高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定河蟹肝胰腺組織中林可酰胺類抗生素殘留

邱稀木，朱曉華，邊文冀，王淑芳，孟 勇

[1. 江蘇海洋大學(xué)海洋科學(xué)與水產(chǎn)學(xué)院，江蘇 連云港 222005；2. 江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京 210017；3. 江蘇省水產(chǎn)質(zhì)量檢測(cè)中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（南京），江蘇 南京 210017]

0 引言

【研究意義】林可酰胺（Lincosamide）類抗生素主要有林可霉素（Lincomycin）、克林霉素（Clindamycin）、吡利霉素（Pirlimycin），能抑制細(xì)菌的蛋白質(zhì)合成，對(duì)大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌和一些厭氧革蘭氏陰性菌有抗菌作用[1-2]。林可酰胺類抗生素主要運(yùn)用于臨床和畜禽養(yǎng)殖上，根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部印發(fā)的《水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥明白紙2020年1、2號(hào)》，林可酰胺類抗生素藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的運(yùn)用目前還沒(méi)有明確的指導(dǎo)屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖的非規(guī)范用藥。近年來(lái)，在漁用投入品的風(fēng)險(xiǎn)篩查中，在某些改水類產(chǎn)品中檢測(cè)到林可酰胺類抗生素藥物成分，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖帶來(lái)了一定的風(fēng)險(xiǎn)隱患?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，關(guān)于林可酰胺類藥物殘留的檢測(cè)方法比較多，如液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蜂蜜中的林可酰胺類獸藥殘留[3]、酶聯(lián)免疫分析方法測(cè)定牛肉雞肉豬肉魚(yú)肉中的林可酰胺類抗生素[4]、高效液相色譜法對(duì)林可霉素含量的測(cè)定[5]、林可霉素的磁免疫化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用[6]等，但在河蟹樣品中林可酰胺類藥物的檢測(cè)方法還未見(jiàn)報(bào)道。其中，液相色譜法以保留時(shí)間作為定性標(biāo)準(zhǔn)，比較容易產(chǎn)生假陽(yáng)性的結(jié)果，而且靈敏度不高[7]；化學(xué)發(fā)光法需要柱后衍生，操作的過(guò)程較為繁瑣，時(shí)間和人工成本高[7]。且河蟹的肝胰腺樣品油脂成分高存在基質(zhì)效應(yīng)，基質(zhì)常常對(duì)分析物的分析過(guò)程有顯著的干擾，并影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，所以對(duì)樣品提取和凈化的方法要求會(huì)較高[8]。【本研究切入點(diǎn)】固相萃?。⊿PE小柱）主要用于從各類復(fù)雜的基質(zhì)提取出想得到的分析物，例如生物體（血液和尿液）、水樣[9]、土壤、藥材[10]中提取目標(biāo)分析物，達(dá)到濃縮或純化的目的。本研究將固相萃取小柱用于河蟹肝胰腺樣品的前處理，以期達(dá)到更好的提取和凈化效果，降低其他復(fù)雜基質(zhì)對(duì)樣品提取的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究以3種林可酰胺類抗生素（林可霉素、克林霉素、吡利霉素）為檢測(cè)對(duì)象，將SPE固相萃取柱應(yīng)用于河蟹的獸藥殘留檢測(cè)前處理，以期建立河蟹中林可酰胺類抗生素獸藥殘留的快速檢測(cè)方法，對(duì)河蟹質(zhì)量安全管控具有積極的意義。

1 材料與方法

1.1 儀器和試材料

1.1.1 儀器 QTRAP 4500三重四極桿（美國(guó)SCIEX公司，配備電噴霧離子源）；實(shí)驗(yàn)室用水（Millipore系統(tǒng)超純水）；漩渦振蕩器（北京佳源興業(yè)公司）；Allegra TM 離心機(jī)（美國(guó)Beckman公司）；Turbo Vap濃縮工作站（瑞典Biotage公司）。

1.1.2 材料 甲醇、乙腈（色譜純，德國(guó)Merck公司）；甲酸（色譜純，美國(guó)ROE公司）；有機(jī)濾膜（0.22 μm，天津津騰有限公司）；OASIS?HLB 6 ：500（mL：mg）固相萃取柱；3種林可酰胺類抗生素標(biāo)準(zhǔn)品（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科學(xué)研究監(jiān)測(cè)所，100 μg·mL-1）；河蟹樣品（從南京各農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)隨機(jī)抽樣）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱取5.0 mL林可酰胺、克林霉素和吡利霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別轉(zhuǎn)移至同一50.0 mL容量瓶中，用乙腈作為稀釋劑溶解并稀釋至一定體積。進(jìn)一步將5.0 mL該溶液轉(zhuǎn)移至50.0 mL容量瓶中，用乙腈稀釋劑稀釋至一定體積。

