癌性爆發(fā)痛小鼠模型的優(yōu)化與評價

楊 慧，李 欣，劉 靜，黃 東，顏 輝

(1.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院麻醉科，湖南 長沙 410013；2.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院疼痛科，湖南 長沙 410012；3.湖南省兒童醫(yī)院麻醉科，湖南 長沙 410007；4.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院疼痛科，湖南 長沙 410013；5.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院神經(jīng)外科，湖南 長沙 410013)

癌性爆發(fā)痛是臨床上一類難治性癌痛，發(fā)生率高達(dá)40%～80%[1-2]，是導(dǎo)致癌痛治療效果不佳的重要原因[3]。目前國內(nèi)外關(guān)于癌性爆發(fā)痛的研究多集中于臨床特征和藥物應(yīng)用方面[4]，對動物模型的研究罕見報道，因此建立穩(wěn)定的癌性爆發(fā)痛模型已成為亟須解決的關(guān)鍵問題。本實(shí)驗(yàn)在前期成功制備內(nèi)皮素-1(ET-1)單次誘發(fā)型骨轉(zhuǎn)移癌性爆發(fā)痛動物模型的基礎(chǔ)上(PMID：26828300)，改進(jìn)嗎啡和ET-1注射的次數(shù)和天數(shù)，制備4組模型小鼠，通過比較行為表現(xiàn)和痛閾變化，選出優(yōu)化的癌性爆發(fā)痛模型，并從疼痛行為學(xué)角度對該模型進(jìn)行評價，以期為進(jìn)一步研究提供可靠的模型平臺。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 6～8周齡雄性C57BL/6小鼠54只，體重20～25 g，購買于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司。每4～5只小鼠放一個鼠籠，飼養(yǎng)于光控(8：00—20：00，12 h照明)和溫控[(22.0±0.5)℃]、相對濕度為50%的房間內(nèi)自由獲取水和食物。本研究獲得中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院動物倫理委員會的批準(zhǔn)[No.LLSC(LA) 2016-017]。

1.2儀器及試劑 離心機(jī)(Centrifuge 5804R、5415R型，德國Eppendorf公司)，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，恒溫水浴箱(瑞典Pharmacia公司)，全自動制冰機(jī)(美國Labrepco 公司)，玻璃觀察箱(50 cm×20 cm×30 cm，自制)，Von Frey纖維絲測痛儀(美國North Coast Medical公司)，計時器(上海市秒表廠)。一次性細(xì)胞培養(yǎng)瓶(25 cm2/75 cm2，美國AXYGEN公司)，一次性離心管(15 mL/50 mL，美國AXYGEN公司)，全自動細(xì)胞計數(shù)器(美國Bio-Rad公司)，微量進(jìn)樣器(10 μL/25 μL，上海市高鴿工貿(mào)有限公司)。高糖培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，胎牛血清(美國Gibco公司)，HBSS液(美國Gibco公司)，0.25%胰酶細(xì)胞消化液(美國Gibco公司)，戊巴比妥鈉鹽(德國Merck公司)，氯四環(huán)素軟膏(江蘇南京白敬宇制藥有限公司)，鹽酸嗎啡注射液(10 mg/1 mL，181102-2，東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司，以生理鹽水稀釋，濃度為0.5 mg/mL)，ET-1[1 mg，E7764，美國Sigma公司，以無菌去離子蒸餾水溶解，濃度為75 μg/mL(30 pmol/μL)]。

1.3模型建立

1.3.1Lewis肺癌細(xì)胞懸液的制備 小鼠Lewis肺癌細(xì)胞株由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞庫提供，用含1%雙抗生素和10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，放于充滿5%CO2的37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中，隔天傳代。經(jīng)0.25%胰酶消化液消化后，取10 mL，1 000 r/min離心，沉淀5 min，沉淀物用HBSS液重懸，TC10TM自動細(xì)胞計數(shù)器計數(shù)細(xì)胞。用HBSS稀釋細(xì)胞以達(dá)到每微升2×105個細(xì)胞的最終濃度，并保存在冰盒上備用。

