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    高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定河蟹肝胰腺組織中林可酰胺類抗生素殘留

    2022-01-07 02:27:02邱稀木朱曉華邊文冀王淑芳
    關(guān)鍵詞:種林類抗生素河蟹

    邱稀木,朱曉華,邊文冀,王淑芳,孟 勇

    [1. 江蘇海洋大學(xué)海洋科學(xué)與水產(chǎn)學(xué)院,江蘇 連云港 222005;2. 江蘇省淡水水產(chǎn)研究所,江蘇 南京 210017;3. 江蘇省水產(chǎn)質(zhì)量檢測(cè)中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(南京),江蘇 南京 210017]

    0 引言

    【研究意義】林可酰胺(Lincosamide)類抗生素主要有林可霉素(Lincomycin)、克林霉素(Clindamycin)、吡利霉素(Pirlimycin),能抑制細(xì)菌的蛋白質(zhì)合成,對(duì)大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌和一些厭氧革蘭氏陰性菌有抗菌作用[1-2]。林可酰胺類抗生素主要運(yùn)用于臨床和畜禽養(yǎng)殖上,根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部印發(fā)的《水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥明白紙2020年1、2號(hào)》,林可酰胺類抗生素藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的運(yùn)用目前還沒(méi)有明確的指導(dǎo)屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖的非規(guī)范用藥。近年來(lái),在漁用投入品的風(fēng)險(xiǎn)篩查中,在某些改水類產(chǎn)品中檢測(cè)到林可酰胺類抗生素藥物成分,對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖帶來(lái)了一定的風(fēng)險(xiǎn)隱患?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前,關(guān)于林可酰胺類藥物殘留的檢測(cè)方法比較多,如液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蜂蜜中的林可酰胺類獸藥殘留[3]、酶聯(lián)免疫分析方法測(cè)定牛肉雞肉豬肉魚(yú)肉中的林可酰胺類抗生素[4]、高效液相色譜法對(duì)林可霉素含量的測(cè)定[5]、林可霉素的磁免疫化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用[6]等,但在河蟹樣品中林可酰胺類藥物的檢測(cè)方法還未見(jiàn)報(bào)道。其中,液相色譜法以保留時(shí)間作為定性標(biāo)準(zhǔn),比較容易產(chǎn)生假陽(yáng)性的結(jié)果,而且靈敏度不高[7];化學(xué)發(fā)光法需要柱后衍生,操作的過(guò)程較為繁瑣,時(shí)間和人工成本高[7]。且河蟹的肝胰腺樣品油脂成分高存在基質(zhì)效應(yīng),基質(zhì)常常對(duì)分析物的分析過(guò)程有顯著的干擾,并影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性,所以對(duì)樣品提取和凈化的方法要求會(huì)較高[8]。【本研究切入點(diǎn)】固相萃?。⊿PE小柱)主要用于從各類復(fù)雜的基質(zhì)提取出想得到的分析物,例如生物體(血液和尿液)、水樣[9]、土壤、藥材[10]中提取目標(biāo)分析物,達(dá)到濃縮或純化的目的。本研究將固相萃取小柱用于河蟹肝胰腺樣品的前處理,以期達(dá)到更好的提取和凈化效果,降低其他復(fù)雜基質(zhì)對(duì)樣品提取的影響?!緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究以3種林可酰胺類抗生素(林可霉素、克林霉素、吡利霉素)為檢測(cè)對(duì)象,將SPE固相萃取柱應(yīng)用于河蟹的獸藥殘留檢測(cè)前處理,以期建立河蟹中林可酰胺類抗生素獸藥殘留的快速檢測(cè)方法,對(duì)河蟹質(zhì)量安全管控具有積極的意義。

    1 材料與方法

    1.1 儀器和試材料

    1.1.1 儀器 QTRAP 4500三重四極桿(美國(guó)SCIEX公司,配備電噴霧離子源);實(shí)驗(yàn)室用水(Millipore系統(tǒng)超純水);漩渦振蕩器(北京佳源興業(yè)公司);Allegra TM 離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司);Turbo Vap濃縮工作站(瑞典Biotage公司)。

    1.1.2 材料 甲醇、乙腈(色譜純,德國(guó)Merck公司);甲酸(色譜純,美國(guó)ROE公司);有機(jī)濾膜(0.22 μm,天津津騰有限公司);OASIS?HLB 6 :500(mL:mg)固相萃取柱;3種林可酰胺類抗生素標(biāo)準(zhǔn)品(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科學(xué)研究監(jiān)測(cè)所,100 μg·mL-1);河蟹樣品(從南京各農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)隨機(jī)抽樣)。

