miR-223對(duì)呼吸衰竭患者Th1/Th2細(xì)胞功能及免疫功能的影響①

萬程偉 李 銀 朱贊雷 許 碩 邱日皇 黎燕群 周建英 郭猷殫

（江西省贛州市人民醫(yī)院，贛州 341000）

近年來呼吸衰竭患者頻頻增加，以肺內(nèi)外各種原因引起的通氣和換氣功能嚴(yán)重障礙為其產(chǎn)生原因［1-2］。呼吸衰竭以呼吸困難、精神癥狀、循環(huán)癥狀和器官障礙等為主要臨床表現(xiàn)［3］。呼吸衰竭的病因主要由直接性肺損傷和間接性肺損傷構(gòu)成［4］。Th1/Th2細(xì)胞中，Th1細(xì)胞主要負(fù)責(zé)細(xì)胞免疫，而Th2細(xì)胞主要負(fù)責(zé)體液免疫［5-6］。miR-223以其在各種腫瘤及癌癥細(xì)胞中均存在異常表達(dá)等特點(diǎn)已然成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究的新方向和新思路，目前關(guān)于miR-223的報(bào)道主要集中在胃癌、結(jié)腸癌和內(nèi)皮細(xì)胞等方面，而對(duì)于miR-223表達(dá)對(duì)呼吸衰竭患者Th1/Th2細(xì)胞功能及免疫功能的影響缺乏相關(guān)討論和報(bào)道［7-9］。本研究分析miR-223對(duì)呼吸衰竭患者Th1/Th2細(xì)胞功能及免疫功能的影響，以期為呼吸衰竭患者的臨床治療和生物靶標(biāo)的選擇方面提供更多參考資料。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 選取2017年3月至2018年12月于江西省贛州市人民醫(yī)院收治的40例呼吸衰竭患者為呼吸衰竭（Respiratory failure）組（Ref）組，同期健康體檢者40例為Con組。Ref組和Con組的基本概況如表1所示。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合呼吸衰竭的診斷標(biāo)準(zhǔn)，動(dòng)脈血氧分壓（PaO2）＜8 kPa或動(dòng)脈血二氧化碳分壓（PaCO2）＞6.65 kPa。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他多種種類惡性腫瘤者；②免疫缺陷及自身免疫性疾病患者［10］。

表1 Ref組和Con組的基本概況（±s）Tab.1 Basic overview of Ref and Con groups（±s）

表1 Ref組和Con組的基本概況（±s）Tab.1 Basic overview of Ref and Con groups（±s）

Project Age（years）Gender Male Female Type of disease（case）TypeⅠTypeⅡCourse of disease（year）Ref group（n=40）63.21±5.32 27 13 10 30 6.32±2.14 Con group（n=40）63.38±5.44 26 14 t/χ2 0.45＞0.05 0.62＞0.05 P

1.1.2 主要儀器和試劑 快速總RNA提取試劑盒（Sigma，RNB100-50RXN）、NanoDrop 2000儀器（Thermo Scientific）、PrimeScript RT試劑盒（Takara Bio，RR047A）、Human IL-2 ELISA Kit（碧云天公司，PI580）、Human TNF alpha ELISA Kit（Abcam，ab181421）、Human IL-6 ELISA Kit（碧云天公司，PI330）、Human IL-4 ELISA Kit（碧云天公司，PI618）、Human IFN gamma ELISA Kit（Abcam，ab46025）、Human IL-10 ELISA Kit（碧云天公司，PI528）、Human IgA ELISA Kit（Thermo，88-50600-22）、Human IgM ELISA Kit（Thermo，BMS2091）、Human IgG ELISA Kit（Thermo，BMS2098）、PRISM 7900序列檢測(cè)系統(tǒng)（Applied Biosystems）、高通量測(cè)序儀（Life Technologies）、流式細(xì)胞儀（Sysmex Partec）。

