端粒酶活性檢測研究進(jìn)展

郭 玥，吳 霞，夏 帆，婁筱叮

（中國地質(zhì)大學(xué)（武漢）生物地質(zhì)與環(huán)境地質(zhì)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，材料與化學(xué)學(xué)院，納米礦物材料及應(yīng)用教育部工程研究中心，湖北 武漢 430078）

端粒是存在于真核生物染色體末端的特殊結(jié)構(gòu)，由短而多且重復(fù)的非轉(zhuǎn)錄序列（TTAGGG）及系列結(jié)合蛋白組成，對細(xì)胞的復(fù)制、衰老和凋亡起著重要作用。在人體的體細(xì)胞中，隨著細(xì)胞分裂，端粒DNA 將縮短50～200 個核苷酸，使得細(xì)胞逐漸老化并喪失增殖能力而死亡。而端粒酶是一種核糖核蛋白酶，能以自身RNA 為模板，催化合成單鏈TTAGGG 重復(fù)序列于端粒的3'端，用于維持端粒長度。在正常的體細(xì)胞中，端粒酶的活性受到抑制。然而在人類腫瘤細(xì)胞中，約有85%的端粒酶活性出現(xiàn)上調(diào)［1］。因此，端粒酶活性的高表達(dá)與癌細(xì)胞的永生性密切相關(guān)，這使得越來越多的科學(xué)家將端粒酶作為一種新的腫瘤標(biāo)志物、抗癌藥物靶點(diǎn)、特異性腫瘤檢測標(biāo)志物診斷和預(yù)后指標(biāo)的重要指標(biāo)。如何有效地對端粒酶活性進(jìn)行精準(zhǔn)檢測及臨床應(yīng)用成為是醫(yī)學(xué)臨床診斷和了解疾病機(jī)制的重要問題之一。

1 端粒酶活性檢測方法

自1985年端粒酶被發(fā)現(xiàn)以來，其活性檢測方法的研究取得了一些進(jìn)展。其中，最經(jīng)典的端粒酶活性檢測方法是Piatyszek 等［2］于1995 年提出的依賴聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）的端粒重復(fù)擴(kuò)增方法（TRAP）。以后的很多關(guān)于端粒酶活性的研究方法均基于PCR 技術(shù)提出，使得該方法在靈敏度和特異性方面取得了較大的提高，但其操作繁瑣且耗時，易受到諸多因素影響，導(dǎo)致假陰性和假陽性結(jié)果，限制了對端粒酶活性的精確量化。為了進(jìn)一步優(yōu)化端粒酶的活性檢測，近年來，很多新的端粒酶活性檢測策略如化學(xué)反應(yīng)發(fā)光法、電化學(xué)法、熒光分析法、比色法等相繼被開發(fā)。

1.1 化學(xué)反應(yīng)發(fā)光法

化學(xué)反應(yīng)發(fā)光是指由化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的能量而發(fā)出的光?；瘜W(xué)反應(yīng)發(fā)光法的分析速度快、線性范圍寬且靈敏度較高。其中，過氧化物酶催化的底物過氧化氫的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)被廣泛運(yùn)用于端粒酶活性檢測。如Zhu等［3］用魯米諾/過氧化氫/對碘苯酚溶液代替市售熒光素酶，將端粒酶擴(kuò)增的特異性與化學(xué)發(fā)光的高靈敏度相結(jié)合，開發(fā)出端粒酶活性檢測方法（圖1）。其機(jī)理是，端粒酶引物通過生物素－親和素相互作用被加載到磁珠（MBs）表面，在端粒酶的催化作用下，TTAGGG 重復(fù)序列被逐步添加到引物的3'端，形成一個長的端粒DNA延伸產(chǎn)物，并與多個辣根過氧化物酶標(biāo)記的互補(bǔ)DNA雜交使得辣根過氧化物酶在磁珠表面富集（多余的辣根過氧化物酶經(jīng)磁分離和洗滌被洗除）。當(dāng)磁珠與上述溶液混合時，磁珠上富集的辣根過氧化物酶將催化過氧化氫氧化魯米諾的反應(yīng)而發(fā)出藍(lán)光（對碘苯酚作為增強(qiáng)劑），發(fā)光強(qiáng)度與10～1 000 個細(xì)胞范圍內(nèi)HeLa 細(xì)胞數(shù)的對數(shù)呈線性關(guān)系，可實(shí)現(xiàn)對端粒酶活性的超靈敏檢測（檢出限為9 個細(xì)胞），且該方法通過手持光度計(jì)可實(shí)現(xiàn)可視化檢測，適用于疾病標(biāo)志物的現(xiàn)場檢測。