1.3 樣品的提取和凈化

1.3.1 樣品提取 進(jìn)行以下步驟：（1）將5 g河蟹樣品（蟹肉和蟹黃混合）稱量到離心管中；（2）加入配置好的2%甲酸乙腈15 mL；（3）使用漩渦振蕩器渦旋5分鐘使提取劑與樣品充分溶解；（4）將每管樣品在4 ℃下以9000 r·min-1的速度離心10 min；（5）離心后的上清液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)50 mL離心管中；（6）殘留物用10 mL提取液再次提取，合并上清液。（7）溶液中加入5 mL正己烷，渦旋振蕩30 s，9000 r·min-1的速度離心5 min，棄去 上層正己烷，再加入5 mL正己烷重復(fù)操作一次。下層溶液待凈化。

1.3.2 樣品凈化 SPE小柱依次用6 ml甲醇和6 ml超純水以3 mL·min-1的流速進(jìn)行預(yù)處理。將上清液（10 mL）以1 mL·min-1的速度通過(guò)固相萃取柱，棄流出液。10 mL超純水沖洗柱子，棄流出液，抽真空10 min。5 mL甲醇沖洗柱子洗脫。在40 ℃的條件下，洗脫液用氮吹儀吹至完全干，氮吹干后的殘留物加入1.00 mL 0.1%甲酸水-甲醇（9∶1）混合溶液，2分鐘渦旋使其充分混合，用針管吸取混合溶液，將溶液通過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，置入棕色樣品瓶中，待上機(jī)。

1.4 色譜和質(zhì)譜分析條件

1.4.1 液相色譜條件 色譜柱：InfinityLab poroshell 120 SB-C18，（100 mm×2.7 mm，2.7 μm）；A相為0.1%甲酸水溶液，B相為甲醇；柱溫：30 ℃；樣品量：10 μL；流速：0.40 mL·min-1；梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Table 1 Procedures of mobile phase gradient elution

1.4.2 質(zhì)譜分析條件 質(zhì)譜的電離模式為電噴霧離子源（ESI+模式）；輔助加熱氣體流量：50 L·min-1；霧化氣體流量：50 L·min-1；離子源的溫度為550 ℃；氣簾氣流量：35 L·min-1；噴霧電壓設(shè)置為5500 V。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑優(yōu)化

林可酰胺類抗生素極性較強(qiáng)，容易溶于極性溶劑[2,11]。因此，比較了磷酸鹽緩沖液、乙腈、乙酸乙酯和丙酮的萃取效率。結(jié)果表明，磷酸鹽緩沖液含水量高，不利于后續(xù)的濃縮，溶解的蛋白易導(dǎo)致過(guò)SPE柱時(shí)堵塞；乙酸乙酯作為萃取溶劑時(shí)，乳化現(xiàn)象嚴(yán)重，回收率很低；丙酮用作提取溶劑時(shí)揮發(fā)性很高，直接注入可能會(huì)破壞管道和質(zhì)譜組件[3]。乙腈是極性較強(qiáng)的有機(jī)溶劑，具有沉淀蛋白質(zhì)的作用，各指標(biāo)的回收率優(yōu)于其他提取劑。因此，本試驗(yàn)選擇乙腈為提取溶劑。此外，分別以純乙腈、1%甲酸乙腈、2%甲酸乙腈、1%氨水乙腈、2%氨水乙腈作為提取液，考察其對(duì)3種林可酰胺類目標(biāo)物的提取效果。結(jié)果顯示，相比其他組，2%甲酸乙腈作為提取溶劑時(shí)的平均回收率最高，3種林可酰胺類藥物的回收率為76.9%～102%，滿足期望結(jié)果回收率在75%以上。因此，本試驗(yàn)提取樣品采用2%甲酸乙腈進(jìn)行試驗(yàn)。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

利用InfinityLab poroshell 120 SB-C18（100 mm×2.7 mm，2.7 μm）色譜柱在ESI+模式下，比較了在乙腈-水或甲醇-水流動(dòng)相系統(tǒng)中3種林可酰胺類藥物的色譜結(jié)果。試驗(yàn)結(jié)果是：甲醇-水流動(dòng)相中3個(gè)目標(biāo)的峰值形狀和響應(yīng)優(yōu)于乙腈-水，且洗脫時(shí)間短，所以選擇了甲醇-水流動(dòng)相系統(tǒng)。