1.3.2骨癌痛模型的建立 參照以往課題組方法[5]：將Lewis細(xì)胞混勻，用25 μL微量進(jìn)樣器吸取細(xì)胞混懸液10 μL(2×106個細(xì)胞)待用。2%戊巴比妥鈉溶液(50 mg/kg)腹腔注射，麻醉小鼠。將小鼠左后肢固定，剪毛、消毒膝關(guān)節(jié)處皮膚。在膝關(guān)節(jié)處沿股直肌肌腱方向切開一小段皮膚切口，暴露白色肌腱。鈍性分離肌腱，暴露髁間窩伸面。用1 mL無菌注射器針頭按股骨長軸方向，從近髁間窩頂端鉆孔，有明顯落空感則已進(jìn)入股骨骨髓腔。換用25 μL微量進(jìn)樣器，向骨髓腔內(nèi)緩慢接種Lewis細(xì)胞10 μL。留針20 s后退出針頭，醫(yī)用無菌骨蠟封閉針孔?？p合皮膚后，抹上氯四環(huán)素軟膏。待活動恢復(fù)，將小鼠放回籠中。

1.3.3ET-1單次誘發(fā)型癌性爆發(fā)痛模型的建立 骨癌痛模型建立后的第16天，小鼠腹腔注射嗎啡溶液6 mg/kg，30 min達(dá)到良好鎮(zhèn)痛后，股骨腫瘤內(nèi)注射ET-1溶液20 μL(150 pmol)。

1.4實(shí)驗(yàn)分組 取36只C57BL/6小鼠，隨機(jī)分為4組：一次組(QD組)、兩次組(BID組)、三次組(TID組)和四次組(QID組)，每組9只。各組在骨癌痛模型建立后第16天開始至第18天，連續(xù)3 d，每天嗎啡和ET-1注射次數(shù)分別為1次(注射時間點(diǎn)為每天08:00)、2次(注射時間點(diǎn)為每天08:00、20:00)、3次(注射時間點(diǎn)為每天08:00、14:00、20:00)、4次(注射時間點(diǎn)為每天08:00、12：00、16:00、20:00)，注射部位和劑量同前。在每次嗎啡注射前，觀測各組小鼠表現(xiàn)和疼痛行為學(xué)指標(biāo)。

另取18只C57BL/6小鼠，根據(jù)上述結(jié)果確定其中一組為優(yōu)化模型后，復(fù)制該模型(n=9)，從第16天開始連續(xù)3 d，在每天08:00嗎啡處理前對小鼠進(jìn)行一般情況觀察。并根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)時間點(diǎn)，選擇在每次嗎啡注射前第0分鐘、嗎啡注射后30 min(ET-1注射前)、嗎啡注射后40 min(ET-1注射后10 min)和嗎啡注射后60 min(ET-1注射后30 min)時，觀察小鼠行為表現(xiàn)和檢測兩項(xiàng)疼痛行為學(xué)指標(biāo)，并以單次誘發(fā)型癌性爆發(fā)痛模型小鼠為對照(n=9)，對該優(yōu)化模型進(jìn)行評價。

1.5疼痛行為學(xué)測試

1.5.1機(jī)械縮足閾值(PWMT)測定 采用“up-down”的方法[6]，將小鼠置于距臺面40 cm的底部為金屬網(wǎng)的觀察箱中適應(yīng)20 min，依次用Von Frey纖維絲(0.16、0.40、0.60、1.00、1.40 g和2.00 g)的尖端刺激小鼠的左足底中部足墊。每次刺激3～4 s，陽性反應(yīng)是當(dāng)纖維絲尖端持續(xù)增大壓力至稍彎曲呈近似S形時，小鼠快速抬起測試后肢。每種引出陽性反應(yīng)的纖維絲在每只動物后肢上測試6次，間隔時間為2 min。小鼠該側(cè)后肢的機(jī)械觸痛閾值界定為能引出3次或3次以上陽性反應(yīng)的最小纖維絲值。