圖1 基于辣根過氧化物酶催化的魯米諾/過氧化氫氧化還原反應(yīng)與手持式光度計(jì)相結(jié)合的端粒酶活性現(xiàn)場檢測方法［3］Fig.1 Field detection of telomerase activity based on the redox reaction of luminol/hydrogen peroxide catalyzed by horseradish peroxidase and hand-held photometer［3］

1.2 電化學(xué)法

1.2.1 單信號電化學(xué)法電化學(xué)法作為一種快速發(fā)展的生物分析技術(shù)，具有簡單、靈敏度高、便攜、微型化的特點(diǎn)。常見的檢測端粒酶活性的電化學(xué)方法是通過納米粒子與端粒酶延伸產(chǎn)物作用，錨定電極表面并催化電化學(xué)反應(yīng)引起電化學(xué)信號的改變來反映端粒酶活性，常以單一電信號形式讀出。鉑和金等貴金屬納米粒子具有大的比表面積，三維的大孔碳（MPC）則具有獨(dú)特的大孔結(jié)構(gòu)、優(yōu)異的導(dǎo)電性、較大的孔體積和比表面積、良好的化學(xué)惰性和熱穩(wěn)定性，另外，環(huán)氧官能化的MPC 的表面還有許多－COOH 位點(diǎn)，可與DNA 進(jìn)行自組裝。MPC 與均勻分散的貴金屬納米粒子之間的協(xié)同作用使其具有顯著的電導(dǎo)率和電催化性能?；贛PC 和鉑納米粒子（PtNPs）的電催化性能，Jia 等［4］設(shè)計(jì)了一種端粒酶觸發(fā)催化發(fā)夾型DNA 自組裝反應(yīng)（CHA）的電化學(xué)檢測方法（圖2A）。PtNPs 與MPC 結(jié)合形成的Pt/MPCCOOH 與發(fā)夾DNA 組裝成Pt/MPC－COOH－H2探針，在端粒酶的作用下，使大量Pt/MPC－COOH－H2富集于GCE 表面，催化乙酰氨基酚氧化反應(yīng)，產(chǎn)生明顯的電流信號。由于綜合了探針優(yōu)異的電催化性能和線性放大型CHA，該策略具有低的檢出限（9.02 個宮頸癌細(xì)胞/mL）和寬的線性范圍（102～107個宮頸癌細(xì)胞/mL）。類似的，酸功能化的有序介孔碳（OMC）表面也具有豐富的－COOH 位點(diǎn)，Wang 等［5－6］基于金納米棒（AuNRs）的電催化性能，在端粒酶作用下，金納米棒催化電極表面的電化學(xué)反應(yīng)，根據(jù)電化學(xué)信號來反映端粒酶活性。

