一株溶磷真菌的鑒定及其促生特性研究

李 靜，艾加敏，余天飛，邊 丹，鄭超超，郭旻皓，鄧振山

（1. 延安大學生命科學學院，陜西 延安 716000；2. 西北大學生命科學學院，陜西 西安 710069）

0 引言

【研究意義】磷作為植物生長發(fā)育不可或缺的元素，是植物根際生態(tài)位中經(jīng)常出現(xiàn)的生長限制性養(yǎng)分，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要的地位。研究發(fā)現(xiàn)，由于理化性質(zhì)問題導致土壤中磷的有效性降低，僅有0.1%的有效磷可以溶解在土壤中被植物吸收[1]，這對植物的生長有著很大的影響。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常常通過施用磷肥或含磷量較高的復合肥來滿足作物生產(chǎn)所需。但磷肥的過度使用會使環(huán)境養(yǎng)分流失，這會減少生物多樣性并加劇氣候變化，從而造成了一系列生態(tài)環(huán)境污染問題。針對這些問題，越來越多的研究者試圖尋找高效溶磷微生物來提高農(nóng)業(yè)中對磷的利用?！厩叭搜芯窟M展】長期以來，許多具有磷溶解能力的微生物被分離得到，這些能夠通過溶解和轉(zhuǎn)化使低效磷轉(zhuǎn)為植物可吸收利用的有效磷的微生物，稱為溶磷微生物（Phosphate-solubilizing microorganisms）[2]。它們能夠通過改善植物磷營養(yǎng)而促進植物生長。目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)諸多具有溶磷能力的微生物種類，包括細菌、真菌和放線菌[3-5]。這些溶磷微生物能夠有效提高土壤中有機酸的含量、降低土壤的酸堿度[6]，通過螯合作用和離子交換反應(yīng)等[7]，溶解和轉(zhuǎn)化難溶性磷，增強植物對磷素的吸收，從而促進植物的生長，減少磷肥濫用所帶來的一系列問題。如許昌超等[8]從土壤中篩選出一株青霉菌株P(guān)6，發(fā)現(xiàn)其不僅能夠提高土壤中的有效磷含量，還能促進小白菜生長和提高鈣鎂磷肥的肥效。朱德旋等[9]從北方寒地根際土壤中分離出一株高效溶解無機磷細菌，為微生物肥料的開發(fā)提供優(yōu)良菌種。DA SILVA等[10]從南極地衣中分離的細菌被證明具有溶解磷酸鹽的潛力，有助于減少化肥的使用。總之，植物通過微生物的參與來協(xié)調(diào)其發(fā)育，以優(yōu)化磷的捕獲并調(diào)節(jié)植物的總體生長?！颈狙芯壳腥朦c】目前，有關(guān)溶磷微生物的研究較多，但均集中在以細菌為主的研究上，而關(guān)于具有溶磷作用真菌的遺傳特征，在很大程度上都是未知的，特別是專門針對小麥田土壤溶磷真菌的研究更是鮮有報道。鑒于此，本文通過探明一株具有高效溶磷能力的真菌菌株及其促生效應(yīng)，以揭示其溶磷策略和促生特性?！緮M解決的關(guān)鍵問題】從小麥田土壤中分離得到一株具有溶磷能力的真菌R3，通過形態(tài)觀察和ITS序列分析對菌株進行鑒定，采用液體培養(yǎng)測定菌株對Ca3（PO4）2、AlPO4和FePO43種不同磷源的溶解能力，并通過盆栽試驗測定其對小麥生長的影響，以期為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中微生物菌劑的開發(fā)提供資源。

1 材料與方法

1.1 供試培養(yǎng)基及試劑

供試培養(yǎng)基包括PDA培養(yǎng)基[11]和無機磷培養(yǎng)基[12]。主要試劑包括5 mg·L-1標準磷溶液；鉬銻抗顯色劑；0.2%二硝基酚指示劑；2 mol·L-1NaOH溶液；0.5 mol·L-1H2SO4溶液。

