太子參白絹病病原菌的分離鑒定及生防菌篩選

陳燕萍，肖榮鳳，金 國(guó)，陳梅春，鄭雪芳，朱育菁，劉 波 ，王階平

（1. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所，福建 福州 350003；2. 福建省寧德市柘榮縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，福建 柘榮 355300）

0 引言

【研究意義】太子參Pseudostellaria heterophylla為石竹科藥食兩用植物，具有健脾益肺等功效，是常用補(bǔ)虛藥，也是很有發(fā)展?jié)摿Φ慕?jīng)濟(jì)作物，主產(chǎn)于我國(guó)福建、貴州、安徽等地[1-2]。隨著太子參種植面積的不斷擴(kuò)大，其相應(yīng)的連作障礙也日趨嚴(yán)重，太子參白絹病土傳病害正在逐漸擴(kuò)展蔓延。該病發(fā)病周期長(zhǎng)，從太子參塊根膨大期到收獲、留種期，塊根和莖基部均可發(fā)病，可造成20%以上的產(chǎn)量損失甚至絕收[3]。通過對(duì)太子參白絹病病原菌的鑒定及生防菌的篩選，可為該病的科學(xué)防控提供依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】關(guān)于太子參白絹病的報(bào)道主要集中在田間發(fā)病規(guī)律的調(diào)查，發(fā)病癥狀、病原菌形態(tài)及田間化學(xué)防治的研究[3-5]?，F(xiàn)有的防控主要以農(nóng)業(yè)防治和化學(xué)防治為主，但傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)防治措施受限因素多、成本高，化學(xué)農(nóng)藥又存在農(nóng)藥殘留、污染環(huán)境等問題，生物農(nóng)藥因其生物安全、毒副作用小、對(duì)環(huán)境友好等特點(diǎn)，備受人們青睞[6-7]。近幾年，ITS、LSU、TEF-1α序列常被用于進(jìn)行真菌鑒定，因其可較好地反映真菌的遺傳多樣性的特點(diǎn)，為病原菌的快速、準(zhǔn)確鑒定提供便利。ITS作為內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，LSU為核糖體大亞基序列，TEF-1α為翻譯延伸因子序列，適合屬及屬下水平的分子分類研究[8-11]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】?jī)H依靠田間發(fā)病癥狀及病原菌形態(tài)特征難以對(duì)病原菌進(jìn)行準(zhǔn)確的分類鑒定，聯(lián)合多基因分子鑒定對(duì)太子參白絹病病原菌進(jìn)行全面系統(tǒng)的鑒定及篩選對(duì)該病原菌具有良好防治效果的生防菌，有待深入探討?！緮M解決的關(guān)鍵問題】筆者發(fā)現(xiàn)在福建省柘榮縣太子參種植田塊的白絹病病害嚴(yán)重，因此，對(duì)當(dāng)?shù)卦摬『M(jìn)行了全面調(diào)查取樣和病害診斷，對(duì)引起該病害的病原菌通過形態(tài)學(xué)、聯(lián)合多基因分子鑒定和致病性測(cè)定進(jìn)行病原菌鑒定，明確引起福建太子參白絹病的病原菌。篩選獲得對(duì)該病原菌具有良好防治效果的生防菌，采用生物防治替代太子參種植過程的化學(xué)防治，解決中藥的農(nóng)藥殘留問題，為太子參白絹病的防控及太子參產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病害采樣與癥狀觀察

在福建省柘榮縣（119.89 E，27.25 N）太子參不同種植區(qū)，調(diào)查白絹病在苗期與商品參采收期的田間發(fā)生情況，記錄病害典型癥狀，并采集代表性樣品用于病原菌分離鑒定。

1.2 病原菌的分離與形態(tài)學(xué)鑒定

采用組織分離法對(duì)病原菌進(jìn)行分離。采集不同時(shí)間的田間發(fā)病植株的根莖部和塊根，取病健交界處切取大小為5 mm×3 mm，厚度為1 mm的病組織，分別切取 30～50 塊病組織。病組織經(jīng)75%酒精處理2～5 s，1%次氯酸鈉處理5～8 min，無菌水清洗3遍后置于滅菌濾紙上吸干水分，將病組織置于含200 μg·mL-1硫酸鏈霉素的PDA培養(yǎng)基上，每皿放5片，28±2 ℃培養(yǎng)。從分離的培養(yǎng)物中隨機(jī)挑選10個(gè)組織塊上的分離物純化培養(yǎng)，觀察不同培養(yǎng)時(shí)期的菌落形態(tài)，并利用顯微鏡觀察菌絲的形態(tài)，于-80 ℃甘油冷凍保存。