近年來，金屬有機(jī)骨架（MOFs）的高比表面積和孔隙率、可調(diào)節(jié)的孔徑和形狀及良好的生物相容性使其在電化學(xué)生物傳感中具有極大的潛力。將PtNPs 鑲嵌在MOFs 材料表面，能阻礙PtNPs 的自聚集，提高其穩(wěn)定性，獲得顯著的電催化性能。Ling 等［7］開發(fā)了基于cDNA@Pt@P－MOF（Fe）催化的電化學(xué)檢測方法（圖2B）。在端粒酶作用下，將展開大量發(fā)卡DNA（HpDNA）與cDNA@Pt@P－MOF（Fe）結(jié)合，從而催化過氧化氫分解，使電信號增強(qiáng)。端粒酶活性與吸附的電催化劑的量成正比，利用EXO III酶切信號循環(huán)放大作用可使檢出限更低。類似的，Wang等［8］通過設(shè)計(jì)催化對乙酰氨基酚氧化的電化學(xué)生物傳感方法，實(shí)現(xiàn)了端粒酶和其它分析物的逐步檢測。Yang等［9］開發(fā)了基于MOFs材料的Zn2+和端粒酶的串聯(lián)逐步識別策略。

除了利用納米粒子對電化學(xué)反應(yīng)的催化性能外，還可以通過其它電化學(xué)手段來表征端粒酶活性。比如，Liu 等［10］利用端粒酶延伸產(chǎn)物與鏈霉親和素（SA）共同存在時，引發(fā)SA－生物素－DNA－生物素原位絕緣層的產(chǎn)生，通過電化學(xué)阻抗譜和掃描電化學(xué)顯微鏡共同監(jiān)測電極表面性質(zhì)的變化，實(shí)現(xiàn)了對端粒酶活性的靈敏檢測。

1.2.2 雙信號電化學(xué)法雙信號比率輸出克服了單個信號輸出時受到的信號、背景波動的影響，檢測的準(zhǔn)確性更高。比如，Dong等［11］設(shè)計(jì)了一種亞甲藍(lán)修飾的發(fā)夾探針，建立了用于端粒酶活性檢測的雙信號比率輸出方法（圖2C）。在端粒酶作用下，發(fā)卡探針打開，亞甲藍(lán)遠(yuǎn)離電極表面，原電流信號降低，Au@CeMOF－cDNA 隨之錨定于電極表面并催化對苯二酚（HQ）氧化為對苯醌（BQ）的反應(yīng)，使得另一電流信號增加。由于雙信號比率輸出，該策略具有寬的線性范圍和低的檢出限，可用于檢測單個細(xì)胞的端粒酶活性。

圖2 一種基于Pt/MPC－COOH的端粒酶觸發(fā)催化發(fā)夾DNA自組裝反應(yīng)（CHA）的電化學(xué)傳感器（A）［4］；利用cDNA@Pt@P－MOF（Fe）電催化性能檢測端粒酶活性的策略（B）［7］；利用AuNPs錨定MOFs后的電催化性能檢測端粒酶活性的電化學(xué)生物傳感器（C）［11］Fig.2 An electrochemical biosensor based on the integration of the telomerase-initiated catalyzed hairpin assembly（CHA）process with electrocatalysis by Pt/MPC－COOH（A）［4］；a strategy for detecting telomerase activity using cDNA@Pt@p－MOF（Fe）electrocatalytic performance（B）［7］；an electrochemical biosensor for detecting telomerase activity using the electrocatalytic performance of MOFs anchored by AuNPs（C）［11］