1.5.2后足使用評分測定 測試前小鼠在透明的有機(jī)玻璃觀察箱中適應(yīng)20 min，然后再進(jìn)行觀察。后足使用評分標(biāo)準(zhǔn)[7]：0分為完全不使用左后足；1分為偶爾使用左后足；2分為左后足明顯跛行，患肢輕度抬高；3分為左后足輕度跛行；4 分為正常行走。每次觀察4 min，統(tǒng)計各組小鼠在這4 min內(nèi)的后足使用評分，但其正常行走、整理毛發(fā)或晚期腫瘤致足部懸空等時的抬足行為則不予計算在內(nèi)[8]。間隔5 min后，重復(fù)測試1次，結(jié)果取兩次平均值計算小鼠患側(cè)4 min內(nèi)的后足使用評分。

2 結(jié) 果

2.1各組模型小鼠的疼痛行為學(xué)改變

2.1.1行為觀察 各組小鼠每天注射不同次數(shù)的嗎啡和ET-1，隨著嗎啡注射次數(shù)的增多，QID、TID組和BID組小鼠均先后出現(xiàn)不同程度嗎啡過量的表現(xiàn)，即小鼠不停走動或跳躍，活動增多、速度增快，出現(xiàn)易被激惹、豎尾等興奮狀態(tài)。而QD組3 d內(nèi)均顯示良好的嗎啡鎮(zhèn)痛，表現(xiàn)為小鼠活動增加，左后肢使用增多，無豎尾現(xiàn)象出現(xiàn)。

2.1.2各組藥物注射前后PWMT比較 藥物注射第1天時QD、BID組和TID組各時間點(diǎn)PWMT數(shù)值無顯著差異，而QID組在藥物第4次注射前，其PWMT較前明顯升高(P<0.05)，見圖1A。藥物注射第2天時，QD組和BID組各時間點(diǎn)PWMT數(shù)值無顯著差異，TID組在藥物第3次注射前PWMT較前顯著升高(P<0.05)，而QID組的PWMT則一直維持較高水平。第3天時，QD組的PWMT較前稍下降，而BID組第1次給藥前數(shù)值稍升高，第2次給藥前則開始明顯升高(P<0.05)，TID組的PWMT隨著注射次數(shù)增多逐漸升高，而QID組較第2天時稍下降但仍維持在較高水平。

2.1.3各組小鼠相同時間點(diǎn)后足使用評分比較 藥物注射第1天時各組小鼠后足使用評分差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。但藥物注射第2天開始，TID組和QID組后足使用評分先后明顯升高(P<0.05)，見圖1B，但QD組和BID組仍無明顯改變。而第3天時，QD組后足使用評分明顯下降，BID組則稍升高，TID組和QID組較第2天稍下降，但仍維持在較高水平。

A.左后肢的PWMT；B.后足使用評分。1-1st、1-2nd、1-3rd和1-4th分別為第1天第1次、第2次、第3次和第4次嗎啡和ET-1注射時間點(diǎn)，以此類推(n=9)。a、b、c表示與每組初始值相比，P<0.05。

2.1.4小鼠的疼痛行為學(xué)表現(xiàn)與人類癌性爆發(fā)痛臨床表現(xiàn)的符合情況 盡管ET-1腫瘤內(nèi)注射可使疼痛閾值下降，但嗎啡的重復(fù)注射可導(dǎo)致小鼠左后足長時間的痛閾異常升高。隨著嗎啡和ET-1每天注射次數(shù)的增加，小鼠的PWMT會較長時間維持在高水平，后足使用評分亦會升高，注射次數(shù)越多，痛閾升高越早。因此，QID組、TID組和BID組小鼠的疼痛行為學(xué)表現(xiàn)均與人類癌性爆發(fā)痛臨床表現(xiàn)不符，QD組符合人類癌性爆發(fā)痛臨床表現(xiàn)。

