。

1 實驗部分

1.1 試劑、儀器與色譜條件

萘乙酸（C12H10O2，分析純）購于上海阿拉丁試劑有限公司；硫酸亞鐵銨（（NH4）2SO4·FeSO4·6H2O）、甲醇（MeOH）、乙醇（EtOH）、氯仿（CHCl3）、乙酸（HAc）購于天津市永盛精細化工廠；甲基丙烯酸（MAA）、偶氮二異丁腈（AIBN）購于天津市光復精細化工研究所；苯乙烯（St）、油酸（OA）、氫氧化鈉（NaOH）、環(huán)己烷（C6H12）購于天津市富宇精細化工有限公司；番茄購自烏魯木齊當?shù)爻?。實驗用水為超純水?/p>

采用LEO 1430VP 掃描電子顯微鏡（SEM，德國LEO 電鏡有限公司）、H－600 透射電子顯微鏡（TEM，日本日立公司）、Presti－21傅里葉變換紅外光譜儀（FT－IR，日本島津公司）對微球形貌、紅外光譜數(shù)據(jù)進行表征。

LC－10Atvp HPLC（日本島津）由LC－10Atvp二元泵和SPD－10Avp檢測器組成。色譜條件如下：色譜柱OptimaPak C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm），進樣量20μL；流動相為甲醇－0.2%乙酸水溶液（體積比1∶1），等度洗脫，流速1.0 mL·min－1，檢測波長280 nm。分析前所有樣品需用0.45μm微孔膜過濾。

1.2 實驗條件

1.2.1 Fe3O4磁流體的制備Fe3O4磁流體的制備參考本實驗室之前的工作［25］：將10 mL 0.2 mol·L－1（NH4）2SO4?FeSO4?6H2O 溶液在攪拌下加入30 mL 0.1 g·mL－1NaOH/EtOH/OA（1∶1∶1，體積比）溶液；于40 mL 聚四氟乙烯反應釜中180 ℃反應10 h；待其自然冷卻至室溫，取出沉淀；用10 mL 環(huán)己烷和30 mL EtOH連續(xù)洗滌，重復3次。最后將得到的產(chǎn)物分散于4 mL CHCl3中，儲存，備用。

1.2.2 聚合物前驅(qū)體的合成將0.4 mL MAA、10.0 mL St和0.2 g AIBN 加入60 mL CHCl3中，混合均勻后，100 ℃反應10 h。冷卻至室溫，加入120 mL CH3OH，離心，收集沉淀；用20 mL CHCl3洗滌3次，以除去未反應的單體；60 ℃真空干燥12 h，即得poly（St－co－MAA）前驅(qū)體［23］。

1.2.3 磁性分子印跡聚合物的制備將300μL磁流體、1 mmol·L－1NAA 水溶液和0.524 6 g聚合物前驅(qū)體依次加入4 mL CHCl3中，混合均勻后，于攪拌下緩慢加入10 mL 0.1 g·mL－1NaOH 水溶液；70 ℃反應2 h，自然冷卻至室溫后磁分離；依次用1 mL MeOH、含10%（體積分數(shù)）HAc 的MeOH 溶液洗滌。60 ℃真空下干燥，即得產(chǎn)物NAA 磁性分子印跡聚合物（mMIPs）。同時，不添加模板分子NAA，平行制備了磁性非印跡聚合物（mNIPs）。

1.2.4 吸附性能等溫吸附實驗：將10 mg mMIPs 或mNIPs 分散于2 mL 質(zhì)量濃度1～100 μg·mL－1的NAA 標準溶液中，室溫振蕩3 h，磁分離；采用標準曲線法，利用UV－Vis 在280 nm 處測定吸附前后溶液中NAA的質(zhì)量濃度。

吸附動力學實驗：將10 mg mMIPs 或mNIPs分散于2 mL 50μg·mL－1的NAA 標準溶液中，按一定時間間隔（5、15、30、60、90、120、180 min）收集上清，利用UV－Vis 在280 nm 處測定溶液中NAA 的質(zhì)量濃度。

