超高效液相色譜－四極桿/靜電場軌道阱質(zhì)譜測定豬尿中環(huán)丙氨嗪及其代謝物殘留量

羅秋紅，韓 穎，胡 蓓，鄧智偉，曾 臻，萬建春，占春瑞

（南昌海關(guān)技術(shù)中心，江西 南昌 330038）

環(huán)丙氨嗪（Cyromazine）是一種含氮雜環(huán)類殺蟲劑，2002 年被農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)為三類新獸藥。在養(yǎng)殖場中，環(huán)丙氨嗪主要作為預(yù)混劑拌入飼料，通過飼喂的方式進入動物體內(nèi)，其中大部分以原型及其代謝物的形式隨尿液和糞便排出體外，沉積在糞便中的環(huán)丙氨嗪可殺滅蠅蛆［1］。因作用效果明顯，導(dǎo)致養(yǎng)殖戶將環(huán)丙氨嗪長期應(yīng)用于豬飼料中而沒有休藥期，造成了動物性產(chǎn)品的藥物殘留。雖然研究表明環(huán)丙氨嗪的毒性較小，但其代謝產(chǎn)物三聚氰胺（Melamine）能導(dǎo)致小鼠膀胱腫瘤，是一種潛在的致癌物質(zhì)，因此我國制定了動物源食品中環(huán)丙氨嗪的殘留限量［2］。三聚氰胺可與三聚氰酸形成不溶性絡(luò)合物，導(dǎo)致貓急性腎功能衰竭而死亡［3］。目前動物源食品中環(huán)內(nèi)氨嗪和三聚氰胺的檢測較受關(guān)注，也出臺了相應(yīng)的檢測方法標(biāo)準(zhǔn)，但對于飼養(yǎng)環(huán)節(jié)控制環(huán)丙氨嗪喂食量，監(jiān)控尿樣殘留量與食用動物組織殘留量的關(guān)聯(lián)性研究未見報道。

目前，蔬菜、牛奶、肉制品等樣本中環(huán)丙氨嗪和三聚氰胺的測定方法已有報道，包括酶聯(lián)免疫法［4］、快速檢測試紙條法［5］、高效液相色譜法［6－8］、液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法［9］和毛細管電泳法［10］等。酶聯(lián)免疫法和快速檢測試紙條法的檢測原理均為抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，檢測速度快，但存在假陽性的可能。高效液相色譜法靈敏度較低，無法滿足低含量樣本的檢測要求。毛細管電泳法在檢測復(fù)雜樣品時，雜質(zhì)干擾較大。液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法的抗基質(zhì)干擾能力及靈敏度較高，但多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）的定性能力有一定局限性。液相色譜－串聯(lián)高分辨質(zhì)譜技術(shù)具有靈敏度高、定性準(zhǔn)確的特點，在農(nóng)獸藥等化學(xué)污染物的檢測方面應(yīng)用廣泛［11－14］，但關(guān)于豬尿中環(huán)丙氨嗪及其代謝物三聚氰胺殘留的檢測方法報道較少。

本文利用超高效液相色譜－四極桿/靜電場軌道阱質(zhì)譜（UHPLC－Quadrupole－Orbitrap MS），采用平行反應(yīng)監(jiān)測模式（PRM），建立了豬尿中環(huán)丙氨嗪及其代謝物三聚氰胺殘留量的檢測方法，可為研究控制環(huán)丙氨嗪喂食量提供有效的檢測手段。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Q Exactive 質(zhì)譜儀，配UltiMate 3000 超高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher 公司）；Agilent 6495 液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Agilent公司）；N－EVAP氮吹儀（美國Organomation 公司）；MCX固相萃取柱（60 mg/3mL，上海安譜公司）；Milli－Q超純水機（美國Millipore公司）。

環(huán)丙氨嗪（純度99.26%，Dr.Ehrenstorfer 公司）；三聚氰胺（純度99.9%，TMstandard 公司）；三聚氰胺－15N3（純度98.8%，TRC公司）；乙酸、氨水（分析純，西隴科學(xué)股份有限公司）；甲酸（色譜純，科密歐化學(xué)試劑有限公司）；乙酸銨（色譜純，ACS公司）；β-葡萄糖醛苷酸酶/芳基硫酸酯酶（>100 000 U/mL，上海安譜公司）；三氯乙酸（色譜純，西亞化學(xué)科技有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，默克公司）；實驗用水為Milli－Q超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確稱取適量的環(huán)丙氨嗪、三聚氰胺以及三聚氰胺－15N3（內(nèi)標(biāo)），分別置于10 mL 容量瓶中，用95%乙腈水溶液溶解定容，配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。取標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，用95%乙腈水溶液配制質(zhì)量濃度為100 ng/mL 的環(huán)丙氨嗪和三聚氰胺混合標(biāo)準(zhǔn)工作液以及1.0μg/mL 的內(nèi)標(biāo)工作液，于4 ℃下保存。