1.3 熒光分析法

1.3.1 傳統(tǒng)熒光染料傳統(tǒng)的熒光分子及其衍生物以其優(yōu)異的光物理性、熱穩(wěn)定性、易修飾等特性被廣泛用于熒光傳感材料、自組裝材料和納米材料。若一個熒光基團(tuán)（供體）的發(fā)射光譜和另一基團(tuán)（受體）的吸收光譜之間存在重疊，當(dāng)供體和受體之間的距離縮短時，熒光能量將由供體向受體轉(zhuǎn)移，該現(xiàn)象稱為熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）。熒光染料和氧化石墨烯、AuNPs之間可以產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。基于氧化石墨烯與單鏈DNA 之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，Ou 等［12］建立了一個端粒酶和miRNA－21（miR－21）同時檢測的傳感平臺（圖3A）。由于π－π 堆積相互作用，端粒酶引物和端粒酶探針、miR－21 探針可被加載到氧化石墨烯上產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象導(dǎo)致熒光猝滅，在端粒酶催化下將延伸端粒酶引物并使之與端粒酶探針互補(bǔ)配對，從而遠(yuǎn)離氧化石墨烯使異硫氰酸熒光素（FITC）發(fā)出熒光。由于氧化石墨烯的生物相容性好，該平臺可用于同時準(zhǔn)確檢測活細(xì)胞或癌癥患者組織樣本中的端粒酶活性和miR－21。

三維DNA walker 可通過酶切釋放被猝滅的熒光染料，從而使得熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象消失，熒光染料離開納米金表面后發(fā)出熒光，Huang 等［13］設(shè)計(jì)了一種三維DNA walker，在端粒酶的存在下，三維DNA walker 中的引物被拉長，通過酶切割釋放Cy5 熒光染料，染料遠(yuǎn)離金納米表面而發(fā)光。基于熒光染料和AuNPs 之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，Xu 等［14］使用MnO2負(fù)載端粒酶引物進(jìn)入活細(xì)胞細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞的端粒酶活性檢測。Xu等［15］構(gòu)建了基于金納米粒子的三維脫氧核糖核酸酶機(jī)制，并成功應(yīng)用于活細(xì)胞端粒酶的共聚焦成像識別。Yang等［16］基于量子點(diǎn)（QD）和熒光染料的FRET設(shè)計(jì)了一種DNA四面體納米探針檢測端粒酶活性（圖3B）。該探針的其中一段序列的5'和3'端分別用熒光供體量子點(diǎn)和熒光受體Alexa488染料分子標(biāo)記，因形成了發(fā)夾結(jié)構(gòu)導(dǎo)致供體和受體之間的距離縮短，從而產(chǎn)生FRET效應(yīng)。當(dāng)探針進(jìn)入細(xì)胞后，經(jīng)過端粒酶延伸，替換下發(fā)卡結(jié)構(gòu)并使其環(huán)結(jié)構(gòu)打開，F(xiàn)RET消失。該納米探針靈敏度高且檢出限為單個細(xì)胞，可用于細(xì)胞端粒酶活性的動態(tài)監(jiān)測。2019年，Ma等［17］根據(jù)2-氨基嘌呤熒光分子在分子信標(biāo)中因堿基堆積作用而產(chǎn)生的熒光猝滅，構(gòu)建了一個無猝滅劑的二次信號放大系統(tǒng)，能靈敏準(zhǔn)確地檢測相當(dāng)于1 個肺癌細(xì)胞的端粒酶，在癌癥診斷和抗癌藥物發(fā)現(xiàn)方面具有巨大的潛力。

圖3 端粒酶活性和miRNA－21同時檢測的傳感平臺（A）［12］；基于FRET的三維DNA納米探針的比率傳感器檢測端粒酶活性的示意圖（B）［16］Fig.3 A sensing platform for simultaneous detection of telomerase activity and miRNA－21（A）［12］；schematic of a FRET based three-dimensional DNA nanoprobe ratio sensor for detecting telomerase activity（B）［16］

