冷凍保存對NK細(xì)胞活率及其腫瘤殺傷效果的影響①

劉春香 張 怡（天晴干細(xì)胞股份有限公司，哈爾濱 150028）

自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞是一類重要的淋巴細(xì)胞，是人類固有免疫的首道天然防線。由于其具有對異常細(xì)胞的殺傷與清除作用，近年來在生物技術(shù)和細(xì)胞藥物研究領(lǐng)域越來越受到重視。NK細(xì)胞與T細(xì)胞和B細(xì)胞的區(qū)別在于，其為主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）非限制性免疫類細(xì)胞，并且不需要預(yù)先致敏即可行使其免疫識別、防疫和維穩(wěn)等功能［1］。

NK細(xì)胞發(fā)揮作用主要依靠所分泌的細(xì)胞因子及膜受體。O'SULLIVAN等［2］發(fā)現(xiàn)，NK細(xì)胞對腫瘤殺傷作用依賴于所分泌產(chǎn)生的干擾素γ（interferonγ，IFN-γ）的作用及其對腫瘤微環(huán)境中巨噬細(xì)胞的激活作用；同時，IFN-γ可以選擇性地抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遏制腫瘤內(nèi)血管的快速生成［3］。NK細(xì)胞的膜受體主要分為抑制性受體和激活性受體兩大類，這些受體通過識別自己與非己來調(diào)節(jié)及平衡細(xì)胞毒性作用。激活型受體主要為自然殺傷細(xì)胞基團2D（natural killer cell group 2D，NKG2D）和自然細(xì)胞毒性受體（natural cytotoxicity receptors，NCR）［4-5］。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)腫瘤患者NKG2D表達(dá)受到抑制時，NK細(xì)胞分泌IFN、激活T細(xì)胞并介導(dǎo)細(xì)胞毒性作用顯著下降［6］。NCR是近10年發(fā)現(xiàn)的NK細(xì)胞毒性特異性活化受體，包括3種異質(zhì)性分子：NKp46、NKp44、NKp30，能夠辨識病毒硫酸乙酰肝素、凝血素、PCNA、B7等特定腫瘤抗原，其中NKp44僅表達(dá)于活化的NK細(xì)胞［4，6］。NCR在辨識和清除靶細(xì)胞時，可單獨或與其他受體一起作用，例如NK對黑色素瘤殺傷時，NCR發(fā)揮主要作用，而NCR表達(dá)低下時，NKG2D則會輔助NCR，加強對腫瘤抗原的識別［7-8］。由于癌癥患者自身NK細(xì)胞數(shù)量的減少及功能異常，使自體NK細(xì)胞擴增能力及功能受到限制，因此科學(xué)家們致力于同種異體NK細(xì)胞的安全性及有效性研究［9-10］。KLINGEMANN等［11］研究表明，同種異體NK細(xì)胞在多發(fā)性骨髓瘤和淋巴瘤治療中具有很高的安全性和較好的抗腫瘤活性。HOLUBOVA等［12］研究表明，冷凍保存的NK細(xì)胞具有較高的腫瘤殺傷活性。本研究欲在此基礎(chǔ)上，通過對生產(chǎn)的新鮮NK細(xì)胞與凍存NK細(xì)胞活率、因子分泌能力及部分表面活化性受體的變化對比來確定NK細(xì)胞凍存前后的差異，同時利用A549細(xì)胞對凍存前后NK細(xì)胞進行腫瘤殺傷能力檢測，為批量擴增并冷凍保存的同種異體NK細(xì)胞作為即用型產(chǎn)品而應(yīng)用于臨床提供有力支持。