1.2 方法 采用熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)測(cè)定miR-223的mRNA表達(dá)，以U6作為內(nèi)參，miR-223的引物設(shè)計(jì)如表2所示。采用PBMC法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，采用電穿孔順式轉(zhuǎn)染法將miR-223和對(duì)照組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入核細(xì)胞［11］。采用ELISA法測(cè)定miR-223對(duì)免疫功能的影響。采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定miR-223對(duì)Th1/Th2細(xì)胞的影響。采用ELISA法測(cè)定miR-223對(duì)Th1/Th2細(xì)胞因子的影響。

表2 miR-223引物設(shè)計(jì)Tab.2 Primer design of miR-223

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用t檢驗(yàn)實(shí)現(xiàn)兩組間比較，采用方差檢驗(yàn)實(shí)現(xiàn)多組間比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，數(shù)據(jù)均用SPSS22.0進(jìn)行軟件統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 miR-223 mRNA表達(dá)水平 由圖1可知，外周血中Ref組的miR-223 mRNA表達(dá)水平為（2.23±0.32），Con組的miR-223 mRNA表達(dá)水平為（1.06±0.26）（t=13.634，P＜0.01），故外周血Ref組的miR-223 mRNA表達(dá)水平相較Con組極顯著上調(diào)（P＜0.01）。細(xì)胞中Ref組的miR-223 mRNA表達(dá)水平為（1.73±0.24），Con組的miR-223 miRNA表達(dá)水平為（0.89±0.14）（t=11.224，P＜0.01），故細(xì)胞中Ref組的miR-223 mRNA表達(dá)水平相較Con組極顯著上調(diào)（P＜0.01）。

圖1 miR-223的mRNA表達(dá)水平Fig.1 Primer design of miR-223

2.2 miR-223對(duì)免疫球蛋白水平的影響 由圖2可知，Ref組的IgA水平為（1.54±0.15），Con組的IgA水平為（2.53±0.26）（t=8.112，P＜0.01），故Ref組的IgA水平相較Con組極顯著下調(diào)（P＜0.01）；Ref組的IgM水 平 為（8.87±0.91），Con組 的IgM水 平 為（14.29±1.43）（t=8.567，P＜0.01），故Ref組的IgM水平相較Con組極顯著下調(diào)（P＜0.01）；Ref組的IgG水平為（1.03±0.09），Con組的IgG水平為（2.08±0.22）（t=8.251，P＜0.01），故Ref組的IgG水平相較Con組極顯著下調(diào)（P＜0.01）。

圖2 miR-223對(duì)免疫球蛋白水平的影響Fig.2 Effect of miR-223 on immunoglobulin level

2.3 miR-223對(duì)Th1/Th2細(xì)胞的影響 由圖3和圖4可知，Ref組的Th1細(xì)胞水平為（24.14±2.33），Con組的Th1細(xì)胞水平為（36.61±3.26）（t=9.535，P＜0.01），故Ref組的Th1細(xì)胞水平相較Con組極顯著下調(diào)（P＜0.01）；Ref組的Th2細(xì)胞水平為（29.24±2.91），Con組的Th2細(xì)胞水平為（36.59±3.63）（t=9.251，P＜0.01），故Ref組的Th2細(xì)胞水平相較Con組極顯著下調(diào)（P＜0.01）。

圖3 miR-223對(duì)Th1細(xì)胞的影響Fig.3 Effect of miR-223 on Th1 cells

圖4 miR-223對(duì)Th2細(xì)胞的影響Fig.4 Effect of miR-223 on Th2 cells

2.4 miR-223對(duì)Th1/Th2細(xì)胞因子的影響 由圖5可知，Ref組的Th1類細(xì)胞因子IL-2水平為（6.23±0.46），Con組的IL-2水平為（4.24±0.26）（t=3.126，P＜0.05），故Ref組的IL-2水平相較Con組顯著上調(diào)（P＜0.05）；Ref組的Th1類細(xì)胞因子IFN-γ水平為（106.27±9.91），Con組的IFN-γ水平為（80.29±6.43）（t=3.558，P＜0.05），故Ref組的IFN-γ水平相較Con組顯著上調(diào)（P＜0.05）；Ref組的Th1類細(xì)胞因子TNF-α水平為（1.63±0.25），Con組的TNF-α水平為（0.83±0.12）（t=3.082，P＜0.05），故Ref組的TNF-α水平相較Con組顯著上調(diào)（P＜0.05）。

