LED激發(fā)熒光光譜法快速測(cè)定玉米粉中的黃曲霉毒素B1

楊卓燃，李 龍，李超逸，吳 瓊，王 芳，王文明，杜一平*

（1.華東理工大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院，上海 200237；2.河南省科學(xué)院化學(xué)研究所，河南 鄭州 450002）

黃曲霉毒素（AFT）是黃曲霉和寄生曲霉等菌株產(chǎn)生的雙呋喃環(huán)類(lèi)毒素，其衍生物約20 種，分別命名為B1、B2、G1、G2、M1、M2、GM、P1、Q1、毒醇等。其中以黃曲霉毒素B1（AFB1）的毒性最大，致癌性最強(qiáng)［1］。AFB1 的半數(shù)致死量（LD50）為0.249 mg/kg，其毒性是氰化鉀的10 倍，砷的68 倍，可引起急性中毒和死亡［2－3］。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2761－2017規(guī)定了AFB1在各種食物中的限定含量，其中在玉米粉制品中的含量不得超過(guò)20μg/kg［4］。目前黃曲霉毒素的主要檢測(cè)方法包括薄層色譜法、高效液相色譜法、液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法和酶聯(lián)免疫法（ELISA）［5-10］等。薄層色譜法快速便捷，但靈敏度較低［11］，高效液相色譜法和液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法的靈敏度和準(zhǔn)確度均能滿(mǎn)足國(guó)標(biāo)要求［12］，但需要使用大型儀器，且樣品前處理較復(fù)雜，檢測(cè)周期較長(zhǎng)，不適合大量樣品的快速檢測(cè)。ELISA法是食品樣品中黃曲霉毒素的常規(guī)快檢方法，該方法較靈敏，樣品前處理較簡(jiǎn)單［13］，但復(fù)雜樣品的基質(zhì)效應(yīng)會(huì)影響檢測(cè)的可靠性，造成結(jié)果重復(fù)性較差，且易產(chǎn)生假陽(yáng)性［14］。黃曲霉毒素具有較強(qiáng)的熒光信號(hào)，有文獻(xiàn)報(bào)道汞離子（Hg2+）對(duì)黃曲霉毒素分子具有熒光增強(qiáng)效應(yīng)［15］。本文采用自行構(gòu)建的LED 燈激發(fā)的小型熒光光譜檢測(cè)裝置，基于Hg2+對(duì)黃曲霉毒素分子的熒光增強(qiáng)效應(yīng)建立了AFB1的熒光光譜檢測(cè)方法。該方法儀器小巧廉價(jià)、操作簡(jiǎn)便、靈敏度高，適用于食品、飼料等樣品中AFB1含量的快速檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LED 光源（370 nm，5 V，上海聞奕光電科技有限公司）；光纖光譜儀（波長(zhǎng)190～800 nm，OEM 機(jī)，德國(guó)Insion 公司）；PHS－25數(shù)字型精密酸度計(jì)（梅特勒－托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司）；超純水凈化系統(tǒng)（≥18.2 MΩ·cm，美國(guó)默克集團(tuán)）；Lumina熒光分光光度計(jì)（賽默飛世爾（上海）科技有限公司）。

AFB1（98%，北京百靈威科技有限公司）；硝酸汞（分析純，貴州銅仁化學(xué)試劑廠）；甲醇、乙腈、氯化鈉、氯化鋅（分析純，上海泰坦科技股份有限公司）；硝酸、氯化鉀、氯化鈣（分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；氫氧化鈉（分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；氯化錳（分析純，阿達(dá)瑪斯試劑有限公司）；氯化鋁（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；K－49 型玻璃纖維濾膜（德州市科佳環(huán)境監(jiān)測(cè)用品廠）；AFB1免疫親和柱（1 mL，深圳逗點(diǎn)生物技術(shù)有限公司）。

AFB1 儲(chǔ)備液（10 mg/L）：AFB1 標(biāo)準(zhǔn)品使用甲醇配制，-18 ℃冷藏保存，可儲(chǔ)存6 個(gè)月；使用時(shí)用甲醇稀釋?zhuān)? ℃冰箱冷藏，一周內(nèi)使用。

1.2 LED激發(fā)熒光光譜檢測(cè)裝置

目前以LED 燈作為光源的小型光譜儀［16－17］與小型光纖光譜儀［18］均已有廣泛報(bào)道，但LED 燈激發(fā)熒光——直接檢測(cè)熒光光譜用于黃曲霉毒素檢測(cè)方面的工作尚未見(jiàn)報(bào)道。在課題組前期工作［19－20］基礎(chǔ)上，本文構(gòu)建了LED激發(fā)熒光光譜檢測(cè)裝置，如圖1 所示。采用中心波長(zhǎng)370 nm 的LED 燈作為光源，對(duì)比色皿內(nèi)的樣品溶液進(jìn)行熒光激發(fā)，發(fā)射光通過(guò)光纖導(dǎo)入光譜儀中，使檢測(cè)器產(chǎn)生熒光信號(hào)，由電腦軟件采集樣品的熒光發(fā)射光譜。