1.3 病原菌的分子鑒定

取培養(yǎng)7 d的菌絲體參照真菌基因組DNA提取試劑盒方法提取總DNA。利用rDNA-ITS、rDNALSU和TEF-1α等基因進(jìn)行序列比對(duì)。引物和PCR反應(yīng)體系如下[12-13]：ITS1/ITS4（ITS1：5′-TCCGTAGGT GAACCTGCGG-3′，ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATAT GC-3′），PCR反應(yīng)體系（25 μL）：12 μL 2× EasyTaqPCR SuperMix，引物各1 μmol·L-1，DNA模板1 μL，ddH2O 10 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。LROR/LR5（LROR：5′-ACCCGCTGAACTTAAGC-3′，LR5：5′-TCCTGAGGGAAACTTCG-3′），PCR反 應(yīng) 體 系（25 μL）：12 μL 2× EasyTaqPCR SuperMix，引 物各2.5 μmol·L-1，DNA模板2 μL，ddH2O 6 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延 伸10 min。ef595f/ef1160r（ef595f：5′-CGTGACTTCATCAAGAACATG-3′，ef1160r：5′-CCGATCTTGTAGACGTCCTG-3′），PCR反應(yīng)體系（25 μL）：12 μL 2× EasyTaqPCR SuperMix，引 物各1 μmol·L-1，DNA模板1 μL，ddH2O 10 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸45 s，共32個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送交鉑尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行純化測(cè)序。測(cè)得序列上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，并下載相關(guān)菌株的參比序列，采用軟件MEGA 6.0，利用Maximum Composite Likelihood法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrap 1000次重復(fù)。

1.4 病原菌的致病性測(cè)定

隨機(jī)挑取兩株編號(hào)為FJAT-32609和FJAT-32610代表菌株，根據(jù)柯赫氏法則進(jìn)行分離物的回接測(cè)定。將柘參2號(hào)種參播種于裝有高壓滅菌栽培基質(zhì)土的盆缽中，置于20～25 ℃的溫室大棚培育40～50 d，分別于太子參植株地上部株高約為10～15 cm時(shí)進(jìn)行澆灌接種試驗(yàn)和收獲期時(shí)進(jìn)行塊根接種試驗(yàn)。

根莖灌溉接種：將FJAT-32609和FJAT-32610菌擴(kuò)大培養(yǎng)后分別配置成1.0×107CFU·mL-1的孢子懸浮液，采用傷根澆灌接菌法，每株澆灌50 mL菌液，以清水處理為對(duì)照，每組處理分別接種30株太子參苗，接種后的植株于28±2 ℃、相對(duì)濕度80%的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察太子參苗的發(fā)病情況。根據(jù)柯赫氏法則重新分離各處理組的植株，并進(jìn)行分離物的鑒定驗(yàn)證。

塊根接種：新鮮塊根用清水沖洗干凈后，經(jīng)75%酒精表面消毒后，置于超凈臺(tái)中吹干備用。在無菌操作下，用無菌槍頭在塊根中上部戳一個(gè)深約1 mm傷口，分別挑取少量FJAT-32609和FJAT-32610菌絲置于傷口中，以接無菌水為對(duì)照，每個(gè)處理接種50根。接種后塊根置于鋪有無菌濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，上蓋一層無菌濕潤(rùn)濾紙后置于溫度28±2 ℃，濕度70%～80%的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d后去除上層濾紙，接著培養(yǎng)，逐日觀察侵染情況。根據(jù)柯赫氏法則重新分離各處理組樣品，并對(duì)分離物進(jìn)行鑒定。

1.5 生防芽胞桿菌的篩選

以太子參白絹病病原菌FJAT-32609為靶標(biāo)菌，采用平板對(duì)峙法篩選有效的生防菌。在PDA平板中央接種生長(zhǎng)5 d 的FJAT-32609菌餅，距離菌餅2.0 cm處，接種環(huán)蘸取芽胞桿菌發(fā)酵液進(jìn)行劃線，置于28 ℃培養(yǎng)6 d，觀察菌落生長(zhǎng)狀況，重復(fù)3次，以無菌水為對(duì)照。根據(jù)抑菌帶寬度測(cè)定抑菌率，抑菌率/%＝[（對(duì)照組菌落直徑－處理組菌落直徑）/對(duì)照組菌落直徑]×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害采樣與癥狀觀察