    1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

    準(zhǔn)確稱取5.0 mL林可酰胺、克林霉素和吡利霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液,分別轉(zhuǎn)移至同一50.0 mL容量瓶中,用乙腈作為稀釋劑溶解并稀釋至一定體積。進(jìn)一步將5.0 mL該溶液轉(zhuǎn)移至50.0 mL容量瓶中,用乙腈稀釋劑稀釋至一定體積。

    1.3 樣品的提取和凈化

    1.3.1 樣品提取 進(jìn)行以下步驟:(1)將5 g河蟹樣品(蟹肉和蟹黃混合)稱量到離心管中;(2)加入配置好的2%甲酸乙腈15 mL;(3)使用漩渦振蕩器渦旋5分鐘使提取劑與樣品充分溶解;(4)將每管樣品在4 ℃下以9000 r·min-1的速度離心10 min;(5)離心后的上清液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)50 mL離心管中;(6)殘留物用10 mL提取液再次提取,合并上清液。(7)溶液中加入5 mL正己烷,渦旋振蕩30 s,9000 r·min-1的速度離心5 min,棄去 上層正己烷,再加入5 mL正己烷重復(fù)操作一次。下層溶液待凈化。

    1.3.2 樣品凈化 SPE小柱依次用6 ml甲醇和6 ml超純水以3 mL·min-1的流速進(jìn)行預(yù)處理。將上清液(10 mL)以1 mL·min-1的速度通過(guò)固相萃取柱,棄流出液。10 mL超純水沖洗柱子,棄流出液,抽真空10 min。5 mL甲醇沖洗柱子洗脫。在40 ℃的條件下,洗脫液用氮吹儀吹至完全干,氮吹干后的殘留物加入1.00 mL 0.1%甲酸水-甲醇(9∶1)混合溶液,2分鐘渦旋使其充分混合,用針管吸取混合溶液,將溶液通過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜,置入棕色樣品瓶中,待上機(jī)。

    1.4 色譜和質(zhì)譜分析條件

    1.4.1 液相色譜條件 色譜柱:InfinityLab poroshell 120 SB-C18,(100 mm×2.7 mm,2.7 μm);A相為0.1%甲酸水溶液,B相為甲醇;柱溫:30 ℃;樣品量:10 μL;流速:0.40 mL·min-1;梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

    表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Table 1 Procedures of mobile phase gradient elution

    1.4.2 質(zhì)譜分析條件 質(zhì)譜的電離模式為電噴霧離子源(ESI+模式);輔助加熱氣體流量:50 L·min-1;霧化氣體流量:50 L·min-1;離子源的溫度為550 ℃;氣簾氣流量:35 L·min-1;噴霧電壓設(shè)置為5500 V。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 提取溶劑優(yōu)化

    林可酰胺類抗生素極性較強(qiáng),容易溶于極性溶劑[2,11]。因此,比較了磷酸鹽緩沖液、乙腈、乙酸乙酯和丙酮的萃取效率。結(jié)果表明,磷酸鹽緩沖液含水量高,不利于后續(xù)的濃縮,溶解的蛋白易導(dǎo)致過(guò)SPE柱時(shí)堵塞;乙酸乙酯作為萃取溶劑時(shí),乳化現(xiàn)象嚴(yán)重,回收率很低;丙酮用作提取溶劑時(shí)揮發(fā)性很高,直接注入可能會(huì)破壞管道和質(zhì)譜組件[3]。乙腈是極性較強(qiáng)的有機(jī)溶劑,具有沉淀蛋白質(zhì)的作用,各指標(biāo)的回收率優(yōu)于其他提取劑。因此,本試驗(yàn)選擇乙腈為提取溶劑。此外,分別以純乙腈、1%甲酸乙腈、2%甲酸乙腈、1%氨水乙腈、2%氨水乙腈作為提取液,考察其對(duì)3種林可酰胺類目標(biāo)物的提取效果。結(jié)果顯示,相比其他組,2%甲酸乙腈作為提取溶劑時(shí)的平均回收率最高,3種林可酰胺類藥物的回收率為76.9%~102%,滿足期望結(jié)果回收率在75%以上。因此,本試驗(yàn)提取樣品采用2%甲酸乙腈進(jìn)行試驗(yàn)。

    2.2 色譜條件的優(yōu)化

    利用InfinityLab poroshell 120 SB-C18(100 mm×2.7 mm,2.7 μm)色譜柱在ESI+模式下,比較了在乙腈-水或甲醇-水流動(dòng)相系統(tǒng)中3種林可酰胺類藥物的色譜結(jié)果。試驗(yàn)結(jié)果是:甲醇-水流動(dòng)相中3個(gè)目標(biāo)的峰值形狀和響應(yīng)優(yōu)于乙腈-水,且洗脫時(shí)間短,所以選擇了甲醇-水流動(dòng)相系統(tǒng)。