DNA四面體是一種機(jī)械剛性的納米結(jié)構(gòu)，無需轉(zhuǎn)染試劑即可內(nèi)化到細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)化效率高、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和生物相容性好。Meng等［18］基于一種新型的DNA納米探針建立了簡單的比率傳感器，該探針由端粒酶延伸引物及用于自我遞送的三維DNA納米結(jié)構(gòu)構(gòu)成。端粒酶可改變DNA納米探針的構(gòu)型，導(dǎo)致兩個標(biāo)記的熒光團(tuán)之間的距離增加，F(xiàn)RET效率明顯降低，通過計(jì)算兩個熒光團(tuán)的峰值強(qiáng)度即可實(shí)現(xiàn)端粒酶活性的比率傳感，規(guī)避了由于單一信號導(dǎo)致的假陽性干擾的問題。該方法可用于在單細(xì)胞水平上端粒酶活性的檢測。類似的，Zhang等［19］開發(fā)了一種按順序點(diǎn)亮的多色DNA四面體探針。在端粒酶的作用下，探針上的分子信標(biāo)可依次被打開，并在不同波長處發(fā)出熒光，依次點(diǎn)亮多種顏色，實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性的檢測。除設(shè)計(jì)受體和供體外，還可直接設(shè)計(jì)成帶有自猝滅的信標(biāo)，無需額外的猝滅劑。

傳統(tǒng)的熒光染料大多基于分子信標(biāo)檢測端粒酶活性，需要同時標(biāo)記染料基團(tuán)和猝滅基團(tuán)，設(shè)計(jì)復(fù)雜，合成繁瑣，且具有疏水性，當(dāng)分子信標(biāo)在靶標(biāo)上聚集時，會導(dǎo)致嚴(yán)重的熒光猝滅，即聚集熒光猝滅（ACQ）效應(yīng)。故傳統(tǒng)的熒光染料在溶液狀態(tài)下的背景噪音大，光穩(wěn)定性差，僅能在極稀溶液中或單分子狀態(tài)下發(fā)揮作用，大大限制了傳統(tǒng)熒光分子在端粒酶活性檢測中的運(yùn)用［20］。

1.3.2 聚集誘導(dǎo)發(fā)光熒光探針2001年，Tang等［21］首次提出“聚集誘導(dǎo)發(fā)光（AIE）”的概念，并且提出了限制分子內(nèi)運(yùn)動等機(jī)制。AIE 分子在溶液狀態(tài)下具有低的背景噪音和高的光穩(wěn)定性，與傳統(tǒng)的ACQ效應(yīng)截然相反，利用此類分子能大大拓寬熒光探針在生物化學(xué)傳感領(lǐng)域中的應(yīng)用［22］。

基于AIE分子的模塊化組裝探針可以提高細(xì)胞內(nèi)化效率及檢測的特異性。Wang等［23］將具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光特性的四苯基乙烯（TPE）分子和DNA 結(jié)合得到兩親性的共軛聚集誘導(dǎo)發(fā)射探針（TPE－RDNA），用于檢測細(xì)胞中MnSOD mRNA 的表達(dá)水平，實(shí)現(xiàn)了對腫瘤組織的成像和預(yù)后分析。Wu等［24］開發(fā)了模塊化DNA 結(jié)合的聚集誘導(dǎo)發(fā)光探針（TPE－Py－DNA）用于甲基化轉(zhuǎn)移酶的檢測和成像。此外，聚集誘導(dǎo)發(fā)光探針還可用于化療、光動力療法、基因治療、手術(shù)治療、復(fù)合治療等復(fù)合治療系統(tǒng)［25－33］。以上結(jié)果表明AIE分子在體內(nèi)、體外檢測和診療一體化的應(yīng)用中都具有很大優(yōu)勢。

