外用復方五鳳草液對結核性潰瘍患者MDM2、p53的影響

陳曉鈺，黃子慧，錢佳燕，孫佳玥，陳思琪，曹麗敏

（南京中醫(yī)藥大學附屬南京市中西醫(yī)結合醫(yī)院，江蘇 南京 210021）

結核性潰瘍是指結核分枝桿菌（MTB）經(jīng)各種傳播路徑侵犯機體局部組織，引起病灶周圍軟組織、皮下及皮膚的壞死，最終液化破潰所形成的創(chuàng)面［1-2］，是臨床最為常見的一種特異性感染性創(chuàng)面。春季為本病的高發(fā)季節(jié)，多見于年輕女性，臨床表現(xiàn)為創(chuàng)面化膿流水，易形成竇道，創(chuàng)面不易愈合或假性愈合后反復發(fā)作、破潰流膿［3］。該病治療頗為棘手，目前臨床多采用抗結核藥配合局部外用換藥的治療方案。復方五鳳草液是臨床應用較為成熟的外用中藥［4］，由南京市中西醫(yī)結合醫(yī)院瘰疬科黃子慧主任總結科室名老中醫(yī)治療本病幾十年經(jīng)驗所得，具有泄毒生新之功，臨床使用多年，療效顯著。本課題組前期已開展復方五鳳草液的相關機制研究，通過觀察M1、M2 型巨噬細胞的表型指標iNOS、Arg－1，發(fā)現(xiàn)復方五鳳草液能促進Arg－1 表達、抑制iNOS 的過度表達［5-6］。為進一步從巨噬細胞極化平衡角度探析復方五鳳草液的促愈合機制，課題組開展了對結核性潰瘍患者血清、組織中巨噬細胞調(diào)控因子MDM2、p53 的研究，研究結果如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象

研究對象為2020年1月1日—2020年12月31日期間經(jīng)南京中醫(yī)藥大學附屬南京市中西醫(yī)結合醫(yī)院通過病理學證實為結核性潰瘍患者76 例，隨機分為實驗組和對照組。其中實驗組中男性16 例，女性22 例，年齡20～75 歲；對照組中男性18 例，女性20 例，年齡19～73 歲。兩組患者性別分布及年齡分布經(jīng)統(tǒng)計學處理，差異均無統(tǒng)計學意義，具有可比性。

1.2 給藥

實驗組：基礎抗結核化學治療+ 復方五鳳草液（組成：五鳳草2 000 g，白及240 g，貓爪草400 g，由南京市中西醫(yī)結合醫(yī)院中藥制劑室提供），外用。

對照組：基礎抗結核化學治療+康復新液（四川好醫(yī)生攀西藥業(yè)有限責任公司，國藥準字Z51021834），外用。

基礎抗結核化學治療方案：3HREZ/9～15HRE 或3HRSZ/9～15HRE。

外用藥物使用方法：根據(jù)創(chuàng)面大小剪取適當面積無菌棉片，以復方五鳳草液或康復新液浸濕（注意以輕擠不滴水為宜）外敷，大致為0.5 mL/cm2，若有竇道則將棉片深入竇道內(nèi)，2 d換藥1次。共治療28 d。

1.3 主要試劑及儀器

MDM2 ELISA檢測試劑盒（JL45544）；人p53 ELISA 檢測試劑盒（JL12676）；TRIzolTM LS Reagent（Thermo Fisher Scientific，10296010）；PrimeScript?PT Master Mix（Perfect Real Time）試劑盒（Takara，RR036A）；ChamQ ?SYBR?qPCR Master Mix（Without ROX）試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司，Q321－02）；RIPA（放射免疫沉淀法）蛋白裂解液（Beyotime，Henan，China，P0013C）；BCA 試劑盒（碧云天生物技術有限公司，中國，P0010S）；MDM2 兔抗人單克隆抗體（Affinity Biosciences，OH，USA，AF0208）；p53兔抗人單克隆抗體（Affinity Biosciences，OH，USA，AF0879）；二抗（Affinity Biosciences，OH，USA，S0001）。

酶標儀（美國BioTek 儀器有限公司，Victor3 plate reader）；實時熒光定量PCR儀（羅氏，LightCycler 480）；37 ℃恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒，DHG－9031）；臺式高速冷凍離心機（Sigma，1－21K）。