1.2.5 實際樣本檢測將烏魯木齊當?shù)爻匈徺I的番茄洗凈后，榨汁，過0.45μm 微孔膜。分別加入NAA 標準溶液配制最終質(zhì)量濃度分別為0.005、5、15、25 μg·mL－1的加標液。加入10 mg mMIPs，孵育90 min；磁分離后，用1 mL MeOH－HAc（9∶1，體積比）洗脫捕獲的NAA，重復3 次。合并洗脫液，真空干燥后，以100μL流動相復溶，過膜后，進行HPLC分析。其中0.005μg·mL－1加標樣本的樣本量為2 mL。

以上實驗均重復3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 NAA－mMIPs的表征

從TEM 圖可以發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e3O4磁流體粒徑在5～30 nm 之間（圖1A）。SEM 圖顯示，NAA－mMIPs 粒徑為80μm，微球呈多孔結(jié)構(gòu)，孔洞均勻分布，直徑約1～10μm（圖1B）。該多孔結(jié)構(gòu)使得微球具有較大的比表面積，同時顯著增加了可接觸識別位點數(shù)量，有利于增大柱容量，提升傳質(zhì)速率。在圖1C 中，曲線a（Fe3O4）578 cm－1處的峰為Fe3O4的Fe—O 特征峰。曲線b（poly（St－co－MAA）前驅(qū)體）中，750、830、1 500、1 580 cm－1處均為poly（St－co－MAA）中苯環(huán)的特征峰；1 697 cm－1處為C====O 紅外吸收峰，2 800 cm-1和3 000 cm－1處的峰可歸屬為—CH3的伸縮振動，3 400 cm－1處為—OH的伸縮振動。而在曲線c 中，可同時觀察到上述官能團（Fe—O、苯環(huán)、C====O、—CH3、—OH）的紅外特征吸收峰，表明NAA－mMIPs 被成功制備。同時該微球具有良好的磁響應性，在外加磁場作用下，可在30 s 內(nèi)實現(xiàn)液固分離（圖1D）。

圖1 Fe3O4的TEM圖（A），NAA－mMIPs的SEM圖（B）、FT－IR光譜圖（C）、磁分離圖（D）Fig.1 TEM image of Fe3O4（A），and SEM（B），F(xiàn)T－IR（C），magnetic separation image（D）of NAA－mMIPs a.Fe3O4，b.poly（St－co－MAA）precursor，c.mMIPs

2.2 等溫吸附性能測試

依據(jù)等溫吸附實驗結(jié)果，以方程（1）計算NAA在mMIPs和mNIPs上的吸附量（Q，mg·g－1）：

式中：C0（μg·mL－1）表示模板分子的初始質(zhì)量濃度；Ct（μg·mL－1）表示吸附后上清液中模板分子的質(zhì)量濃度；m（g）表示聚合物的質(zhì)量；V（mL）表示所取模板分子溶液的體積。從圖2A 可以發(fā)現(xiàn)，隨著NAA 初始質(zhì)量濃度的增加，mMIPs 對模板分子的結(jié)合量增加。同時，mMIPs 在所有濃度下的吸附量均顯著高于mNIPs。說明MNIPs 對NAA 的吸附是由非特異性相互作用引起的。

采用Scatchard方程（式2）進一步對其吸附性能進行分析：

式中：Q（mg·g－1）為mMIPs 對模板分子的平衡結(jié)合量；C（μg·mL－1）為溶液中模板分子的平衡質(zhì)量濃度；Qmax（mg·g－1）為結(jié)合位點的最大表觀結(jié)合量；Kd（μg·mL－1）為結(jié)合位點的平衡解離常數(shù)。從圖2B中可以看出，mMIPs的Scatchard圖由兩條斜率不同的直線組成，說明mMIPs對NAA 的結(jié)合存在高和低兩種親和位點，擬合所得線性方程分別為y=－6.200 × 10－3x+ 0.182 0（r2= 0.995 5）和y= 7.800 ×10－3x+0.152 1（r2=0.968 8）。由斜率和截距可得高、低親和位點的解離常數(shù)和最大表觀結(jié)合量分別為161.30 μg·mL－1、29.35 mg·g－1以及－128.20 μg·mL－1、－19.50 mg·g－1。對于mNIPs，其Scatchard圖中僅有一條曲線（圖2C），說明NAA－mNIPs與NAA 的結(jié)合只有一種形式，線性方程為y=－1.629×10－2x+0.075 88，解離常數(shù)Kd=61.39μg·mL－1，最大表觀吸附量Qmax=4.658 mg·g－1。上述結(jié)果表明mMIPs 存在著特異性和非特異性吸附，但特異性吸附要遠強于非特異性吸附；而mNIPs 對NAA 的吸附?jīng)]有選擇性，僅存在著非特異性吸附。