分別準(zhǔn)確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)工作液及內(nèi)標(biāo)工作液適量，用95%乙腈水溶液配制成質(zhì)量濃度為0.2、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為10.0 ng/mL。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取2.0 g 豬尿樣本于離心管中，加入100 μL 內(nèi)標(biāo)工作液和6 mL 1%三氯乙酸溶液，渦旋1 min，超聲5 min。以4 500 r/min 離心5 min，上清液轉(zhuǎn)入經(jīng)5 mL 甲醇和5 mL 水活化后的MCX 固相萃取柱中，用5 mL 2%甲酸水淋洗后，負壓抽干MCX 柱，加入5 mL 5%的氨水甲醇洗脫，收集全部洗脫液。氮吹至干，加入1 mL 95%乙腈水溶液復(fù)溶，過0.22μm 微孔濾膜，樣品溶液用95%乙腈水溶液稀釋10倍后，待檢測。

1.4 色譜條件

色譜柱為Syncronis HILIC 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7μm），柱溫為35 ℃；流動相：A 為乙腈，B 為10 mmol/L 乙酸銨水溶液。梯度洗脫程序：0～1 min，98% A；1～5 min，98%～80% A；5～5.5 min，80%～5%A；5.5～6.5 min，5%A；6.5～7.0 min，5%～98%A；7.0～10.0 min，98%A；流速：0.4 mL/min；進樣量：2μL。

1.5 質(zhì)譜條件

Q Exactive 質(zhì)譜儀參數(shù)：離子源為可加熱電噴霧離子源（HESI－Ⅱ）；正離子掃描模式；離子傳輸管溫度為320 ℃；噴霧電壓為3.5 kV，鞘氣流速為40 arb；輔助氣流速為10 arb；PRM 模式；分辨率采用17 500；進入C 形阱的目標(biāo)離子數(shù)（AGC target）：2 × 105；監(jiān)測離子對：三聚氰胺m/z127.072 5 >85.051 2（定量離子）、127.072 5>68.024 9；內(nèi)標(biāo)m/z130.063 2>87.045 0；環(huán)丙氨嗪m/z167.103 4>85.051 1（定量離子）、167.103 4>125.081 9；碰撞能量（CE）均為75%。

Agilent 6495液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀參數(shù)：電噴霧離子源；正離子掃描模式；毛細管電壓為4 000 V；鞘氣溫度為350 ℃，鞘氣流速為11 L/min；干燥氣溫度為150 ℃，干燥氣流速為15 L/min；MRM 模式；監(jiān)測離子對：三聚氰胺m/z127.0 > 85.0（CE：27 eV，定量離子）、127.0 > 68.2（CE：35 eV）；內(nèi)標(biāo)m/z130.1 > 87.4（CE：30 eV）；環(huán)丙氨嗪m/z167.0 > 85.0（CE：23 eV，定量離子）、167.0 > 125.2（CE：23 eV）。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

實驗比較了Hypersil GOLD C18（100 mm × 2.1 mm，1.7 μm）和Syncronis HILIC（100 mm × 2.1 mm，1.7μm）2 種色譜柱對環(huán)丙氨嗪和三聚氰胺的色譜保留能力。結(jié)果表明，環(huán)丙氨嗪和三聚氰胺在C18柱上的保留較差，基質(zhì)共流出，雜質(zhì)干擾較嚴(yán)重；在HILIC 色譜柱上的出峰時間分別為3.1 min 和4.8 min 左右，色譜保留能力較C18柱強，能減少強極性雜質(zhì)的干擾，更適合環(huán)丙氨嗪和三聚氰胺的分離。分別考察了不同濃度（5、10、15、20 mmol/L）乙酸銨和乙腈作為流動相的分離效果。結(jié)果表明：乙酸銨濃度越低，三聚氰胺的響應(yīng)越高；而環(huán)丙氨嗪在乙酸銨濃度為10 mmol/L 和15 mmol/L 時的響應(yīng)較高。此外，乙酸銨濃度為10、15、20 mmol/L時，目標(biāo)化合物的峰形均較好。由于流動相中鹽濃度越高，對儀器損傷越大。綜合考慮，實驗選擇10 mmol/L乙酸銨水溶液－乙腈為流動相。三聚氰胺及其內(nèi)標(biāo)、環(huán)丙氨嗪的提取離子流色譜圖如圖1所示。