太子參發(fā)病前期，植株地上部根部周圍的土壤表面呈現(xiàn)白色菌絲，莖基部皮層腐爛，植株萎蔫，在潮濕環(huán)境下該病害尤為嚴(yán)重（圖1-A）。發(fā)病中期根塊及土表密生大量白色絹狀菌絲，菌絲體呈輻射狀擴(kuò)展，環(huán)繞整個(gè)塊根（圖1-B），發(fā)病后期在塊根或土壤表層形成菌核，菌核初為白色、漸變?yōu)槊S色至棕褐色，最終塊根完全腐爛（圖1-C、D）。

圖1 太子參白絹病田間發(fā)病癥狀Fig. 1 Disease symptoms of southern blight on P. heterophylla in the field

2.2 病原菌的分離與形態(tài)學(xué)鑒定

經(jīng)單孢分離，挑取有代表性的10個(gè)菌株進(jìn)行-80 ℃冷凍保存。所分離的菌株在PDA培養(yǎng)基上28 ℃下培養(yǎng)3 d時(shí)，菌落呈圓形，菌絲為白色羽毛狀，生長(zhǎng)速度快，向周圍呈輻射狀擴(kuò)展，菌絲疏松或集結(jié)成線形緊貼于培養(yǎng)表面（圖2-A）；培養(yǎng)5～6 d后，菌落表面開始出現(xiàn)白色菌核，老熟后變成黃色至褐色，菌核為球形或不規(guī)則形，表面光滑有光澤，直徑為0.5～1.0 mm（圖2-B）；菌落背面呈淡淺黃色，菌絲呈線形輻射狀分布（圖2-C）；顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)菌絲無色，棍棒狀，有明顯隔膜和分枝，未見孢子（圖2-D）。根據(jù)形態(tài)特征初步鑒定該病原菌為羅耳阿太菌Athelia rolfsii。

圖2 太子參白絹病病原菌的形態(tài)特征Fig. 2 Morphology of southern blight pathogen

2.3 病原菌的分子鑒定

兩株供試菌株FJAT-32609和FJAT-32610的rDNA-ITS、rDNA-LSU、TEF-1α基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，均與羅耳阿太菌A.rolfsii相似度達(dá)99%以上，并通過MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行分析。ITS序列聚類結(jié)果顯示，供試菌株 與A. rolfsii（登 錄 號(hào) 分 別 為AB075288.1、MN380242.1、KY446385.1）處于系統(tǒng)發(fā)育樹的同一分支，置信度為100%（圖3-A）；LSU序列聚類結(jié)果顯示，供試菌株與A. rolfsii（登錄號(hào)分別為MT012705.1、AY635773.1、MT225781.1）處于系統(tǒng)發(fā)育樹的同一分支，置信度為99%（圖3-B）；TEF-1α序列聚類結(jié)果顯示，供試菌株與A. rolfsii（登錄號(hào)分別為JF267815.1、JN790645.1、MT509439.1）處于系統(tǒng)發(fā)育樹的同一分支，置信度為98%（圖3-C）。因此，基于ITS、LSU和TEF-1α序列的系統(tǒng)發(fā)育樹分析，F(xiàn)JAT-32609和FJAT-32610均與羅耳阿太菌具極高的置信度，故將該病原菌鑒定為羅耳阿太菌A.rolfsii。

圖3 病原菌系統(tǒng)發(fā)育分析Fig. 3 Phylogenetic trees of pathogen

2.4 病原菌的致病性測(cè)定

將白絹病病原菌FJAT-32609和FJAT-31610分別接種太子參幼苗后6 d，植株根部及土壤表面出現(xiàn)白色絹狀菌絲（圖4-A），莖基部表皮呈現(xiàn)水漬狀褐變，后逐漸腐爛、斷裂（圖4-B），地上部分葉片出現(xiàn)輕微萎蔫，隨著病情發(fā)展，病株萎蔫加重至整株死亡（圖4-C）。重新分離回接的樣品，獲得的純培養(yǎng)物經(jīng)鑒定與所接種供試菌株一致。

圖4 接種太子參白絹病病原菌后太子參植株的發(fā)病癥狀Fig. 4 Disease symptoms on P. heterophylla plants artificially inoculated with isolated pathogen

太子參白絹病病原菌FJAT-31609和FJAT-31610分別接種太子參新鮮塊根后第7 天時(shí)，塊根表皮會(huì)有白色放射狀菌絲出現(xiàn)（圖5-A），塊根參頭部?jī)?nèi)部開始出現(xiàn)腐爛（圖5-B）；隨后塊根表面白色絹絲狀菌絲不斷蔓延包裹參塊，并集結(jié)形成白色菌核（圖5-C、E），參內(nèi)部腐爛面積逐漸擴(kuò)大，組織不斷消解（圖5-D、F）；發(fā)病后期塊根表面菌核由白色變?yōu)楹稚▓D5-G），參內(nèi)部組織也逐漸消解至剩下表皮（圖5-H）。兩株菌株的發(fā)病率均為100%，且發(fā)病癥狀與田間癥狀相似，無菌水對(duì)照組不發(fā)?。▓D5-I、J）。同上，重新分離回接的樣品并鑒定，致病性測(cè)定結(jié)果符合柯赫氏法則，證實(shí)了供試的兩株羅耳阿太菌菌株為太子參白絹病的病原菌。