通過(guò)在流動(dòng)相中加入適量的揮發(fā)性鹽或酸可以提高目標(biāo)物的反應(yīng)值、分辨率和峰形[12-13]。因此，在水相中添加甲酸或乙酸銨對(duì)流動(dòng)相系統(tǒng)做進(jìn)一步優(yōu)化。離子化后3種目標(biāo)化合物主要以[M+H]+的形式存在[14-15]。結(jié)果是，在水相中添加醋酸銨降低了各目標(biāo)化合物的響應(yīng)值[16-18]；在水相中加入甲酸后，各目標(biāo)化合物的質(zhì)譜響應(yīng)提高了10%，且添加0.1%甲酸時(shí)效果最佳。因此本試驗(yàn)使用0.1%甲酸水-甲醇作為流動(dòng)相。

2.3 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

將50 μg·L-1待測(cè)林可酰胺標(biāo)準(zhǔn)混合溶液用針型泵注入質(zhì)譜儀，分別用電噴霧正電離模式和電噴霧負(fù)電離模式對(duì)藥物的母離子全掃描進(jìn)行比較并優(yōu)化了碰撞能量和去簇電壓。分析結(jié)果表明，在電噴霧正電離模式下，3種測(cè)試對(duì)象的離子信號(hào)穩(wěn)定，響應(yīng)速度快，因此選擇電噴霧正電離掃描模式。在這種模式下，所有3種化合物都產(chǎn)生了[M+H]+的母離子。進(jìn)一步掃描生成的子離子，選擇豐度最高的2個(gè)子離子進(jìn)行定性和定量分析?？疾炝藝婌F電壓分別為：4500V、5000 V、5500 V時(shí)，3種標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子化效率，結(jié)果為5500 V時(shí)的離子化效率最高。目標(biāo)化合物的質(zhì)譜分析條件見(jiàn)表2。3種林可酰胺類抗生素藥物的總離子流圖見(jiàn)圖1。

圖1 質(zhì)量濃度為50 ng·L-1的 3 種林可酰胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of 50 ng·L-1standard solutions of 3 lincosamide antibiotics

表2 林可酰胺類藥物測(cè)定的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass spectrometric parameters for lincosamide antibiotics determination

2.4 SPE小柱對(duì)蟹黃的凈化效果

河蟹的肝胰腺富含碳水化合物、氨基酸、有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、膠原蛋白、維生素A、不飽和脂肪酸等，這會(huì)影響目標(biāo)化合物的測(cè)定，并污染離子源[19-21]。因此，本試驗(yàn)考察了在河蟹肝胰腺樣品提取中，固相萃取柱對(duì)3種林可酰胺類藥物的凈化效果和回收率。試驗(yàn)分析了6種SPE小柱的凈化效果（圖2），其中OASIS?HLB 6 mL/500 mg SPE柱組的凈化結(jié)果最好。使用該型號(hào)SPE小柱，3種林可酰胺類藥物的回收率在80%以上，平均回收率是84.6%，明顯好于其他固相萃取柱組。因此，本方法最終選擇型號(hào)為OASIS?HLB 6 mL/500 mg的 SPE柱來(lái)凈化河蟹肝胰腺樣品。

圖2 不同固相萃取柱對(duì)目標(biāo)物回收率的影響Fig. 2 Recovery rates on 3 antibiotics by various SPE columns

2.5 基質(zhì)效應(yīng)的考察

電噴霧離子源在電離時(shí)候，樣品中的基質(zhì)和目標(biāo)化合物具有競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，這種現(xiàn)象為基質(zhì)強(qiáng)化效應(yīng)或基質(zhì)抑制效應(yīng)[22-24]。本試驗(yàn)考察了1、5、10、20、50、100 ng·mL-16個(gè)質(zhì)量濃度，建立對(duì)應(yīng)的直角坐標(biāo)軸，峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)。基質(zhì)效應(yīng)（ME）的計(jì)算公式為（基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的斜率）×100%[25-27]。使用6種固相萃取柱進(jìn)行二次純化后，基質(zhì)工作曲線與標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的斜率之比均低于50%，表明具有顯著的基質(zhì)效應(yīng)。因此，本方法采用基質(zhì)匹配曲線對(duì) 3 種林可酰胺類抗生素獸藥殘留進(jìn)行定量分析。相比于其他組，OASIS?HLB 6 ：500（mL：mg）固相萃取小柱可以有效降低河蟹肝胰腺樣品在液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀上的基質(zhì)抑制效應(yīng)。

2.6 試驗(yàn)方法的評(píng)價(jià)