1 材料與方法

1.1 材料 淋巴細(xì)胞分離液Ficoll-Paque PLUS為GE公司產(chǎn)品；4-1BBL、IL-15和IL-21基因修飾的K562滋養(yǎng)細(xì)胞由本實驗室保存；IL-2購自北京四環(huán)制藥有限公司；GT-T551 H3培養(yǎng)基、2L細(xì)胞培養(yǎng)袋均為TaKaRa公司產(chǎn)品；T75、T175細(xì)胞培養(yǎng)瓶均為Nest品牌產(chǎn)品；15 ml、50 ml細(xì)胞離心管均為Corning公司產(chǎn)品；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、離心機、酶標(biāo)儀為美國Thermo公司產(chǎn)品；顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品；KX-21血細(xì)胞分析儀為日本SYSMEX公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞儀為美國Beckman Coulter公司產(chǎn)品；Rabbit anti-human NKG2D IgG/FITC、Rabbit anti-human NCR2 IgG/FITC均購自北京博奧森生物科技有限公司；RTCA S16系統(tǒng)為ACEA公司產(chǎn)品；人肺癌細(xì)胞A549由ACEA公司贈送；胰蛋白酶、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、DMEM培養(yǎng)基均由美國Gibco公司生產(chǎn)；IFN-γELISA試劑盒購自哈爾濱賽萊博科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 新鮮NK細(xì)胞及凍存NK細(xì)胞解凍后的活率檢測PBMCs分離：根據(jù)參考文獻(xiàn)［13］進行，將成人外周血2 000 r/min離心10 min后吸出血漿，56℃水浴滅活30 min，備用；血細(xì)胞用生理鹽水稀釋后加至裝有Ficoll溶液的離心管中，2 000 r/min離心20 min密度梯度離心收集白膜層細(xì)胞并用生理鹽水洗滌2次，計數(shù)備用。

NK擴增：根據(jù)參考文獻(xiàn)［13］進行，用30 ml GTT551 H3培養(yǎng)基將2×107～3×107個PBMCs重懸后，接入T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶，然后加入IL-2、K562滋養(yǎng)細(xì)胞及占培養(yǎng)基體積5%的滅活的自體血漿，其中IL-2為500 U/ml，滋養(yǎng)細(xì)胞為1×106個/ml，37℃、5%CO2條件下體外共培養(yǎng)15 d，其中培養(yǎng)第7天時補加1次NK擴增滋養(yǎng)細(xì)胞，補加的NK擴增滋養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)量為NK細(xì)胞數(shù)量的1/4，過程中進行補液，共培養(yǎng)15 d。

NK細(xì)胞凍存及凍存前后存活率計算：在培養(yǎng)第15天時，取200μl NK細(xì)胞，臺盼藍(lán)染色后用血細(xì)胞計數(shù)板進行計數(shù)及計算細(xì)胞活率，染色后細(xì)胞取樣計數(shù)3次；根據(jù)所測得的細(xì)胞密度進行細(xì)胞凍存，凍存液為：50%GT-T551 H3培養(yǎng)基，10%二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），40%FBS，凍存密度為8×106個/ml。NK細(xì)胞凍存3個月后37℃水浴解凍，取2×106個細(xì)胞加入1～2 ml生理鹽水，取200μl進行臺盼藍(lán)染色后用血細(xì)胞計數(shù)板進行計數(shù)及計算細(xì)胞存活率，染色后細(xì)胞取樣計數(shù)3次；同時取2×106個細(xì)胞離心去除凍存液并利用1～2 ml生理鹽水重懸4℃保存24 h后取200μl進行臺盼藍(lán)染色后用血細(xì)胞計數(shù)板進行計數(shù)及計算細(xì)胞存活率，染色后細(xì)胞取樣計數(shù)3次。

1.2.2 ELISA方法對新鮮及凍存的NK細(xì)胞進行IFN-γ分泌能力檢測 將新鮮NK細(xì)胞用無血清GT-T551 H3培養(yǎng)基稀釋至1×106個/ml，取2 ml接種6孔板，培養(yǎng)48 h后1 500 r/min離心5 min收取上清，-80℃冷凍保存；新鮮NK細(xì)胞凍存3個月后37℃水浴解凍進行計數(shù)，同樣將其用無血清GT-T551 H3培養(yǎng)基稀釋接種6孔板，培養(yǎng)48 h后離心收取培養(yǎng)上清，-80℃冷凍保存。