1.4 方法

1.4.1 治療前及治療后第3、7、14、28 天的創(chuàng)面愈合率

通過掃描儀將創(chuàng)面情況錄入微型計算機，采用Osiris 4.19 軟件計算像素的方法進行創(chuàng)面面積計算。潰瘍原始創(chuàng)面面積為第一次測量的創(chuàng)面面積，時相點未愈合面積為各時相點取材時測量的面積［4］。

創(chuàng)面愈合率（%）=（原始創(chuàng)面面積－時相點未愈合面積）/原始創(chuàng)面面積×100%

1.4.2 創(chuàng)面腐去時間及上皮生長時間

創(chuàng)面腐去時間：從創(chuàng)面初始用藥到創(chuàng)面腐肉盡脫所需時間；上皮生長時間：從創(chuàng)面用藥起到新肉長出所需時間。如患者在治療結束后第28 天時仍有未完全脫盡的腐肉，則該患者的創(chuàng)面腐去時間按28 d計算。

1.4.3 ELISA 法檢測兩組患者血漿中MDM2、p53 蛋白表達情況

于受試者治療前及治療后第3、7、14、28 天分別取1 mL 的全血置于EDTA 抗凝管里，離心取得上層血漿樣本，根據(jù)ELISA試劑盒說明書中的要求進行實驗，根據(jù)標準曲線計算出各檢測標本中相應指標的含量。

1.4.4 RT－qPCR 法檢測兩組患者血漿中MDM2、p53 mRNA表達情況

于受試者治療前及治療后第3、7、14、28 天分別取1 mL的全血置于EDTA抗凝管里離心取上層血漿。提取并測定血漿RNA 濃度，根據(jù)試劑盒說明書加入所需試劑，逆轉錄合成cDNA。使用ChamQTMSYBR?qPCR Master Mix（Without ROX）試劑盒進行RT－PCR 反應，測定MDM2、p53 mRNA表達水平。

所有引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成，序列見表1。

表1 Real－time PCR檢測引物列表

1.4.5 Western Blot 法檢測兩組患者創(chuàng)面組織中MDM2、p53蛋白表達情況

于受試者治療前與治療后第28 天換藥時收集創(chuàng)面組織，從組織中提取總蛋白。BCA 法測定蛋白濃度后使蛋白變性；計算蛋白上樣量，SDS－PAGE 膠電泳后轉膜；封閉（脫色搖床，1 h）、敷一抗（4 ℃冰箱，脫色搖床，過夜）；洗去一抗，室溫條件下敷二抗（脫色搖床，1.5 h），再次洗膜，用化學發(fā)光法暴露膜上的蛋白帶。

1.5 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 23.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量數(shù)據(jù)采用均數(shù)± 標準差（xˉ±s）表示，以P< 0.05 代表差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者創(chuàng)面愈合率情況比較

隨著治療時間的增加，兩組創(chuàng)面均逐漸愈合，第14 天起愈合趨勢明顯。與治療后第7 天比較，兩組患者治療后第14、28 天的創(chuàng)面愈合率明顯升高（P<0.05）；與對照組比較，在治療后第28 天時，實驗組的創(chuàng)面愈合率明顯升高（P<0.05）。見表2。

表2 兩組患者創(chuàng)面愈合率變化比較（±s，%）

表2 兩組患者創(chuàng)面愈合率變化比較（±s，%）

注：與本組治療后第7天比較，*P<0.05；與對照組同一時間比較，#P<0.05。

組別實驗組對照組例數(shù)38 38第3天15.50±8.23 13.37±7.45第7天26.76±6.87 21.35±8.26第14天47.70±11.01*36.77±13.65*第28天90.17±7.38*#61.05±18.71*

2.2 兩組患者創(chuàng)面腐去時間及上皮生長時間

與對照組比較，實驗組的創(chuàng)面腐去時間及上皮生長時間均明顯縮短（P<0.05）。見表3。

表3 兩組患者創(chuàng)面腐去時間、上皮生長時間比較（±s，d）

注：與對照組比較，*P<0.05。

組別實驗組對照組例數(shù)38 38腐去時間19.67±3.07*25.34±5.38上皮生長時間12.34±4.23*17.76±6.28

2.3 ELISA 法檢測兩組患者治療前后血漿中MDM2、p53蛋白表達情況

組內(nèi)不同時間點比較，與治療前相比，第7、14、28 天時，實驗組與對照組血漿中MDM2 蛋白表達水平均升高（P< 0.05），p53 蛋白表達水平均降低（P<0.05）。組間同一時間點比較，治療前與治療后第3 天時，實驗組與對照組血漿中MDM2、p53 蛋白表達情況差異無統(tǒng)計學意義（P> 0.05）；第7、14、28 天時，與對照組相比，實驗組血漿中MDM2 蛋白表達水平明顯升高，p53 蛋白表達水平明顯降低（P< 0.05）。見表4。