2.2癌性爆發(fā)痛小鼠優(yōu)化模型的疼痛行為學(xué)評價 選用QD組小鼠為癌性爆發(fā)痛優(yōu)化模型，并觀測該優(yōu)化模型在整個實(shí)驗(yàn)過程中的疼痛行為學(xué)變化。藥物連續(xù)注射3 d中，在嗎啡注射后30 min即ET-1腫瘤內(nèi)注射前，癌性爆發(fā)痛優(yōu)化模型小鼠的PWMT和后足使用評分均較嗎啡注射前顯著升高(P<0.05)，見圖2。而在ET-1注射后的30 min內(nèi)，在第10分鐘(嗎啡注射后第40分鐘)時兩項(xiàng)指標(biāo)均迅速下降，較ET-1注射前(嗎啡注射后第30分鐘)顯著降低(P<0.05)；而在ET-1注射后第30分鐘(嗎啡注射后第60分鐘)時，兩項(xiàng)疼痛行為學(xué)指標(biāo)較第10分鐘(嗎啡注射后第40分鐘)時的相應(yīng)指標(biāo)均升高(P<0.05)。癌性爆發(fā)痛小鼠優(yōu)化模型在3 d內(nèi)每天的兩項(xiàng)疼痛行為學(xué)指標(biāo)在注射嗎啡和ET-1的前后變化與單次癌性爆發(fā)痛模型均相似，符合臨床癌性爆發(fā)痛的發(fā)作特點(diǎn)，即此癌性爆發(fā)痛小鼠優(yōu)化模型建立成功。

每天嗎啡腹腔注射前對優(yōu)化模型小鼠左后肢的疼痛行為學(xué)指標(biāo)進(jìn)行檢測以判定其痛閾改變，結(jié)果表示ET-1注射的3 d內(nèi)，其兩項(xiàng)疼痛行為學(xué)指標(biāo)均呈現(xiàn)下降趨勢，但其中PWMT 3 d內(nèi)(1-0 min、2-0 min、3-0 min)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2A；而后足使用評分第3天(3-0 min)與第1天(1-0 min)相比明顯下降(P<0.05)，見圖2B。說明QD組連續(xù)3 d每天腹腔注射嗎啡1次并沒有影響到痛閾升高，而每天腫瘤內(nèi)注射1次ET-1卻能降低痛閾，發(fā)揮了其連續(xù)誘發(fā)癌性爆發(fā)痛的作用。

A.左后肢的PWMT；B.后足使用評分。1-0 min、1-30 min、1-40 min和1-60 min分別為第1天嗎啡注射前第0分鐘、嗎啡注射后第30分鐘(ET-1注射前)、嗎啡注射后第40分鐘(ET-1注射后第10分鐘)和嗎啡注射后第60分鐘(ET-1注射后第30分鐘)注射時間點(diǎn)，以此類推(n=9)。與同一天前一時間點(diǎn)數(shù)值相比，aP<0.05；與第1天同一時間點(diǎn)數(shù)值相比，bP<0.05。

3 討 論

癌性爆發(fā)痛是一種在基礎(chǔ)疼痛得到穩(wěn)定和充分控制的情況下，由自發(fā)或誘發(fā)因素導(dǎo)致的突發(fā)的、短暫的劇烈疼痛[9-10]，主要臨床特征為發(fā)作迅速(3 min之內(nèi)達(dá)峰值)，疼痛劇烈(NRS評分≥7分)，持續(xù)時間短(幾秒至30 min之內(nèi))，24 h內(nèi)多次發(fā)作(平均每天4～6次)[11-12]。本課題組在前期成功制備了小鼠骨癌痛模型(PMID：18326905)基礎(chǔ)之上，用外源性ET-1注射至骨癌痛小鼠股骨腫瘤內(nèi)，模擬臨床上癌痛患者局部高濃度ET-1刺激[13-14]，成功制備了ET-1單次誘發(fā)型癌性爆發(fā)痛小鼠模型(PMID：26828300)。

由于臨床上癌性爆發(fā)痛的發(fā)作特點(diǎn)為24 h內(nèi)多次發(fā)作，且極少存在單次發(fā)作或只發(fā)作1 d的情況，因此有必要將造模條件優(yōu)化，篩選出合適的藥物注射天數(shù)和次數(shù)，使模型更接近人類癌性爆發(fā)痛臨床特點(diǎn)。課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，小鼠左后肢股骨接種Lewis細(xì)胞后，腫瘤隨時間不斷增大，造模第16天，瘤體大小可達(dá)2 cm×1 cm×1 cm，達(dá)到肉眼注射條件；第19天開始有部分小鼠會出現(xiàn)行動遲緩、活動減少，患肢外翻畸形甚至骨折、神經(jīng)損傷等情況，另有部分小鼠開始有自發(fā)性爆發(fā)痛的發(fā)生，不利于癌性爆發(fā)痛行為學(xué)研究，故本實(shí)驗(yàn)中所有小鼠注射藥物的時間均選擇從骨癌痛模型建立后第16～18天。