圖5 miR-223對(duì)Th1類細(xì)胞因子的影響Fig.5 Effect of miR-223 on Th1 cytokines

由圖6可知，Ref組的Th2類細(xì)胞因子IL-6水平為（67.68±9.57），Con組 的IL-6水 平 為（13.82±2.46）（t=13.286，P＜0.01），故Ref組的IL-6水平相較Con組極顯著上調(diào)（P＜0.01）；Ref組的Th2類細(xì)胞因子IL-10水平為（8.43±2.91），Con組的IL-10水平為（4.29±1.43）（t=3.466，P＜0.05），故Ref組的IL-10水平相較Con組顯著上調(diào)（P＜0.05）；Ref組的Th2類細(xì)胞因子IL-4水平為（56.63±8.25），Con組的IL-4水平為（36.83±6.12）（t=3.951，P＜0.05），故Ref組的IL-4水平相較Con組顯著上調(diào)（P＜0.05）。

圖6 miR-223對(duì)Th2類細(xì)胞因子的影響Fig.6 Effect of miR-223 on Th2 cytokines

3 討論

本研究以呼吸衰竭患者和健康體檢者作為考察對(duì)象，研究了miR-223對(duì)呼吸衰竭患者Th1/Th2細(xì)胞功能及免疫功能的影響。采用熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)測(cè)定miR-223的mRNA表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)外周血Ref組的miR-223 mRNA表達(dá)水平相較Con組極顯著上調(diào)（P＜0.01）；細(xì)胞中Ref組的miR-223 mRNA表達(dá)水平相較Con組極顯著上調(diào)（P＜0.01）。采用PBMC法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，采用電穿孔順式轉(zhuǎn)染法將miR-223和對(duì)照組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入核細(xì)胞。采用ELISA法測(cè)定miR-223對(duì)免疫功能的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ref組的IgA水平相較Con組極顯著下調(diào)（P＜0.01）；Ref組的IgM水平相較Con組極顯著下調(diào)（P＜0.01）；Ref組的IgG水平相較Con組極顯著下調(diào)（P＜0.01），說明miR-223可下調(diào)免疫球蛋白水平。采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定miR-223對(duì)Th1/Th2細(xì)胞的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ref組的Th1細(xì)胞水平相較Con組極顯著下調(diào)（P＜0.01）；Ref組的Th2細(xì)胞水平相較Con組極顯著下調(diào)（P＜0.01），說明miR-223可以下調(diào)Th1/Th2細(xì)胞水平。采用ELISA法測(cè)定miR-223對(duì)Th1/Th2細(xì)胞因子的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Th1類細(xì)胞因子中Ref組的IL-2水平相較Con組顯著上調(diào)（P＜0.05）；Ref組的IFN-γ水平相較Con組顯著上調(diào)（P＜0.05）；Ref組的TNF-α水平相較Con組顯著上調(diào)（P＜0.05）。Th2類細(xì)胞因子中Ref組的IL-6水平相較Con組極顯著上調(diào)（P＜0.01）；Ref組的IL-10水平相較Con組顯著上調(diào)（P＜0.05）；Ref組的IL-4平相較Con組顯著上調(diào)（P＜0.05），說明miR-223可以上調(diào)Th1/Th2細(xì)胞因子水平。