    通過(guò)在流動(dòng)相中加入適量的揮發(fā)性鹽或酸可以提高目標(biāo)物的反應(yīng)值、分辨率和峰形[12-13]。因此,在水相中添加甲酸或乙酸銨對(duì)流動(dòng)相系統(tǒng)做進(jìn)一步優(yōu)化。離子化后3種目標(biāo)化合物主要以[M+H]+的形式存在[14-15]。結(jié)果是,在水相中添加醋酸銨降低了各目標(biāo)化合物的響應(yīng)值[16-18];在水相中加入甲酸后,各目標(biāo)化合物的質(zhì)譜響應(yīng)提高了10%,且添加0.1%甲酸時(shí)效果最佳。因此本試驗(yàn)使用0.1%甲酸水-甲醇作為流動(dòng)相。

    2.3 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

    將50 μg·L-1待測(cè)林可酰胺標(biāo)準(zhǔn)混合溶液用針型泵注入質(zhì)譜儀,分別用電噴霧正電離模式和電噴霧負(fù)電離模式對(duì)藥物的母離子全掃描進(jìn)行比較并優(yōu)化了碰撞能量和去簇電壓。分析結(jié)果表明,在電噴霧正電離模式下,3種測(cè)試對(duì)象的離子信號(hào)穩(wěn)定,響應(yīng)速度快,因此選擇電噴霧正電離掃描模式。在這種模式下,所有3種化合物都產(chǎn)生了[M+H]+的母離子。進(jìn)一步掃描生成的子離子,選擇豐度最高的2個(gè)子離子進(jìn)行定性和定量分析??疾炝藝婌F電壓分別為:4500V、5000 V、5500 V時(shí),3種標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子化效率,結(jié)果為5500 V時(shí)的離子化效率最高。目標(biāo)化合物的質(zhì)譜分析條件見(jiàn)表2。3種林可酰胺類抗生素藥物的總離子流圖見(jiàn)圖1。

    圖1 質(zhì)量濃度為50 ng·L-1的 3 種林可酰胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of 50 ng·L-1standard solutions of 3 lincosamide antibiotics

    表2 林可酰胺類藥物測(cè)定的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass spectrometric parameters for lincosamide antibiotics determination

    2.4 SPE小柱對(duì)蟹黃的凈化效果

    河蟹的肝胰腺富含碳水化合物、氨基酸、有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、膠原蛋白、維生素A、不飽和脂肪酸等,這會(huì)影響目標(biāo)化合物的測(cè)定,并污染離子源[19-21]。因此,本試驗(yàn)考察了在河蟹肝胰腺樣品提取中,固相萃取柱對(duì)3種林可酰胺類藥物的凈化效果和回收率。試驗(yàn)分析了6種SPE小柱的凈化效果(圖2),其中OASIS?HLB 6 mL/500 mg SPE柱組的凈化結(jié)果最好。使用該型號(hào)SPE小柱,3種林可酰胺類藥物的回收率在80%以上,平均回收率是84.6%,明顯好于其他固相萃取柱組。因此,本方法最終選擇型號(hào)為OASIS?HLB 6 mL/500 mg的 SPE柱來(lái)凈化河蟹肝胰腺樣品。

    圖2 不同固相萃取柱對(duì)目標(biāo)物回收率的影響Fig. 2 Recovery rates on 3 antibiotics by various SPE columns

    2.5 基質(zhì)效應(yīng)的考察

    電噴霧離子源在電離時(shí)候,樣品中的基質(zhì)和目標(biāo)化合物具有競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系,這種現(xiàn)象為基質(zhì)強(qiáng)化效應(yīng)或基質(zhì)抑制效應(yīng)[22-24]。本試驗(yàn)考察了1、5、10、20、50、100 ng·mL-16個(gè)質(zhì)量濃度,建立對(duì)應(yīng)的直角坐標(biāo)軸,峰面積為縱坐標(biāo),質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)。基質(zhì)效應(yīng)(ME)的計(jì)算公式為(基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的斜率)×100%[25-27]。使用6種固相萃取柱進(jìn)行二次純化后,基質(zhì)工作曲線與標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的斜率之比均低于50%,表明具有顯著的基質(zhì)效應(yīng)。因此,本方法采用基質(zhì)匹配曲線對(duì) 3 種林可酰胺類抗生素獸藥殘留進(jìn)行定量分析。相比于其他組,OASIS?HLB 6 :500(mL:mg)固相萃取小柱可以有效降低河蟹肝胰腺樣品在液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀上的基質(zhì)抑制效應(yīng)。

    2.6 試驗(yàn)方法的評(píng)價(jià)