每次嗎啡注射前，課題組均會觀察4組模型小鼠的一般表現(xiàn)并行疼痛行為學(xué)測試。隨著嗎啡注射次數(shù)的增多，QID、TID組和BID組均在3 d內(nèi)先后出現(xiàn)不同程度的嗎啡過量表現(xiàn)。而QD組主要表現(xiàn)為小鼠活動增加，左后肢使用增多，無豎尾反應(yīng)出現(xiàn)。另外，從疼痛行為學(xué)結(jié)果中還可以看出，左后肢的PWMT和后足使用評分具體變化雖不盡相同，但趨勢基本一致，QID組、TID組和BID組先后出現(xiàn)痛閾明顯增高的現(xiàn)象。盡管本實(shí)驗(yàn)設(shè)計初衷盡可能地想模擬臨床上癌性爆發(fā)痛每天平均4次的發(fā)作頻率，但在藥物注射的3 d內(nèi)，嗎啡每天注射次數(shù)增加所帶來的鎮(zhèn)痛效應(yīng)掩蓋了ET-1每天注射次數(shù)增加所產(chǎn)生的痛敏效應(yīng)，只有QD組每次處理前的疼痛行為學(xué)測試結(jié)果符合癌性爆發(fā)痛發(fā)作表現(xiàn)，故選用QD組為癌性爆發(fā)痛優(yōu)化模型。

再次成功復(fù)制該QD組模型后，每次藥物注射前后，通過對小鼠進(jìn)行左后肢的PWMT和后足使用評分檢測，觀察其誘發(fā)痛和自發(fā)痛的痛閾變化，發(fā)現(xiàn)兩者均表現(xiàn)出相同的變化趨勢，即在嗎啡注射前兩者均處于較低值，而在腹腔注射嗎啡后30 min時，其痛閾均較前明顯升高，接近于正常水平。小鼠痛閾大幅度升高，證明該劑量嗎啡可使骨癌痛小鼠達(dá)到良好鎮(zhèn)痛。但在ET-1注射后10 min左右，小鼠的痛閾均明顯降低，并且前期實(shí)驗(yàn)在ET-1注射后30 min內(nèi)各組分別行患側(cè)坐骨神經(jīng)電生理檢測，證明爆發(fā)痛是在嗎啡鎮(zhèn)痛良好的基礎(chǔ)上突然發(fā)生的疼痛(PMID：26828300)。ET-1瘤體內(nèi)注射可以使小鼠表現(xiàn)出短暫劇烈的爆發(fā)痛行為，主要表現(xiàn)為小鼠失去活動意愿，活動性下降，并出現(xiàn)連續(xù)的自發(fā)抬足行為，不愿使用患肢，偶出現(xiàn)患肢的抽搐現(xiàn)象。ET-1注射30 min后，小鼠痛閾逐漸回升，持續(xù)到觀察期結(jié)束。在3 d的連續(xù)觀察中，每天藥物注射前后的小鼠表現(xiàn)和疼痛行為學(xué)指標(biāo)均類似，癌性爆發(fā)痛發(fā)生較快(5 min之內(nèi))，但疼痛持續(xù)時間較短(30 min之內(nèi))，以10 min為分界點(diǎn)痛閾呈現(xiàn)先降后升的趨勢，與臨床上癌性爆發(fā)痛患者的表現(xiàn)高度相似[15-16]，說明該癌性爆發(fā)痛優(yōu)化模型制備成功且可靠。

本研究通過模擬腫瘤內(nèi)的高水平ET-1刺激誘發(fā)癌性爆發(fā)痛，觀察測試了小鼠癌性爆發(fā)痛發(fā)作時劇烈的疼痛行為學(xué)表現(xiàn)。通過實(shí)驗(yàn)確定嗎啡和ET-1注射天數(shù)為3 d和每天注射次數(shù)為1次后，成功建立了與臨床患者表現(xiàn)相似的ET-1誘發(fā)型癌性爆發(fā)痛優(yōu)化模型，為后續(xù)癌性爆發(fā)痛的進(jìn)一步研究提供了穩(wěn)定可靠的模型平臺。