AIE分子帶正電，端粒酶引物帶負(fù)電，二者可通過靜電吸引相互結(jié)合。Lou等［34］設(shè)計(jì)了帶正電的四苯基乙烯類AIE 分子（TPE－Z），用于檢測膀胱癌患者尿液中的端粒酶活性（圖4A）。在端粒酶的作用下，端粒酶引物被延伸后，帶正電的TPE－Z分子吸附產(chǎn)生聚集誘導(dǎo)發(fā)光現(xiàn)象，熒光強(qiáng)度大大增強(qiáng)。為了進(jìn)一步減低發(fā)射背景，Zhuang 等［35］利用AIE 分子和猝滅劑之間的FRET 效應(yīng)，以猝滅劑修飾的端粒酶引物為探針（QP），TPE－Py分子作為熒光分子來檢測端粒酶活性（圖4B）。TPE－Py分子通過靜電作用吸附于探針上，由于FRET現(xiàn)象導(dǎo)致熒光猝滅，在端粒酶作用下，使得越來越多的AIE分子吸附于猝滅劑修飾的端粒酶引物延長鏈上，逐漸遠(yuǎn)離猝滅基團(tuán)，熒光信號得以增強(qiáng)。上述方法使用的AIE分子，展現(xiàn)出優(yōu)異的光穩(wěn)定性、低的熒光背景信號干擾以及低的生物毒性，非常適合用于細(xì)胞原位長效示蹤。在上述研究基礎(chǔ)上，Zhuang等［36］設(shè)計(jì)了猝滅劑修飾的端粒酶引物以及兩種AIE分子（TPE－H和Silole－R），使得原本靈敏度不夠的TPE－H 在Silole－R 的協(xié)同作用下，進(jìn)一步拓寬了檢測的范圍，并用于活細(xì)胞成像（圖4C）。此外，基于不同細(xì)胞周期的變化過程，Wu 等［37］首次建立了基于聚集誘導(dǎo)發(fā)光分子的上下游聯(lián)動檢測系統(tǒng)，基于聚集基元和核酸基元的定量熒光分析法，解析了細(xì)胞周期中各個時相端粒酶的逆轉(zhuǎn)錄蛋白的mRNA 表達(dá)水平（TERT mRNA）和端粒酶活性的動態(tài)過程（圖4D）。結(jié)果說明忽略周期中的異質(zhì)性對細(xì)胞群體進(jìn)行端粒酶活性檢測，將影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，細(xì)胞周期同步后分析的端粒酶活性檢測技術(shù)為腫瘤標(biāo)志物的精準(zhǔn)檢測提供了一個新的切入點(diǎn)。

圖4 基于聚集誘導(dǎo)發(fā)光特性的TPE－Z熒光探針用于端粒酶活性檢測（A）［34］；基于FRET的AIE熒光探針端粒酶活性原位檢測（B）［35］；雙熒光信號探針用于檢測原位或細(xì)胞提取物中的端粒酶活性（C）［36］；基于聚集誘導(dǎo)發(fā)光分子的上下游聯(lián)動檢測系統(tǒng)檢測細(xì)胞中的端粒酶mRNA表達(dá)水平和端粒酶活性（D）［37］Fig.4 Telomerase detection with TPE－Z fluorescent probe based on AIE（A）［34］；AIE fluorescent probe used telomerase activity detection based on FRET（in situ）（B）［35］；dual fluorescent signal probes were used to detect telomerase activity in situ or in cell extracts（C）［36］；telomerase mRNA expression level and telomerase activity in cells were detected by the upstream and downstream linkage detection system based on AIEgens（D）［37］

1.4 端粒酶可視化檢測

1.4.1 比色分析法比色分析法是通過直觀顏色的變化或測定吸光度來定性或定量分析待測物含量的方法。Wang 等［38］設(shè)計(jì)了一種端粒酶活性檢測的比色分析方法（圖5A），將端粒酶引物（TS）固定在磁珠（MBs）上，當(dāng)端粒酶和脫氧核苷三磷酸（dNTPs）存在時，端粒酶延伸產(chǎn)物與單鏈DNA 互補(bǔ)配對，通過生物素－鏈霉親和素－生物素作用將脂質(zhì)體包裹的辣根過氧化物酶連接到MBs 表面。辣根過氧化物酶催化過氧化氫和3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）之間的氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生的TMB2+作為氧化劑定量蝕刻金納米粒子。金納米粒子具有獨(dú)特的光學(xué)特性，其形態(tài)的變化和所誘導(dǎo)的調(diào)性轉(zhuǎn)化有望表現(xiàn)出多種鮮艷的顏色變化和肉眼可見的高分辨率。Wang 等［39］開發(fā)了一種端粒酶活性可視化比色分析方法（圖5B）。端粒酶引物（TS）被固定在磁珠表面，在端粒酶作用下，通過磁珠的洗滌和分離，被延長的端粒DNA 將富集在MBs 上，在K+和氯化血紅素存在下形成許多G-四鏈體，高效地催化過氧化氫氧化TMB，產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物。一個細(xì)長的TS包含幾個重復(fù)單元，可以形成多個G-四鏈體，從而得到有效的比色讀出。