    2.6.1 方法的線性范圍、檢測(cè)限和定量限 以0、1、5、10、20、50 ng·mL-1為質(zhì)量濃度水平,以峰面積Y和相應(yīng)的目標(biāo)物質(zhì)質(zhì)量濃度為X(μg·L-1),繪制出3種林可酰胺類抗生素的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,線性相關(guān)系數(shù)(R2)均高于0.99,線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表3。將含有3種目標(biāo)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)溶液添加到空白河蟹樣品中,制備具有不同目標(biāo)物質(zhì)含量的加標(biāo)樣品。根據(jù)優(yōu)化條件測(cè)定樣品,分別采用3倍和10倍信噪比(S/N)的計(jì)算方法來(lái)確定方法的檢測(cè)限度和定量限度[28-29]。本檢測(cè)方法目標(biāo)物的LOD值約為0.3 μg·kg-1,LOQ值約為1.0 μg·kg-1(表3)。本方法的線性范圍能夠滿足實(shí)際河蟹肝胰腺樣品的檢測(cè)需要。

    表3 方法的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 3 Linear regression equation, correlation coefficient, detection limit, and quantitative limit of assay

    2.6.2 方法的準(zhǔn)確性和精密度 將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液添加到河蟹的空白樣品中,以獲得目標(biāo)質(zhì)量濃度為5.0、10.0和50.0 μg·kg-1的3個(gè)加標(biāo)水平,并根據(jù)優(yōu)化的方法重復(fù)測(cè)定6次。河蟹樣品中3種林可酰胺類抗生素的加標(biāo)回收率和精度見(jiàn)表4。3種質(zhì)量濃度的林可酰胺類抗生素在蟹類樣品中的回收率為80.5%~99%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)為2.5%~5.2%,回收率和準(zhǔn)確度高,能夠滿足河蟹樣品中這3種林可酰胺類抗生素殘留的分析要求。

    表4 3種林可酰胺類藥物的加標(biāo)回收率及精密度(n=6)Table 4 Recovery and precision of assay on 3 lincosamide antibiotics (n=6)

    2.7 實(shí)際樣品分析

    用本方法檢測(cè)了從各農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)抽查到的170份河蟹樣品。結(jié)果5份河蟹樣品林可霉素含量檢出。檢出的陽(yáng)性樣品林可霉素質(zhì)量濃度依次為:4.43 、9.23、4.26 、17.77 、8.47 μg·kg-1。本方法簡(jiǎn)單、快捷、精確度高,適用于河蟹樣品中3種林肯酰胺類抗生素殘留的檢測(cè),其中一份陽(yáng)性樣品的色譜圖如圖3所示。

    圖3 陽(yáng)性樣品的色譜圖Fig. 3 Chromatograms of positive samples

    3 討論與結(jié)論

    復(fù)雜的油脂基質(zhì)給河蟹蟹黃抗生素類藥物的檢測(cè)造成了一定的困難。油脂易溶于正己烷,正己烷和水分層,正己烷在上層,棄掉正己烷可達(dá)到凈化效果;HLB小柱吸附劑是由親脂性二乙烯苯和親水性n-乙烯基吡咯烷酮兩種單體按一定比例聚合成的大孔共聚物,其保留機(jī)理為反相,通過(guò)一個(gè)“特殊的極性捕獲基團(tuán)”來(lái)增加對(duì)極性物質(zhì)的保留提供很好的水浸潤(rùn)性,林可酰胺類抗生素藥物是極性較強(qiáng)的物質(zhì),因此用HLB小柱提取該藥物。

    針對(duì)河蟹肝胰腺基質(zhì)的特點(diǎn),結(jié)合現(xiàn)行有效標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)報(bào)道,本研究對(duì)傳統(tǒng)提取工藝進(jìn)行了改進(jìn),以減少肝胰腺樣品中其他復(fù)雜基質(zhì)的干擾,使用2%甲酸乙腈作樣品的提取溶劑,凈化過(guò)程采用了正 己 烷 祛 脂 和OASIS?HLB 6∶500(mL∶mg)SPE柱進(jìn)行過(guò)濾和富集,優(yōu)化了部分液相色譜和質(zhì)譜的分析程序等。采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),建立了在河蟹肝胰腺樣品中林可酰胺類抗生素藥物殘留的快速測(cè)定方法。本方法具有步驟少、精確度高、穩(wěn)定性好、重現(xiàn)性好、減少溶劑的消耗量等優(yōu)點(diǎn)。本研究完善了對(duì)河蟹肝胰腺樣品中林可酰胺類獸藥殘留的定量檢測(cè),可為河蟹的質(zhì)量安全生產(chǎn)監(jiān)控提供技術(shù)支持。

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