1.2 樣品采集

土樣于2019年6月采自陜西省延安市寶塔區(qū)河莊坪鎮(zhèn)的小麥田（36°63′97″N，109°32′07″E，暖溫帶大陸季風性氣候），在剛收割完小麥的田地按5點采樣法進行采集，選取一個中心點，向周圍等距等角擴散至4個點，用無菌鏟采集深度10～20 cm的土壤，裝入已滅菌的密封袋中帶回實驗室，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 溶磷菌的分離篩選

稱取10 g供試土壤于250 mL三角瓶中（含90 mL無菌水及少量玻璃珠），160 r·min-1振蕩30 min，制成土壤懸液。取100 μL于滅菌的離心管中，在無菌操作臺進行梯度稀釋至10-5，取10-3、10-4、10-5稀釋液各30 μL，采用梯度稀釋法分別涂布至無機磷固體培養(yǎng)基上，每個稀釋梯度重復3次，28 ℃恒溫培養(yǎng)5～7 d。挑取有透明圈產(chǎn)生的菌落，反復純化至少3次，轉(zhuǎn)接于試管斜面上，4 ℃冷藏備用[10,13]。同時將純化的菌株3重復分別接種于無機磷固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)5～7 d，記錄溶磷圈的直徑比（D/d）。

結(jié)合定性結(jié)果，選出本試驗中具有明顯溶磷效果的一株真菌，對其進行進一步的研究。

1.4 溶磷菌的鑒定

1.4.1 形態(tài)學特征鑒定 將菌株接種于PDA固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，觀察菌落的形狀、顏色和大小等，依據(jù)魏景超《真菌鑒定手冊》[14]對其形態(tài)學特征進行描述。

1.4.2 DNA提取和鑒定 用PDA培養(yǎng)基活化菌株后，采用改良CTAB法[15]進行DNA的提取。然后選用真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGC GG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進行PCR擴增。PCR擴增體系25 μL：模板1.5 μL，2×PCRTaqMaster Mix 12.5 μL，正反引物各1 μL，滅菌雙蒸水9 μL。擴增條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸90 s，30次循環(huán)；72 ℃再延伸10 min[16]。然后用1%的瓊脂糖凝膠驗證PCR產(chǎn)物，將有條帶的菌株送至北京擎科生物有限公司進行測序。將獲得的基因序列提交到NCBI和已知序列進行比對，并申請GenBank菌株登錄號，運用MEGA X軟件，選用鄰接法（Neighbourjoining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[17]。

1.5 菌株對不同磷源的溶解能力

為了檢測菌株對不同無機磷源的溶解能力，選用Ca3（PO4）2、AlPO4和FePO4分別作為培養(yǎng)基中的無機磷源，其他成分保持不變。將溶磷定性效果明顯的菌株接種至PDA液體培養(yǎng)基中，28 ℃、160 r·min-1搖床培養(yǎng)7 d，用無菌水調(diào)成含量為1×108cfu·mL-1的菌懸液，以1∶100（V/V）比例接種至含有不同磷源的無機磷液體培養(yǎng)基中，28 ℃、160 r·min-1搖床培養(yǎng)7 d，每24 h取一次樣，12000 r·min-1離心10 min取上清液，利用鉬銻抗比色法[18]測定有效磷含量，同時記錄菌液pH，每組試驗3個重復。試驗以不接種菌液的無機磷液體培養(yǎng)基作對照。

1.6 菌株對小麥的促生效果盆栽試驗

于寶塔區(qū)河莊坪鎮(zhèn)小麥田地內(nèi)采集盆栽試驗所需土壤，采回后過篩，滅菌，分裝至塑料盆（上口徑15 cm×高12.5 cm×底徑10.5 cm）中，每盆1 kg。菌懸液的制備同1.5。選取相對飽滿的小麥種子，具體處理方法參照文獻[19]進行。

試驗設(shè)置6個處理：①以Ca3（PO4）2為無機磷源的接菌處理；②以AlPO4為無機磷源的接菌處理；③以FePO4為無機磷源的接菌處理；④以Ca3（PO4）2為無機磷源的不接菌對照處理；⑤以AlPO4為無機磷源的不接菌對照處理；⑥以FePO4為無機磷源的不接菌對照處理。每處理3個重復。