1.4.2 聯(lián)合設(shè)備檢測聯(lián)合其他設(shè)備可以實(shí)現(xiàn)對端粒酶活性的可視化檢測，比如基于辣根過氧化物酶催化的過氧化氫發(fā)光反應(yīng)檢測化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，Zhu等［3］通過手持式光度計(jì)簡單而靈敏地檢測了腫瘤生物標(biāo)志物端粒酶的活性，可應(yīng)用于疾病生物標(biāo)志物的現(xiàn)場檢測（圖1A）。為進(jìn)一步探索端粒酶活性檢測信號放大的方法以不斷提高靈敏度，Liu等［40］開發(fā)了一種由葡萄糖儀讀出的核酸酶切割引發(fā)雙循環(huán)信號放大的端粒酶活性檢測平臺。利用端粒酶在引物上的擴(kuò)增及核酸酶特異性切割（由Pb2+激活核酸酶），使蔗糖轉(zhuǎn)化酶富集在MBs表面，能高效催化蔗糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖，用葡萄糖儀讀出信號（圖5C）。該方法通過雙循環(huán)實(shí)現(xiàn)信號放大的同時，還利用金屬離子及其激活的酶，提高了檢測的特異性和靈敏度，檢出限低至5個HeLa細(xì)胞。

此外，微芯片電泳化學(xué)發(fā)光檢測在生物大分子分析中具有許多優(yōu)點(diǎn)，能減少來自基體本身的干擾。Chen 等［41］開發(fā)了基于微芯片電泳化學(xué)發(fā)光以及T7 核酸外切酶依賴的信號放大端粒酶活性檢測平臺（圖5D）。由辣根過氧化物酶（HRP）修飾的探針H1 和端粒酶延伸的產(chǎn)物互補(bǔ)配對后，即被T7 核酸外切酶特異性識別并切割，釋放辣根過氧化氫酶和端粒酶延伸產(chǎn)物，釋放的端粒酶延伸產(chǎn)物繼續(xù)和新的HRP修飾的探針H1互補(bǔ)配對，實(shí)現(xiàn)信號放大。HRP修飾的探針H1和釋放的HRP都能催化過氧化氫的氧化還原反應(yīng)，可通過微芯片電泳技術(shù)實(shí)現(xiàn)二者分離，獲得較高的分辨率。該方法操作簡單、分析時間短、靈敏度高且不易受樣品底物的干擾，可用于單細(xì)胞的端粒酶活性檢測。

圖5 基于辣根過氧化物酶催化過氧化氫和TMB之間的氧化反應(yīng)產(chǎn)物TMB2+定量蝕刻AuNPs的端粒酶活性檢測的可視化比色分析法（A）［38］；基于在K+和氯化血紅素存在下催化TMB/過氧化氫反應(yīng)的G-四聯(lián)體形成的端粒酶活性的可視化比色分析法（B）［39］；結(jié)合化學(xué)反應(yīng)發(fā)光和葡萄糖計(jì)檢測端粒酶活性的方法（C）［40］；基于微芯片電泳化學(xué)發(fā)光及微芯片電泳技術(shù)實(shí)現(xiàn)端粒酶活性檢測的方法（D）［41］Fig.5 Based on quantitative etching of AuNPs by TMB2+，a visualized colorimetric strategy for telomerase activity detection between hydrogen peroxideand TMB catalyzed by horseradish peroxidase（A）［38］；a visualized colorimetric method for detecting telomerase activity based on the formation of DNA G－quadruplex catalyzing the TMB/hydrogen peroxide reaction under the presence of K+and hemin（B）［39］；a method combining chemiluminescence and glucose meter for detecting telomerase activity（C）［40］；a chemiluminescence and microchip electrophoresis method for telomerase detection（D）［41］