圖1 熒光檢測(cè)裝置示意圖Fig.1 The schematic of the fluorescence device

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 玉米粉樣品的前處理稱(chēng)取2 g玉米粉樣品，加入25 mL甲醇－水溶液（體積比4∶1）作為提取液，同時(shí)加入2.0 g NaCl粉末破乳，磁力攪拌提取30 min，隨后過(guò)濾，收集全部濾液于25 mL容量瓶定容；取10 mL濾液，加入20 mL水后以玻璃纖維濾紙過(guò)濾至濾液澄清；取15 mL澄清濾液，以黃曲霉毒素B1專(zhuān)用免疫親和柱進(jìn)行處理，甲醇洗脫，收集洗脫液于10 mL容量瓶定容，備用。提取液于4 ℃冰箱冷藏，可放置3 d。

1.3.2 黃曲霉毒素B1的熒光光譜測(cè)量配制一系列濃度的AFB1溶液，分別取2 mL不同濃度的AFB1溶液與0.5 mL 0.001 mol/L 的硝酸汞溶液在離心管中混勻，隨后轉(zhuǎn)移至比色皿中，將比色皿放入檢測(cè)池后打開(kāi)LED燈，立即測(cè)定體系的熒光發(fā)射光譜，以443.2 nm處的發(fā)射光強(qiáng)度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取“1.3.1”中處理好的玉米粉樣品溶液2 mL 于離心管中，加入0.5 mL 0.001 mol/L 的硝酸汞溶液，混勻后立即測(cè)定其熒光發(fā)射光譜，基于443.2 nm 處的發(fā)射強(qiáng)度，使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)玉米粉中的AFB1濃度進(jìn)行定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)的選擇

使用Lumina 熒光分光光度計(jì)測(cè)定AFB1－Hg2+體系的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，發(fā)現(xiàn)367 nm 處激發(fā)光譜的強(qiáng)度最高，故選擇370 nm 的LED 燈作為激發(fā)光源。在370 nm的LED 燈激發(fā)下，AFB1－Hg2+的最大發(fā)射波長(zhǎng)為443.2 nm，故選擇該波長(zhǎng)為AFB1的分析波長(zhǎng)。

2.2 汞離子對(duì)AFB1的熒光增強(qiáng)效應(yīng)

取2 mL 1 mg/L 的AFB1 溶液兩份，一份加入0.5 mL 0.001 mol/L的硝酸汞溶液，另一份加入0.5 mL水，測(cè)定熒光發(fā)射光譜，結(jié)果如圖2 所示。從圖中可見(jiàn)，加入Hg2+后，AFB1 的熒光發(fā)射峰峰位基本不變，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)約7 倍。有文獻(xiàn)報(bào)道稱(chēng)［21］，Hg 作為S0金屬極易形成AFB1－Hg 八面體配合物，而這類(lèi)配合物通常會(huì)發(fā)生配體（AFB1）到金屬離子（Hg2+）的電荷躍遷(LMCT 躍遷)，形成2·L 型或者L－L 型或者L－M2+－L 型配體，使反應(yīng)體系中的剛性結(jié)構(gòu)得以加強(qiáng)同時(shí)共軛體系增加，導(dǎo)致發(fā)出的熒光量子數(shù)增多，進(jìn)而熒光發(fā)射光譜大大增強(qiáng)。

圖2 Hg2+對(duì)AFB1的熒光增強(qiáng)效應(yīng)Fig.2 Fluorescence enhancement effect of introducing Hg2+to AFB1 solution

2.3 自搭建的光譜儀性能驗(yàn)證

取2 mL 0.1 mg/L 的AFB1 溶液兩份，加入0.5 mL 0.001 mol/L的硝酸汞溶液，分別使用Lumina熒光分光光度計(jì)與自搭建的小型光譜檢測(cè)設(shè)備檢測(cè)其熒光發(fā)射光譜，發(fā)現(xiàn)兩種儀器的光譜形狀和發(fā)射波長(zhǎng)相近，說(shuō)明所搭建的光譜檢測(cè)設(shè)備可靠。由于激發(fā)光譜LED 燈的單色性和光強(qiáng)不如商業(yè)儀器，因此光譜噪聲相對(duì)較高，導(dǎo)致信噪比較低。但以下研究顯示其性能滿(mǎn)足AFB1 的定量分析要求。

2.4 衍生化條件的優(yōu)化

2.4.1 pH值對(duì)反應(yīng)體系的影響用稀硝酸和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)，獲得不同pH 值的樣品溶液，探索了pH 值對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響，結(jié)果如圖3 所示。從圖可知，在pH 3.0～8.0 范圍內(nèi)，體系的熒光強(qiáng)度較為穩(wěn)定；當(dāng)pH > 8.0 時(shí)，汞的水解作用嚴(yán)重影響熒光信號(hào)，而pH<3.0時(shí)，熒光強(qiáng)度也呈現(xiàn)減弱的趨勢(shì)，故測(cè)定時(shí)體系pH 值控制在3.0～8.0 范圍。

圖3 pH值對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響Fig.3 The influence of pH value on the fluorescence intensity of the system