將IFN-γELISA檢測試劑盒室溫平衡20 min后，按照說明書加樣要求進行樣本加樣，最終利用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處各孔的OD值，利用標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而根據(jù)各孔對應(yīng)OD值計算出相應(yīng)濃度。

1.2.3 新鮮NK細(xì)胞與凍存NK細(xì)胞表面活化性受體表達(dá)差別分析 取培養(yǎng)第15天的新鮮NK細(xì)胞1 500 r/min離心5 min棄上清，用PBS重懸計數(shù)后取3×106個/ml制成密度為2×106個/ml的單細(xì)胞懸液，并將其平均分成3管，分別加入抗體IgG1-FITC、anti-NKG2D-FITC、anti-NCR2-FITC，4℃避 光 孵 育30 min，PBS洗滌細(xì)胞2次后進行流式細(xì)胞儀檢測。取凍存3個月的NK細(xì)胞進行37℃水浴解凍，PBS洗滌后制備單細(xì)胞懸液并進行流式細(xì)胞儀檢測，具體方法與新鮮NK細(xì)胞的檢測方法相同。

1.2.4 新鮮NK細(xì)胞與凍存NK細(xì)胞的腫瘤的殺傷效果對比研究 實驗分組：本研究共分為4組，分別為靶細(xì)胞對照組及3個實驗組，3個實驗組分別為E∶T［E∶T為效靶比，即NK細(xì)胞數(shù)（效應(yīng)細(xì)胞，E）與腫瘤細(xì)胞數(shù)（靶細(xì)胞，T）的比例］為20∶1組、10∶1組、5∶1組。

實驗過程為：肺癌細(xì)胞A549經(jīng)胰蛋白酶消化變圓后，用含10%FBS的DMEM終止后1 300 r/min離心5 min，去除上清，用新鮮培養(yǎng)基稀釋計數(shù)，最終稀釋成1×105個/ml。向E-Plate 16 PET板每孔中加入50μl培養(yǎng)基，于RTCA S16系統(tǒng)的檢測平臺上檢測基線，保證各孔的Cell Index低于0.063；取出E-Plate 16 PET并向孔中加入100μl A549細(xì)胞懸液，于RTCA檢測平臺上過夜培養(yǎng)。培養(yǎng)后的細(xì)胞分成4組，分別為E∶T=20∶1組、E∶T=10∶1組、E∶T=5∶1組及靶細(xì)胞對照組，每組2個平行孔。在腫瘤細(xì)胞接種約19 h時加入NK細(xì)胞。取培養(yǎng)第15天的新鮮NK細(xì)胞用腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞至4×106個/ml、2×106個/ml、1×106個/ml后，依次加入E∶T=20∶1組、E∶T=10∶1組、E∶T=5∶1組對應(yīng)孔中，細(xì)胞懸液量為50μl，靶細(xì)胞對照組中加入50μl培養(yǎng)基，實時觀察殺傷效果；NK細(xì)胞凍存3個月后，取出于37℃水浴中解凍，進行腫瘤殺傷效果檢測，檢測方法與新鮮NK細(xì)胞的腫瘤殺傷檢測方法相同。殺傷率（%）=［1-（效靶細(xì)胞作用孔Index值-效應(yīng)細(xì)胞孔Index值）］/靶細(xì)胞孔Index值×100%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 所有實驗數(shù)據(jù)按照±s顯示，通過統(tǒng)計學(xué)分析軟件SPSS13.0對數(shù)據(jù)進行獨立t檢驗和統(tǒng)計學(xué)意義分析，當(dāng)P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 新鮮NK細(xì)胞與凍存NK細(xì)胞存活率對比分析 本研究中，培養(yǎng)后的NK細(xì)胞存活率為（96.43±0.50）%，凍存NK細(xì)胞復(fù)蘇后的活率可達(dá)（92.17±1.37）%，復(fù)蘇后4℃保存24 h時活率仍可達(dá)（79.97±1.22）%，雖然復(fù)蘇后及復(fù)蘇后4℃保存24 h時NK細(xì)胞活率較凍存前有一定降低，但結(jié)果顯示所凍存的NK細(xì)胞仍可以滿足臨床要求的80%的細(xì)胞存活率，如圖1所示。