1.5 其它檢測方法

除上述幾大類端粒酶的高效檢測方法外，近年來還發(fā)展了一些其他檢測方法。如Li等［42］使用雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（HCR）和動態(tài)光散射（DLS）的方法，開發(fā)了通過檢測人尿中端粒酶活性來診斷膀胱癌的體外檢測方法。在端粒酶的作用下引發(fā)AuNPs 聚集，流體動力學(xué)直徑增加，可用DLS 進(jìn)行檢測。Li 等［43］提出了一種表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）方法進(jìn)行端粒酶活性檢測，可檢測單個細(xì)胞提取物的端粒酶活性。Ye 等［44］以金納米粒子為基底，利用SERS 增強(qiáng)和進(jìn)入癌細(xì)胞的自我遞送能力，通過兩個發(fā)夾DNA（H1、H2）的雜交合成了比率型雙模式探針，檢測了乳腺癌細(xì)胞中端粒酶的活性。在端粒酶的作用下，Rox的熒光開啟、拉曼關(guān)閉，探針中Cy3 的熒光關(guān)閉、拉曼開啟。與單模成像（熒光技術(shù)或SERS 技術(shù)）相比，雙光譜成像方法可提供豐富的端粒酶動態(tài)信息，能更精確地檢測活細(xì)胞中的端粒酶活性，提高單個活細(xì)胞端粒酶活性檢測的靈敏度。這也是將具有反向變化的SERS信號比測量首次用于實(shí)時活細(xì)胞中端粒酶的檢測。

2 結(jié)論與展望

端粒酶活性檢測方法主要可劃分為以下幾大類：化學(xué)反應(yīng)發(fā)光法、電化學(xué)檢測法、熒光分析法和可視化檢測法（比色法、聯(lián)合設(shè)備檢測）。在無數(shù)科研工作者的努力下，端粒酶活性檢測取得了巨大的進(jìn)步。但在實(shí)際應(yīng)用過程中，這些方法仍然具有一定局限性，比如化學(xué)反應(yīng)發(fā)光法中的酶容易降解，易受到環(huán)境的干擾，檢測成本高。電化學(xué)法檢測端粒酶活性存在信號探針不穩(wěn)定、需要添加額外的氧化還原介質(zhì)等問題。熒光分析法中的信號探針常常需要復(fù)雜的合成步驟且生物兼容性差，產(chǎn)生的背景噪聲大大降低了檢測的靈敏度。比色法的檢測現(xiàn)象明顯，但靈敏度普遍較低，難以實(shí)現(xiàn)原位檢測，例如基于G-四鏈體催化性能的比色法只能實(shí)現(xiàn)端粒酶的體外檢測。

此外，目前大多數(shù)端粒酶活性檢測仍為體外檢測，導(dǎo)致無法準(zhǔn)確了解真實(shí)樣品活體細(xì)胞中端粒酶的活性情況。因此，開發(fā)可準(zhǔn)確定量、靈敏度高、可操作性好、檢測成本低的方法來監(jiān)測細(xì)胞中端粒酶的活性仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)。隨著端粒酶活性檢測的不斷發(fā)展和進(jìn)步，對活細(xì)胞中端粒酶活性的調(diào)節(jié)以及靶向端粒酶的特異性藥物治療手段也將成為未來幾年端粒酶研究領(lǐng)域需要攻克的難題。