圖1 UHPLC－Quadrupole－Orbitrap質(zhì)譜上三聚氰胺（A）、內(nèi)標(biāo)（B）、環(huán)丙氨嗪（C）的提取離子流色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatograms of melamine（A），melamine－15N3（B）and cyromazine（C）on UHPLC－Quadrupole－Orbitrap MS

2.2 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

質(zhì)譜的碰撞能量對目標(biāo)物的裂解有重要影響。UHPLC－Quadrupole－Orbitrap高分辨質(zhì)譜的PRM與三重四極桿質(zhì)譜的MRM模式相似，在Q1中分離出前體離子，然后并行記錄所有生成的MS/MS碎片離子，最后以母離子>子離子進行定量，具有掃描全、質(zhì)量準(zhǔn)確、分辨率高等特點。配制1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別在MRM模式和PRM模式下對二級質(zhì)譜的碰撞能量進行優(yōu)化。在MRM模式下，根據(jù)碎片離子的相對響應(yīng)強度，確定目標(biāo)物合適的二級碰撞能量。在PRM模式下，根據(jù)碎片離子的相對響應(yīng)強度和二級質(zhì)譜信息確定合適的碰撞能量，使獲得的譜圖既有母離子的精確質(zhì)量數(shù)，又有二級質(zhì)譜的全掃描信息，滿足定性和定量的要求。圖2為UHPLC－Quadrupole－Orbitrap MS采集的二級質(zhì)譜圖，該圖譜包含了未被碎裂的母離子精確質(zhì)量數(shù)（m/z127.072 5、130.063 2和167.103 4）與所有二級碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)和豐度比。

圖2 UHPLC－Quadrupole－Orbitrap質(zhì)譜上三聚氰胺（A）、內(nèi)標(biāo)（B）以及環(huán)丙氨嗪（C）的二級質(zhì)譜圖Fig.2 MS/MS spectra of melamine（A），melamine－15N3（B）and cyromazine（C）on UHPLC－Quadrupole－Orbitrap MS

歐盟委員會決議規(guī)定［15］：當(dāng)采用普通低分辨質(zhì)譜進行分析時，低分辨質(zhì)譜－多級質(zhì)譜的母離子可獲得1個鑒定位點，多級質(zhì)譜的產(chǎn)物離子可獲得1.5個鑒定位點。質(zhì)譜方法確證化合物需有4個鑒定位點，因此在確定母離子的基礎(chǔ)上至少需要2 個子離子。低分辨質(zhì)譜法［16］通常將碎片離子（m/z127.0 >68.2，167.0>125.2）作為輔助定性離子。而高分辨質(zhì)譜－多級質(zhì)譜的母離子為2個鑒定位點，多級質(zhì)譜的產(chǎn)物離子為2.5個鑒定位點，本方法采集2個特征離子，鑒定位點數(shù)達到7。相比之下，高分辨質(zhì)譜法的鑒定位點數(shù)更多，彌補了低分辨質(zhì)譜易出現(xiàn)假陽性的缺點，具有較強的定性優(yōu)勢。

2.3 酶解試驗

葡萄糖醛酸結(jié)合是藥物代謝的重要結(jié)合方式之一。在葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶的催化下，葡萄糖醛酸通過與底物的O、S、N 或C 原子連接形成軛合的代謝物，結(jié)合后其毒性降低，且易排出體外［17］。環(huán)丙氨嗪和三聚氰胺結(jié)構(gòu)中均含有氨基，經(jīng)過豬體內(nèi)代謝，可能會產(chǎn)生葡萄醛糖酸結(jié)合物，因此對陽性豬尿樣品進行酶解試驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未酶解樣品和采用β-葡萄糖醛苷酸酶/芳基硫酸酯酶酶解的樣品中環(huán)丙氨嗪以及三聚氰胺的含量相差在15%以內(nèi)，表明結(jié)合率比較低，兩者主要以游離的形式存在，因此本實驗采用不酶解的方式進行處理。