圖1 凍存前后NK細(xì)胞活率對比Fig.1 NK cells viability before and after freezing

2.2 新鮮及凍存NK細(xì)胞IFN-γ分泌能力檢測 利用無血清培養(yǎng)基對新鮮和復(fù)蘇NK細(xì)胞進行培養(yǎng)，細(xì)胞密度均為1×106個/ml，24 h后利用ELISA方法進行IFN-γ分泌量檢測，結(jié)果中，新鮮NK的IFN-γ分泌量為（5 967.0±517.8）pg/ml，凍存復(fù)蘇的NK細(xì)胞的表達(dá)量為（4 861.0±941.4）pg/ml，凍存NK細(xì)胞IFN-γ分泌能力較新鮮NK細(xì)胞有所降低，但未見顯著差異（P＞0.05），如圖2所示。

圖2 新鮮及凍存NK細(xì)胞IFN-γ分泌量Fig.2 IFN-γsecretion from fresh and frozen NK cells

2.3 新鮮NK細(xì)胞與凍存NK細(xì)胞表面活化性受體表達(dá)差別 由于NK細(xì)胞具有表達(dá)NCR2和NKG2D的性質(zhì)，并且NK細(xì)胞異體NCR2和NKG2D在識別、殺傷靶細(xì)胞中起重要作用，因此對凍存前后的細(xì)胞進行該功能驗證，流式細(xì)胞儀分析結(jié)果，如圖3所示，凍存復(fù)蘇的NK細(xì)胞與新鮮的NK細(xì)胞相比，NCR2未見明顯變化，而NKG2D的表達(dá)量卻有所增加，為新鮮NK的1.87倍。由此可見，凍存后NK細(xì)胞NCR2和NKG2D的表達(dá)未較凍存前降低。

圖3 新鮮NK細(xì)胞與凍存NK細(xì)胞表面活化性受體表達(dá)情況Fig.3 Activated receptor expression in fresh and frozen NK cells

2.4 新鮮NK細(xì)胞與凍存NK細(xì)胞的腫瘤的殺傷效果對比研究A549細(xì)胞接種量為10 000個/孔，效靶比為20∶1、10∶1、5∶1時觀察NK細(xì)胞對A549細(xì)胞的殺傷效果。結(jié)果顯示，新鮮NK細(xì)胞在曲線上96 h時，效靶比為20∶1、10∶1、5∶1的殺傷率分別為：（90.48±1.19）%、（79.16±1.79）%、（59.77±3.34）%；凍存NK細(xì)胞在曲線上96 h時，效靶比為20∶1、10∶1，5∶1的殺傷率分別為：（78.05±1.13）%，（69.78±1.65）%、（51.21±2.86）%。E∶T=20∶1時，新鮮NK對A549細(xì)胞的殺傷作用顯著高于凍存NK（t20∶1=7.593，P20∶1=0.016 9＜0.05）；E∶T=10∶1和5∶1時，兩組未見顯著差異（t10∶1=3.861，P10∶1=0.061 0＞0.05；t5∶1=1.947，P5∶1=0.190 9＞0.05），如圖4、圖5所示。

圖4 NK細(xì)胞對肺癌細(xì)胞A549的實時殺腫瘤效果Fig.4 Real-time killing effect of NK cells on lung cancer cells A549

圖5 96 h時NK細(xì)胞對人肺癌細(xì)胞A549的殺腫瘤效果Fig.5 Analysis of killing effect of NK cells on lung cancer cells A549 at 96 h

3 討論

2009年5月，國家衛(wèi)生監(jiān)管部門制定了《自體免疫細(xì)胞（T細(xì)胞、NK細(xì)胞）治療技術(shù)管理規(guī)范（征求意見稿）》，規(guī)范明確列出了回輸時細(xì)胞應(yīng)符合的最低臨床標(biāo)準(zhǔn)，包括細(xì)胞數(shù)量和存活率等指標(biāo)，其中要求回輸時的細(xì)胞存活率應(yīng)大于等于80%。本研究所凍存的NK細(xì)胞復(fù)蘇后活率可達(dá)（92.17±1.37）%，復(fù)蘇后4℃保存24 h后活率仍可達(dá)（79.97±1.22）%，說明所凍存的NK細(xì)胞可以滿足臨床要求的細(xì)胞存活率。