圖2 mMIPs和mNIPs等溫吸附曲線（A），mMIPs（B）和mNIPs（C）的Scatchard曲線Fig.2 The adsorption isotherms of mMIPs and mNIPs（A），Scatchard plots of mMIPs（B）and mNIPs（C）

2.3 動力學吸附性能測試

動力學吸附實驗結(jié)果見圖3。由圖3A可知，mMIPs在120 min時基本達到吸附平衡。分別采用偽一級動力學模型（式3）和偽二級動力學模型（式4）對吸附數(shù)據(jù)進行擬合：

圖3 mMIPs和mNIPs吸附動力曲線（A），mMIPs和mNIPs的偽一級（B）和偽二級（C）動力學模型Fig.3 The adsorption curves of mMIPs and mNIPs（A），the pseudo-first-order（B）and pseudo-second-order（C）kinetic models of mMIPs and mNIPs

式中：Qe（mg·g－1）和Qt（mg·g－1）分別為達到吸附平衡和在時間t時的吸附量；k1（min）和k2（g·mg－1·min－1）分別為偽一級和偽二級動力學吸附速率常數(shù)。由表1 可以看出，mMIPs 和mNIPs 對NAA的吸附更吻合偽二級動力學模型，化學吸附為決速步。

表1 NAA－mMIPs及NAA－mNIPs的動力學模型結(jié)果Table 1 The experimental results of absorption kinetics of NAA－mMIPs and NAA－mNIPs

2.4 方法學考察

首先建立了HPLC測定NAA的標準曲線，其在1～100μg·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r2為0.999 8，說明該HPLC方法可應用于NAA的準確定量。分別配制NAA最終質(zhì)量濃度為5、15、25μg·mL－1的番茄汁加標溶液，取2 mL 經(jīng)mMIPs 處理后，采用優(yōu)化的HPLC 條件對洗脫液進行分析，得到其平均回收率為78.7%～89.2%，相對標準偏差（RSD，n=3）小于3.9%，表明方法重現(xiàn)性良好。進一步將mMIPs應用于番茄汁中質(zhì)量濃度低至0.005μg·mL－1的NAA的富集，由圖4可見，番茄汁、加標番茄汁、上清液對應的色譜圖中均無NAA 色譜峰，而在洗脫液中能夠清晰觀察到NAA 的色譜峰，且其平均回收率高達80.3%（RSD<5.0%，n=3）。該NAA測定值（0.005μg·mL－1）遠低于國標［4］或歐盟標準［5］規(guī)定的最大殘留限量。上述實驗結(jié)果證實所制備的mMIPs對NAA表現(xiàn)出優(yōu)異的選擇性和特異性，能夠有效消除復雜基質(zhì)的影響，對實際樣本中痕量NAA的測定結(jié)果具有高準確性和可靠性。

圖4 番茄汁原液（A）、加標液（B）、mMIPs處理后的上清液（C）和洗脫液（D）的色譜圖Fig.4 Chromatograms of initial sample（A），spiked sample（B），the supernatant after treated with the mMIPs（C）and the eluent（D）

3 結(jié) 論

本文將Fe3O4磁流體、poly（St－co－MAA）共聚物、NAA 和CHCl3混合，成功制備了NAA 多孔結(jié)構(gòu)mMIPs，并采用多種方法研究了吸附劑的形態(tài)和吸附行為。方法簡便，制備的NAA－mMIPs 擁有多孔結(jié)構(gòu)和良好的超順磁性，同時對NAA 表現(xiàn)出高的識別能力。實際樣品測定表明，mMIPs可實現(xiàn)復雜食品中微量NAA的高效富集。