2.4 提取條件的優(yōu)化

本研究對比了不同體積分數(shù)（50%、67%、100%）1%三氯乙酸乙腈溶液的提取效果，結(jié)果顯示3種溶液對環(huán)丙氨嗪和三聚氰胺的提取效果差異不明顯。因環(huán)丙氨嗪和三聚氰胺是極性化合物，同時為減少有機試劑的使用，本實驗采用6 mL 1%三氯乙酸作為提取溶劑。經(jīng)試驗驗證，豬尿樣品中加入6 mL 1%三氯乙酸后，pH<3.0，滿足MCX固相萃取柱的凈化條件。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

分別采用試劑和基質(zhì)樣品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線評估樣品的基質(zhì)效應(yīng)［18］。試劑標(biāo)準(zhǔn)曲線（曲線A）采用95%乙腈水溶液逐級稀釋配制成0、2、10、50、100、200、500 ng/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液?；|(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線（曲線B）用豬尿樣品，按照“1.3”方法進行提取凈化，用氮吹復(fù)溶后的溶液配制相同質(zhì)量濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。根據(jù)基質(zhì)效應(yīng)（ME，%）=斜率曲線B/斜率曲線A×100%計算。結(jié)果顯示，環(huán)丙氨嗪和三聚氰胺的ME 分別為86.2%、53.8%，表明豬尿樣品存在基質(zhì)抑制效應(yīng)，且三聚氰胺的基質(zhì)效應(yīng)較為嚴(yán)重。因儀器靈敏度較高，嘗試將試劑和基質(zhì)系列標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋10 倍和20 倍。結(jié)果表明，稀釋10 倍和20 倍后，環(huán)丙氨嗪的ME 分別為90.8%、96.1%，基質(zhì)抑制效應(yīng)較低，對外標(biāo)法定量結(jié)果影響較小。而三聚氰胺稀釋后的ME 仍低于80%，因此三聚氰胺采用同位素內(nèi)標(biāo)法定量，以補償因基質(zhì)效應(yīng)引起的響應(yīng)變化。因此本實驗采用將樣品溶液稀釋10倍進樣，以試劑標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。

2.6 方法學(xué)驗證

2.6.1 線性關(guān)系與定量下限配制0.2～50.0 ng/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，環(huán)丙氨嗪以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；三聚氰胺以待測物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)，待測物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，環(huán)丙氨嗪和三聚氰胺均在0.2～50.0 ng/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r2）大于0.99。采用樣品加標(biāo)的方式確定定量下限，樣品基質(zhì)中加標(biāo)1.0μg/kg，采用本方法進行測定，以滿足10倍信噪比（S/N）的要求得到方法定量下限為1.0μg/kg。

2.6.2 回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差取環(huán)丙氨嗪和三聚氰胺空白豬尿樣品進行加標(biāo)回收和精密度實驗，加標(biāo)水平為1.0、2.0、150.0 μg/kg，每個水平重復(fù)測定6 次（見表1）。結(jié)果顯示，環(huán)丙氨嗪和三聚氰胺的回收率為78.0%～105%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.7%～11%，符合GB/T 27404－2008［19］的要求。

表1 環(huán)丙氨嗪和三聚氰胺的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 1 Recoveries and RSDs of cyromazine and melamine（n=6）

2.7 實際樣品檢測

采用本方法對實際豬尿樣品進行檢測，將UHPLC－Quadrupole－Orbitrap MS 檢測的結(jié)果與采用LC－MS/MS 測定的結(jié)果進行比對。2 個陽性豬尿樣品的檢測結(jié)果如表2 所示，經(jīng)T檢驗驗證發(fā)現(xiàn)，樣品中環(huán)丙氨嗪的P值分別為0.7 和0.1，三聚氰胺的P值分別為0.1 和0.4，表明UHPLCQuadrupole－Orbitrap MS 和LC－MS/MS 的檢測結(jié)果不存在顯著性差異（P>0.05）。因此，兩種檢測方法的結(jié)果具有可比性。

表2 豬尿樣品中環(huán)丙氨嗪和三聚氰胺的測定結(jié)果Table 2 Determination results of cyromazine and melamine in pig urine samples

3 結(jié) 論

本文建立了1%三氯乙酸超聲提取，MCX 固相萃取柱凈化，超高效液相色譜－四極桿/靜電場軌道阱質(zhì)譜PRM 模式檢測豬尿中環(huán)丙氨嗪及其代謝物三聚氰胺的方法。該方法靈敏度高，定量結(jié)果與三重四極桿質(zhì)譜結(jié)果具有可比性，定性準(zhǔn)確，可應(yīng)用于豬尿樣品中環(huán)丙氨嗪及其代謝物殘留的分析。