將每種無機磷源按照0.5 g·kg-1的用量均勻混合至土壤中[8]。將露白的種子播種于各處理花盆中，每盆30粒，出苗后定苗為10株。孢子懸液（1×108cfu·mL-1）按照10 mL·kg-1的用量灌根施加到土壤中。每隔3 d給所有處理澆灌一次無菌水，30 d后測定小麥的株高、根長、鮮重、干重和葉綠素含量等農(nóng)藝指標。同時測定土壤有效磷含量和pH。

1.7 數(shù)據(jù)分析

運用 Microsoft Excel 2010 進行數(shù)據(jù)處理。運用軟件SPSS Statistics 26.0進行統(tǒng)計學分析。運用Graphpad Prism 8進行統(tǒng)計作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶磷真菌的篩選

通過初篩，發(fā)現(xiàn)1株平板溶磷效果較好的真菌，編號為R3。將菌株R3接種至無機磷培養(yǎng)基上培養(yǎng)72 h，可觀察到平板上出現(xiàn)明顯的溶磷圈（圖1）。設(shè)置5個重復進行確認，結(jié)果顯示溶磷圈直徑D平均值為27.99 mm，菌落直徑d平均值為19.26 mm，D/d為1.45。

2 .2 溶磷菌的鑒定

2.2.1 形態(tài)學特征鑒定 將真菌菌株R3接種于PDA培養(yǎng)基上，放入恒溫箱于28 ℃培養(yǎng)，4 d時測得菌落直徑為21.95～35.54 mm，菌落表面中心為青綠色，周圍為白色，無滲出液，背面為淡黃色（圖2）。8 d時測量，菌落直徑41.33～48.68 mm，菌落表面中心為黃綠色，有滲出液，周圍為白色，背面為淡黃色（圖3）。普通光學顯微鏡下觀察，可見分生孢子梗細長，頂部呈帚狀，對稱，分生孢子梭形（圖4）。

圖3 菌株R3的菌落培養(yǎng)特征（8 d PDA培養(yǎng)結(jié)果）Fig. 3 Colony characteristics of cultured R3 on PDA for 8 days

圖4 菌株R3形態(tài)特征（×400）Fig. 4 Morphological characteristics of strain R3(×400)

2.2.2 菌株分類鑒定 將菌株R3的ITS序列提交至NCBI的GenBank 數(shù)據(jù)庫，獲得菌株登錄號為MZ031393。從GenBank中選擇與R3序列同源性在98%以上的真菌序列，通過Mega X軟件，采用Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明（圖5），菌株R3與產(chǎn)紅青霉菌（Penicillium rubens）同屬一個分支，同源性達到100%，故可判斷該菌株歸屬為青霉菌Penicilliumsp.。

圖5 基于ITS序列同源性構(gòu)建菌株R3的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 5 Phylogenetic tree of R3 constructed based on homology of ITS sequence

2.3 菌株R3對不同磷源的溶解能力

圖6-A顯示了菌株R3在以Ca3（PO4）2、AlPO4和FePO4為磷源的液體培養(yǎng)基中的溶磷量變化趨勢。結(jié)果顯示，菌株R3對3種不同磷源的溶解能力均呈先升高后逐漸穩(wěn)定的趨勢。其中，對Ca3（PO4）2的溶解能力在第4天時最高，為328.79 mg·L-1；對AlPO4的溶解量在第4天達到頂峰，為95.99 mg·L-1；對FePO4的溶解量在第5天時最高，為75.39 mg·L-1。溶磷量Ca3（PO4）2＞AlPO4＞FePO4，可見菌株R3對Ca3（PO4）2有較強的溶磷能力。

圖6-B顯示了菌株R3對不同磷源培養(yǎng)基pH的影響，總體呈先下降后平穩(wěn)的趨勢。以Ca3（PO4）2和FePO4為磷源的培養(yǎng)基在第4天后趨于穩(wěn)定，以AlPO4為磷源的培養(yǎng)基在第5天后趨于穩(wěn)定。