在某些國內(nèi)外的研究中，表明伴COPD呼吸衰竭患者的免疫功能降低，且隨著病情的加重，其受損越明顯，而這種免疫損傷則又會(huì)加重患者氣道阻塞的程度和肺功能損傷［12］。有中醫(yī)研究，伴COPDⅡ型呼吸衰竭的患者無論是緩解期還是急性發(fā)作期，其體內(nèi)免疫功能紊亂嚴(yán)重，認(rèn)為其發(fā)生機(jī)制也與機(jī)體的過度炎癥應(yīng)激有關(guān)［13-14］。有研究顯示多種炎癥因子與免疫細(xì)胞都與COPD伴呼吸衰竭有關(guān)，表明進(jìn)一步改善患者的T細(xì)胞和免疫因子水平，可提高患者細(xì)胞免疫功能，進(jìn)而利于病情的恢復(fù)［13］。且更有研究指出通過某些改善免疫功能的藥物進(jìn)行治療，患者的肺功能、氧功能和T細(xì)胞免疫功能的臨床療效極好，且安全性高［15］。呼吸衰竭以其對(duì)循環(huán)和代謝的阻滯對(duì)胃腸道功能也會(huì)產(chǎn)生影響［16］。SWAYNE等［17］研究體外膜肺氧合（ECMO）的利用率發(fā)現(xiàn)，ECMO的使用和接受ECMO治療的呼吸衰竭患者的老年、使用皮質(zhì)類固醇、連續(xù)性腎臟替代治療、駕駛壓力和ECMO持續(xù)時(shí)間延長與死亡率增加有關(guān)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，減少PaCO2的高強(qiáng)度無創(chuàng)通氣可改善健康相關(guān)質(zhì)量生命、降低高碳酸血癥慢性阻塞性肺病、高碳酸血癥患者的惡化頻率和死亡率［18］。通過減少高碳酸血癥，還可以改善CO2誘導(dǎo)的免疫抑制并改善抗菌和抗病毒宿主防御。EVERED等［19］研究發(fā)現(xiàn)術(shù)后呼吸衰竭（PRF）是肝移植術(shù)后嚴(yán)重的肺部并發(fā)癥（LTx）。在預(yù)測(cè)PRF的層次多因素模型的頂部，存在與天然肝臟、新肝臟、肺部表現(xiàn)相關(guān)的因素。移植前供體依賴因子、腎臟、心臟和大腦對(duì)早期呼吸恢復(fù)和LTx患者的ICU狀態(tài)沒有影響。具有高M(jìn)ELD和/或限制性呼吸模式和/或門靜脈血栓形成的患者預(yù)后不良，最終可能因早期同種異體移植物功能障礙而惡化。UTAMI等［20］研究發(fā)現(xiàn)破傷風(fēng)最常見的死亡原因是導(dǎo)致呼吸衰竭的氣道問題，及時(shí)插管并給予呼吸機(jī)支持以及阿米卡星抗生素注射液有助于康復(fù)。WANG等［21］研究新生兒低氧呼吸衰竭（NRF）發(fā)現(xiàn)，與NRF＜50例/年的新生兒重癥監(jiān)護(hù)病房相比，新生兒重癥監(jiān)護(hù)病房發(fā)病率，NRF/新生兒重癥監(jiān)護(hù)病房入院率和呼吸機(jī)使用量增加數(shù)倍，死亡率降低。NRF死亡率與每個(gè)類別中極低出生體重患者的比例無關(guān)。新生兒重癥監(jiān)護(hù)病房的新生兒入院量較小，呼吸機(jī)使用量減少，SNAPPE-Ⅱ評(píng)估的死亡風(fēng)險(xiǎn)較高。SHINICHIRO等［22］研究體外膜肺氧合（ECMO）發(fā)現(xiàn)，流感相關(guān)急性呼吸衰竭的發(fā)生率、嚴(yán)重程度、特征和預(yù)后與呼吸機(jī)以及ECMO設(shè)置相關(guān)?？刂婆_(tái)、回路、充氧器、離心泵和插管的類型發(fā)生的顯著變化導(dǎo)致使用ECMO是流感相關(guān)急性呼吸衰竭患者總體生存率更高的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。

綜上所述，miR-223可以下調(diào)呼吸衰竭患者的免疫球蛋白水平和Th1/Th2細(xì)胞水平，并且上調(diào)Th1/Th2細(xì)胞因子水平，但其相關(guān)分子機(jī)制與靶標(biāo)還需要進(jìn)一步研究。