NK細(xì)胞活性受細(xì)胞膜上兩大類受體調(diào)控，抑制性受體和激活性受體，其中天然細(xì)胞毒性受體（NCR）和NKG2家族的NKG2D均為激活性受體［14］。自體NK回輸時，KIR可以識別自體細(xì)胞，抑制NK細(xì)胞的激活，而異體NK回輸時抑制作用較弱，因此異體NK細(xì)胞的活化性受體對治療起重要作用［15］。本研究中，凍存復(fù)蘇的NK細(xì)胞與新鮮的NK細(xì)胞相比，凍存后NK細(xì)胞NCR2和NKG2D的表達(dá)未較凍存前降低，說明凍存復(fù)蘇過程不會影響NK細(xì)胞表面相關(guān)活化型受體的表達(dá)。

NK細(xì)胞具有廣譜的腫瘤殺傷效果，殺傷機制包括：FasL與Fas相作用、穿孔素/顆粒酶作用、借助表面CD16與腫瘤特異性IgG發(fā)生的抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）、腫瘤凋亡相關(guān)因子（TNF-α、IFN-γ）的分泌作用［15-17］。DOMOGALA等［18］研究發(fā)現(xiàn)凍存的臍血CD34陽性細(xì)胞分化成NK細(xì)胞的能力未受凍存影響，HOLUBOVA等［19］的臨床前研究表明，凍存復(fù)蘇的NK細(xì)胞再iL-2激活后能表達(dá)NK細(xì)胞活化受體NKp44，NKG2D和CD25并對血液腫瘤細(xì)胞系K562具有細(xì)胞毒性作用。本研究則從人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549入手進行創(chuàng)新性研究，本研究發(fā)現(xiàn)，NK細(xì)胞在凍存后IFN-γ分泌能力較新鮮NK細(xì)胞有所降低，但未見顯著差異（P＞0.05），說明凍存不會對IFN分泌功能產(chǎn)生明顯影響，同時，NK細(xì)胞的腫瘤的殺傷研究發(fā)現(xiàn)，E∶T=10∶1和5∶1時，新鮮與凍存復(fù)蘇NK對A549細(xì)胞的殺傷作用未見顯著差異（均為P＞0.05）；同時對新鮮和凍存NK細(xì)胞在E∶T=20∶1，E∶T=10∶1和E∶T=5∶1這3種效靶比下的殺傷效果進行整體差異性分析，殺傷效果未見顯著性差異（P＞0.05），因此證明凍存復(fù)蘇的NK細(xì)胞對人肺癌細(xì)胞A549殺傷效能與新鮮NK接近。本研究也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)E∶T=20∶1時，新鮮NK對A549細(xì)胞的殺傷作用高于凍存NK，具有顯著性差異（P＜0.05），這可能是NK細(xì)胞凍存復(fù)蘇后部分凍存NK細(xì)胞死亡造成其對A549殺傷作用降低。在高效靶比的情況下，累積體現(xiàn)出來，該結(jié)果提示，未來在利用凍存復(fù)蘇的NK細(xì)胞進行高效靶比臨床腫瘤治療時，可通過適當(dāng)增加NK細(xì)胞數(shù)量，以達(dá)到更好的體內(nèi)與相應(yīng)新鮮NK細(xì)胞近似的腫瘤殺傷效果。本研究首次采用人肺癌細(xì)胞A549作為效應(yīng)細(xì)胞，報道了凍存復(fù)蘇的NK細(xì)胞與新鮮培養(yǎng)NK細(xì)胞的區(qū)別，結(jié)果將為凍存的同種異體NK細(xì)胞作為即用型產(chǎn)品進行患者治療提供有力支持。