表4 兩組患者血漿中MDM2、p53蛋白含量比較（±s，pg/mL）

表4 兩組患者血漿中MDM2、p53蛋白含量比較（±s，pg/mL）

注：與同組治療前比較，#P<0.05；與對照組同一時間點比較，*P<0.05。

組別實驗組對照組例數(shù)38 38時間治療前第3天第7天第14天第28天治療前第3天第7天第14天第28天MDM2 3.87±0.95 4.32±0.77 6.06±1.75#*8.24±1.50#*10.76±1.78#*3.73±0.79 4.02±0.89 5.05±1.11#6.38±1.16#7.58±1.17#p53 482.52±100.36 408.78±93.90 298.16±68.55#*206.38±22.88#*106.18±15.64#*461.53±104.56 440.54±78.89 389.07±89.44#296.03±59.41#184.46±54.08#

2.4 RT－qPCR 法檢測兩組患者治療前后血漿中MDM2、p53 mRNA表達情況比較

組內(nèi)不同時間點比較，與治療前相比，第7、14、28 天時，實驗組與對照組血漿中MDM2 mRNA 表達水平均升高（P< 0.05），p53 mRNA 表達水平均降低（P< 0.05）。治療前與治療后第3 天時，實驗組與對照組血漿中MDM2、p53 mRNA 表達情況差異無統(tǒng)計學意義（P> 0.05）；第7、14、28 天時，與對照組相比，實驗組血漿中MDM2 mRNA 表達水平明顯升高，p53 mRNA 表達水平明顯降低（P< 0.05）。見表5。

表5 兩組患者血漿中MDM2、p53 mRNA含量比較（±s，pg/mL）

表5 兩組患者血漿中MDM2、p53 mRNA含量比較（±s，pg/mL）

注：與同組治療前比較，#P<0.05；與對照組同一時間點比較，*P<0.05。

組別實驗組對照組例數(shù)38 38時間治療前第3天第7天第14天第28天治療前第3天第7天第14天第28天MDM2 0.21±0.06 0.30±0.03 1.00±0.21#*1.35±0.24#*1.80±0.21#*0.22±0.04 0.26±0.04 0.44±0.06#0.65±0.08#1.12±0.05#p53 2.09±0.28 1.92±0.26 1.19±0.29#*0.60±0.11#*0.13±0.03#*2.16±0.25 2.00±0.30 1.63±0.28#0.85±0.22#0.38±0.08#

2.5 兩組患者治療前后創(chuàng)面組織中MDM2、p53 蛋白表達情況比較

與治療前相比，兩組患者治療后創(chuàng)面組織中MDM2 蛋白表達水平均升高，p53 蛋白表達水平均降低；與對照組相比，實驗組創(chuàng)面組織中MDM2、p53蛋白表達改善更明顯。見圖1。

圖1 兩組患者創(chuàng)面組織中MDM2、p53蛋白表達情況

3 討論

結核性潰瘍屬于臨床常見的肺外結核，在2018年世界衛(wèi)生組織確認的630 萬新發(fā)結核病例中，肺外結核約占16%［7］，而結核性潰瘍占全部肺外結核的30%～40%［8-9］，其構成比遠高于糖尿病足及壓瘡的發(fā)生率［10］。作為一種臨床最為常見的特異性感染性創(chuàng)面，其治療歷來屬外科難題。在慢性創(chuàng)面的修復中，中醫(yī)藥治療具有明顯優(yōu)勢。中醫(yī)學認為，在該病發(fā)生、發(fā)展的過程中，癆瘥毒邪入侵和機體正氣虧虛二者共同作用，互為因果。癆瘥毒邪熾盛，滯于肌表，導致氣滯血瘀，日久肉腐成膿，進而潰破；脾胃虛弱，氣血虧虛，無力托毒外出，創(chuàng)面破潰難斂；創(chuàng)面日久不斂則致虛損進一步加重，導致惡性循環(huán)，令本病遷延難愈［6］。

復方五鳳草液為名老中醫(yī)驗方，在多年的臨床實踐中取得穩(wěn)定療效。方中重用五鳳草行水殺蟲，祛腐泄毒；白及斂瘡消腫，生肌止血；貓爪草拔膿解毒，活血生新，共奏泄毒祛腐，生新活血之功效。課題組既往研究結果表明該藥物的作用機制可能與調(diào)控巨噬細胞極化失衡有關［5］。