2.4.2 Hg2+用量對(duì)反應(yīng)體系的影響由于AFB1 分子與Hg2+可結(jié)合的位點(diǎn)較多，Hg2+需過(guò)量加入。衍生化物的熒光強(qiáng)度隨Hg2+用量的增加而增強(qiáng)，在Hg2+與AFB1的濃度比大于80∶1時(shí)，熒光強(qiáng)度較高，且變化不大。考慮到熒光強(qiáng)度的穩(wěn)定性，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇Hg2+與AFB1的濃度比為200∶1。

2.4.3 甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)反應(yīng)體系的影響溶劑體系可對(duì)熒光發(fā)射強(qiáng)度產(chǎn)生明顯影響，本研究的溶劑體系中，隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的增大，熒光發(fā)射強(qiáng)度呈增加趨勢(shì)，當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)>66.7%時(shí)，體系的熒光發(fā)射強(qiáng)度基本趨于穩(wěn)定，且維持在較高的水平。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇體系中甲醇體積分?jǐn)?shù)為80%。

2.4.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)反應(yīng)體系的影響探究了反應(yīng)時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，AFB1與Hg2+的反應(yīng)十分迅速，加入Hg2+即刻就能產(chǎn)生穩(wěn)定的熒光信號(hào)，且反應(yīng)在2 h 內(nèi)的熒光強(qiáng)度基本不變。故本實(shí)驗(yàn)選擇在加入Hg2+后立即測(cè)定熒光強(qiáng)度。

2.5 干擾實(shí)驗(yàn)

選擇玉米粉中可能存在的K+、Na+、Ca2+、Zn2+、Mn2+、Al3+［22－23］進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)，在反應(yīng)體系中加入與汞離子濃度相當(dāng)?shù)纳鲜鼋饘匐x子，熒光強(qiáng)度的測(cè)定結(jié)果如圖4所示。從圖中可以看出，K+、Na+、Ca2+對(duì)原體系基本沒(méi)有干擾，而Zn2+、Mn2+、Al3+則對(duì)體系的熒光強(qiáng)度有較明顯的干擾。對(duì)這3 種離子在實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行了容忍度實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，Zn2+、Mn2+、Al3+在體系中允許存在的最大濃度依次為1.94、1.38、2.42 mmol/L。而通常情況下，玉米粉中不會(huì)含有如此高濃度的這3 種離子，因此本研究不會(huì)產(chǎn)生金屬離子的干擾，即使有也可通過(guò)調(diào)節(jié)pH 值的方法去除。文獻(xiàn)［15］還研究了Cl－、醋酸根、檸檬酸根、H2PO4－對(duì)AFB1－Hg2+體系熒光信號(hào)的影響，發(fā)現(xiàn)前3 種離子對(duì)體系基本無(wú)干擾，而H2PO4－對(duì)體系具有增敏作用。因此實(shí)際測(cè)定中要注意排除H2PO4－的影響。

圖4 金屬離子對(duì)體系熒光強(qiáng)度的干擾Fig.4 Interference of metal ions on the fluorescence intensity of the system

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

按“1.3.2”方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，AFB1 質(zhì)量濃度（x）在3～90 μg/L 范圍內(nèi)與熒光強(qiáng)度（y）具有良好的線性關(guān)系：y=5.76x+11.9，相關(guān)系數(shù)r2=0.996。方法的檢出限（LOD=3S/K，S為5次空白樣品測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差，K為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率）為0.913μg/L。

2.7 玉米粉樣品中AFB1的測(cè)定

從不同場(chǎng)所購(gòu)置兩種玉米粉樣品，利用所建立方法對(duì)其中的AFB1 含量進(jìn)行檢測(cè)，未檢出AFB1，以加標(biāo)回收率評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確度，結(jié)果如表1 所示。數(shù)據(jù)顯示，兩份玉米樣品在低、中、高3 個(gè)水平下的加標(biāo)回收率為84.1%～107%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.1%～7.1%。方法準(zhǔn)確度和精密度較理想，滿(mǎn)足歐盟標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)定要求［24－25］。

表1 玉米粉樣品中AFB1的檢測(cè)結(jié)果Table 1 Detect results of AFB1 in cornflour

3 結(jié) 論

本研究使用LED 激發(fā)的小型熒光光譜檢測(cè)裝置，建立了一種基于汞離子熒光增強(qiáng)效應(yīng)的AFB1 含量的快速檢測(cè)方法。該方法使用小巧廉價(jià)的光譜設(shè)備，樣品前處理步驟少，檢測(cè)時(shí)間短，獲得了較高的檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確度，具有一定的抗干擾能力，光譜檢測(cè)結(jié)果與商用光譜儀結(jié)果相近。同時(shí)，該小型光譜儀體積小，具有便攜性，未來(lái)有望用于食品和飼料樣品的現(xiàn)場(chǎng)快速分析檢測(cè)。此外，本方法作為一種檢測(cè)樣品中低含量分析物的新方法，也非常適用于農(nóng)業(yè)和環(huán)境領(lǐng)域中有機(jī)污染物的快速檢測(cè)。