圖5 菌株FJAT-32609和FJAT-31609接種太子參塊根后，不同時(shí)間的發(fā)病癥狀Fig. 5 Disease symptoms on tubers of P. heterophylla plants artificially inoculated with isolated pathogen

2.5 生防芽胞桿菌的篩選

以太子參白絹病病原菌為靶標(biāo)菌，采用平板對(duì)峙法對(duì)實(shí)驗(yàn)室已有的6株芽胞桿菌進(jìn)行抑菌活性篩選，篩選獲得具有明顯抑菌活性的生防菌4株（表1），其中貝萊斯芽胞桿菌FJAT-17931的抑菌率最高，為73.23%，其次為暹羅芽胞桿菌FJAT-52595，抑菌率為71.16%。因此，后續(xù)可選用這兩株芽胞桿菌為太子參白絹病生防菌，進(jìn)一步展開相關(guān)研究。

表1 不同芽胞桿菌對(duì)太子參白絹病病原菌的抑菌率Table 1 Inhibition rates of Bacillus spp. on A. rolfsii

3 討論與結(jié)論

白絹病是一種寄主范圍廣、毀滅性強(qiáng)的真菌病害，可危害100多科中的200多種植物。以茄科、豆科、葫蘆科等植物尤甚。我國(guó)傳統(tǒng)藥用植物受白絹病危害者也很多，如白術(shù)、鐵皮石斛、玄參 、太子參等[3,14-16]。前人研究報(bào)道太子參白絹病病原菌為小菌核菌屬SclerotiumTodeexFr.齊整小核菌Sclerotium rolfsiiSacc.，該名為其無性世代名稱，其另一有性世代名為羅耳阿太菌，兩者同物異名[17]。本研究通過太子參田間發(fā)病癥狀、病原菌形態(tài)特性及聯(lián)合ITS、LSU、LEF-1α多基因分子鑒定表明，福建柘榮太子參白絹病病原菌為羅耳阿太菌（A. rolfsii），與前人研究報(bào)道一致[18]。因不同的菌株間存在高度的多樣性，為避免單一基因序列測(cè)定產(chǎn)生的誤差，本研究聯(lián)合3種基因序列進(jìn)行分子鑒定。這3種基因序列應(yīng)用于白絹病原菌的分子鑒定上均已有報(bào)道：如半夏、檳榔和金錢樹等白絹病原菌的鑒定報(bào)道中，均以ITS序列進(jìn)行鑒定[19-21]；在柳葉白前和菊花白絹病原菌鑒定報(bào)道中，以ITS和TEF-1α聯(lián)合進(jìn)行鑒定[13,22]；同時(shí)，見Xu等用LSU序列進(jìn)行8種植物病原菌菌核（包括Athelia屬）的系統(tǒng)發(fā)育分析研究，證實(shí)其具有很好的特異性[23]。

白絹病主要危害太子參的塊根與莖基部，溫暖潮濕的4～7月為發(fā)病高峰期。該病原菌適應(yīng)性強(qiáng)，當(dāng)環(huán)境不利于菌絲生長(zhǎng)時(shí)會(huì)生成菌核渡過，便于長(zhǎng)期在土壤中存活，條件成熟時(shí)引起太子參發(fā)病[18]。因此，及時(shí)清除病株，冬季翻田清園，選用無病種參，開展種參消毒等防控措施很重要[4]。目前對(duì)于太子參白絹病的防治主要以化學(xué)防治為主，常用有多菌靈、惡霉靈、吡唑嘧菌脂懸浮劑等，生物防治報(bào)道僅見劉思睿篩選的鉤狀木霉Trichoderma hamatum對(duì)其病原菌具良好抑菌作用[24]，其他作物的白絹病生防報(bào)道亦甚少，已報(bào)道的生防菌均以木霉菌和芽胞桿菌為主[25-26]。本研究篩選獲得貝萊斯芽胞桿菌對(duì)太子參白絹病病原菌抑菌率為73.23%，在太子參白絹病上有強(qiáng)大生防應(yīng)用潛能，關(guān)于該菌的拮抗機(jī)理、室內(nèi)及大田防效等還有待進(jìn)一步研究。