圖6 菌株R3的溶磷量及pH變化Fig. 6 Phosphorous solubilization by R3 with changing medium pH

2.4 菌株對小麥的促生效果盆栽試驗

表1顯示了菌株R3處理的小麥在室外培養(yǎng)30 d后的農(nóng)藝性狀。結(jié)果表明：與未接菌的對照組相比，接種R3菌液后小麥幼苗的農(nóng)藝性狀均有所增加。在株高、根長、鮮重和葉綠素含量方面分別提高了18.23%～35.65%、27.63%～50.44%、37.99%～50.94%和9.59%～19.57%。其中，菌株R3在以Ca3（PO4）2為磷源的處理中對小麥的促生效果最好，與對照相比，小麥的株高、根長、鮮重和葉綠素含量分別提高了35.65%、50.44%、50.94%和19.57%。菌株R3在不同難溶磷源處理中對盆栽小麥的促生效果表現(xiàn)為Ca3（PO4）2＞AlPO4＞FePO4。

表1 真菌菌株R3菌處理的小麥幼苗的農(nóng)藝性狀Table 1 Agronomic traits of wheat seedlings in presence of growth-promoting R3

3 討論與結(jié)論

目前，已有許多關(guān)于溶磷青霉菌的研究報道，包括P.oxalicum[20]、P.aculeatum[21]、P.bilaiae[22]和P.brocae[8]等。本試驗從小麥田土壤中篩選得到一株具有溶磷能力的P.rubens菌株，目前尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于該種青霉菌在溶磷方面的報道。賴鑒添等[23]從甘蔗葉堆肥中篩選出一株具有高效溶磷及促生功能的菌株DC30-2-P1，在無機磷培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)7 d，測得菌落直徑為55.33 mm，溶磷圈直徑達65.33 mm，D/d為1.18；趙龍飛等[24]從大豆根瘤中篩選得到的菌株DD291，菌落直徑僅為4.20 mm，溶磷圈直徑卻達到39.70 mm，定性表現(xiàn)具有很強的溶磷能力。本研究通過平板定性試驗，發(fā)現(xiàn)菌株R3在無機磷培養(yǎng)基上的溶磷圈直徑為27.99 mm，菌落直徑為19.26 mm，D/d為1.45，具有較好的溶磷能力。

大量研究表明，同一菌株對不同難溶性磷酸鹽的溶解能力不同，普遍現(xiàn)象是對磷酸鈣的溶解能力大于磷酸鋁和磷酸鐵。呂俊等[16]從馬尾松根際土中分離得到的伯克霍爾德菌WJ27對4種難溶性磷酸鹽的溶解能力依次為Ca3（PO4）2＞AlPO4＞FePO4＞CaHPO4·2H2O。李豆豆等[25]從番茄根際土壤中篩選的解磷真菌PSF1對Ca3（PO4）2的溶解量最大，為869.62mg·L-1，其次為AlPO4、FePO4。王丹等[26]研究發(fā)現(xiàn)出芽短梗霉F4對4種難溶性磷酸鹽溶磷能力大小依次為磷酸鋁＞磷酸鐵、磷酸鈣＞磷礦粉，溶磷量均超過200 mg·L-1，表現(xiàn)出較強的溶磷能力。本研究發(fā)現(xiàn)菌株R3對Ca3（PO4）2的溶解能力最高達328.79 mg·L-1；對AlPO4和FePO4的最高溶解量分別為95.99 mg·L-1和75.39 mg·L-1，溶磷量Ca3（PO4）2＞AlPO4＞FePO4。此外，菌株R3對不同磷源培養(yǎng)基pH總體呈先下降后平穩(wěn)的趨勢。這可能是因為菌株R3在液體培養(yǎng)過程中產(chǎn)生了某些有機酸導致培養(yǎng)基的pH下降，其具體機制還需進一步深入研究。

溶磷真菌對植物具有顯著的促生作用[27]。本試驗以小麥作為供試材料，對溶磷菌R3的促生效果進行驗證。盆栽結(jié)果顯示，與未接菌的對照組相比，菌株R3對小麥的株高、根長、鮮重和葉綠素含量等均有促進作用，尤其是以Ca3（PO4）2為磷源時，小麥鮮重可提高50.94%。說明其能有效促進作物生長，可為微生物肥料的開發(fā)提供優(yōu)質(zhì)的種質(zhì)資源。