2.6.1 方法的線性范圍、檢測(cè)限和定量限 以0、1、5、10、20、50 ng·mL-1為質(zhì)量濃度水平，以峰面積Y和相應(yīng)的目標(biāo)物質(zhì)質(zhì)量濃度為X（μg·L-1），繪制出3種林可酰胺類抗生素的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，線性相關(guān)系數(shù)（R2）均高于0.99，線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表3。將含有3種目標(biāo)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)溶液添加到空白河蟹樣品中，制備具有不同目標(biāo)物質(zhì)含量的加標(biāo)樣品。根據(jù)優(yōu)化條件測(cè)定樣品，分別采用3倍和10倍信噪比（S/N）的計(jì)算方法來(lái)確定方法的檢測(cè)限度和定量限度[28-29]。本檢測(cè)方法目標(biāo)物的LOD值約為0.3 μg·kg-1，LOQ值約為1.0 μg·kg-1（表3）。本方法的線性范圍能夠滿足實(shí)際河蟹肝胰腺樣品的檢測(cè)需要。

表3 方法的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 3 Linear regression equation, correlation coefficient, detection limit, and quantitative limit of assay

2.6.2 方法的準(zhǔn)確性和精密度 將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液添加到河蟹的空白樣品中，以獲得目標(biāo)質(zhì)量濃度為5.0、10.0和50.0 μg·kg-1的3個(gè)加標(biāo)水平，并根據(jù)優(yōu)化的方法重復(fù)測(cè)定6次。河蟹樣品中3種林可酰胺類抗生素的加標(biāo)回收率和精度見(jiàn)表4。3種質(zhì)量濃度的林可酰胺類抗生素在蟹類樣品中的回收率為80.5%～99%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）為2.5%～5.2%，回收率和準(zhǔn)確度高，能夠滿足河蟹樣品中這3種林可酰胺類抗生素殘留的分析要求。

表4 3種林可酰胺類藥物的加標(biāo)回收率及精密度（n=6）Table 4 Recovery and precision of assay on 3 lincosamide antibiotics (n=6)

2.7 實(shí)際樣品分析

用本方法檢測(cè)了從各農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)抽查到的170份河蟹樣品。結(jié)果5份河蟹樣品林可霉素含量檢出。檢出的陽(yáng)性樣品林可霉素質(zhì)量濃度依次為：4.43 、9.23、4.26 、17.77 、8.47 μg·kg-1。本方法簡(jiǎn)單、快捷、精確度高，適用于河蟹樣品中3種林肯酰胺類抗生素殘留的檢測(cè)，其中一份陽(yáng)性樣品的色譜圖如圖3所示。

圖3 陽(yáng)性樣品的色譜圖Fig. 3 Chromatograms of positive samples

3 討論與結(jié)論

復(fù)雜的油脂基質(zhì)給河蟹蟹黃抗生素類藥物的檢測(cè)造成了一定的困難。油脂易溶于正己烷，正己烷和水分層，正己烷在上層，棄掉正己烷可達(dá)到凈化效果；HLB小柱吸附劑是由親脂性二乙烯苯和親水性n-乙烯基吡咯烷酮兩種單體按一定比例聚合成的大孔共聚物，其保留機(jī)理為反相，通過(guò)一個(gè)“特殊的極性捕獲基團(tuán)”來(lái)增加對(duì)極性物質(zhì)的保留提供很好的水浸潤(rùn)性，林可酰胺類抗生素藥物是極性較強(qiáng)的物質(zhì)，因此用HLB小柱提取該藥物。

針對(duì)河蟹肝胰腺基質(zhì)的特點(diǎn)，結(jié)合現(xiàn)行有效標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)報(bào)道，本研究對(duì)傳統(tǒng)提取工藝進(jìn)行了改進(jìn)，以減少肝胰腺樣品中其他復(fù)雜基質(zhì)的干擾，使用2%甲酸乙腈作樣品的提取溶劑，凈化過(guò)程采用了正 己 烷 祛 脂 和OASIS?HLB 6∶500（mL∶mg）SPE柱進(jìn)行過(guò)濾和富集，優(yōu)化了部分液相色譜和質(zhì)譜的分析程序等。采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，建立了在河蟹肝胰腺樣品中林可酰胺類抗生素藥物殘留的快速測(cè)定方法。本方法具有步驟少、精確度高、穩(wěn)定性好、重現(xiàn)性好、減少溶劑的消耗量等優(yōu)點(diǎn)。本研究完善了對(duì)河蟹肝胰腺樣品中林可酰胺類獸藥殘留的定量檢測(cè)，可為河蟹的質(zhì)量安全生產(chǎn)監(jiān)控提供技術(shù)支持。