目前已知在參與慢性創(chuàng)面修復的眾多細胞中，巨噬細胞起到了總指揮的作用［11］。不同的微環(huán)境下巨噬細胞可極化為M1和M2兩種不同類型［12］，M1型主要參與炎癥產(chǎn)生的起始和維持過程，通常出現(xiàn)在創(chuàng)面愈合的早期；M2 型在組織修復［13］、促進創(chuàng)面細胞增殖和血管化的形成中起到重要作用，M1 向M2 型轉換是創(chuàng)面由炎癥反應轉為修復性反應的關鍵［14］。有研究表明，在TU 創(chuàng)面組織液化高峰期，創(chuàng)面組織中M1 型巨噬細胞顯著高于M2 型，即M1 型募集、M2 型損耗的混合極化狀態(tài)［15］。

在調(diào)節(jié)巨噬細胞極化的諸多通路中，PI3K/AKt 信號轉導通路是許多重要細胞功能信號傳遞的中心，包括細胞黏附、遷移和血管生成［16-18］，其中調(diào)控因子MDM2、p53 與創(chuàng)面愈合聯(lián)系密切。THOMASOVA 等［19］發(fā)現(xiàn)，MDM2 阻斷抑制了缺血后促炎細胞因子和趨化因子的誘導，阻礙了白細胞向損傷部位的募集。ANKE 等［20］的研究結果表明，p53 能夠激活親氧化劑，促進自噬和抗氧化反應［21］，調(diào)節(jié)細胞修復、衰老、DNA損傷識別、增殖和遷移［22］，進而刺激皮膚中的核相關因子2（Nrf2）途徑，導致谷胱甘肽含量增加，從而提高皮膚愈合的質(zhì)量［23-24］。

本次研究通過設立藥物對照組，動態(tài)觀察結核性潰瘍患者血漿、組織中巨噬細胞PI3K/AKt 信號轉導通路中兩個重要調(diào)控因子MDM2、p53 的表達水平，進一步探析復方五鳳草液的作用機制。結果顯示，隨著治療進展，兩組創(chuàng)面都呈現(xiàn)逐漸愈合的趨勢，實驗組愈合率明顯高于對照組，腐去時間與上皮生長時間均明顯短于對照組。在治療初期，兩組患者血漿中MDM2、p53蛋白及mRNA 表達水平無明顯差異；自治療第7天起，隨著創(chuàng)面愈合率的增加，MDM2蛋白及mRNA 表達逐漸升高、p53 蛋白及mRNA 表達逐漸降低，較之前相比均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；組間同時間比較，與對照組相比，第7、14、28天時實驗組MDM2蛋白及mRNA 表達水平明顯升高（P< 0.05），p53 蛋白及mRNA 表達水平明顯降低（P< 0.05）。通過Western Blot 法驗證兩組患者潰瘍組織中MDM2、p53 蛋白表達水平，結果治療前兩組患者創(chuàng)面組織中MDM2、p53 蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義，治療后均可見MDM2蛋白水平升高、p53 蛋白水平降低，且實驗組的改善情況優(yōu)于對照組，得出血漿與組織中MDM2、p53 同步變化這一結論。

本研究通過在體實驗觀察了復方五鳳草液對結核性潰瘍患者MDM2、p53 表達情況的影響，結果復方五鳳草液顯著促進了結核性潰瘍的愈合，隨治療時間的增加，創(chuàng)面腐肉日漸脫落，血漿與創(chuàng)面組織中p53 表達逐漸降低；上皮逐步生長，MDM2表達逐漸提高。由此我們推測結核性潰瘍創(chuàng)面愈合緩慢可能與MDM2－p53 表達失衡、巨噬細胞M1/M2 極化失衡有關，而復方五鳳草液促進結核性潰瘍創(chuàng)面愈合可能是通過上調(diào)MDM2 表達、下調(diào)p53 表達，進而平衡M1/M2 來實現(xiàn)的。此次實驗尚有不足之處，并未有數(shù)據(jù)直接證明MDM2、p53 之間具體的調(diào)控關系，此后課題組將繼續(xù)開展細胞及動物實驗，多角度深入闡明結核性潰瘍的發(fā)病機制以及復方五鳳草液促進創(chuàng)面愈合的可能作用機制。