US31介導(dǎo)人巨細(xì)胞病毒調(diào)控系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)生的機(jī)制研究①

劉春雅 金 晶 李玉芳 喻 敏 姜 毅 徐利鴛（衢州市人民醫(yī)院腎內(nèi)科，衢州 324000）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種典型的自身免疫性疾病，在育齡女性中的發(fā)病率逐年升高，嚴(yán)重影響人們的正常生活，SLE患者病情呈現(xiàn)穩(wěn)定和活動(dòng)交替的狀態(tài)，尚無(wú)根治方法，且存在一定程度的致殘率和病死率［1］。體內(nèi)凋亡過(guò)程受損、先天和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)過(guò)度激活、補(bǔ)體激活、免疫復(fù)合物和組織炎癥的復(fù)雜相互作用最終導(dǎo)致自我維持的自身免疫性過(guò)程［2］。但迄今為止SLE的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。因此，探索SLE的發(fā)病機(jī)制，可為SLE防治提供新的思路和策略，是近年的研究熱點(diǎn)。

SLE是一種復(fù)雜的疾病，采用免疫抑制的治療方式是該疾病的首選治療方案［3］。細(xì)胞介導(dǎo)免疫是控制皰疹病毒感染的重要舉措，IFN-γ也被認(rèn)為在此過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［4］。事實(shí)上，由于這種免疫抑制，SLE患者感染風(fēng)險(xiǎn)增加，嚴(yán)重影響其預(yù)后［5］。在不同的病原體中，病毒感染效率不同，如人巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）和EB病毒（EBV）與SLE的發(fā)生密切相關(guān)，這些病毒屬于皰疹病毒科，可使病程復(fù)雜化［6-7］。除外中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，HCMV幾乎可感染內(nèi)、中、外胚層起源的所有細(xì)胞［8］。隨著研究的深入，許多證據(jù)均提示，人群普遍感染的HCMV可能是SLE的一個(gè)重要病因，并加重SLE疾病的進(jìn)程［9］。但HCMV調(diào)控SLE發(fā)生的具體機(jī)制尚未闡明。此外，HCMV和EBV均可引起疾病暴發(fā)，并已在SLE的致病過(guò)程中得到證實(shí)［10］。有研究認(rèn)為EBV可通過(guò)核抗原與自身抗原交叉反應(yīng)的分子結(jié)合誘導(dǎo)SLE，而HCMV可通過(guò)分子模擬、表位擴(kuò)散和抗原結(jié)合誘導(dǎo)免疫反應(yīng)引起自身免疫［11-12］。在這種情況下，免疫系統(tǒng)抵抗病毒感染的作用至關(guān)重要。

本研究旨在探索HCMV調(diào)控SLE發(fā)生的具體機(jī)制，為闡明SLE的發(fā)生機(jī)理奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為SLE的有效治療提供一定的臨床應(yīng)用方向。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 樣本來(lái)自溫州醫(yī)科大學(xué)的60例SLE患者和111例健康志愿者，受試者均知情同意；THP1單核細(xì)胞、THP1源性的巨噬細(xì)胞均購(gòu)自溫州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要試劑與儀器 抗體滴度檢測(cè)試劑盒（藍(lán)波生物公司）；PAXgene Blood RNA Kit（君諾德生物公司）；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo Fisher）；TB Green（TaKaRa）；US31過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（捷瑞生物）；重組腺病毒包裝體系質(zhì)粒（中科院上海生化所）；Lipofectamine?2000（Sigma）；p100、US31、NF-κB2 p52、ReIB、GAPDH蛋白（Abclonal）；蛋白核質(zhì)分離試劑盒（天根生物）；MG132蛋白酶抑制劑（碧云天生物）；PEI、PEG8000（生工）；引物合成（華大基因）。

1.2 方法

1.2.1 血清抗-HCMV IgG與IgM抗體滴度檢測(cè)

采用金標(biāo)免疫斑點(diǎn)法進(jìn)行抗體滴度檢測(cè)，先將待測(cè)血清用緩沖液稀釋為1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320等不同的梯度，然后按照抗體滴度檢測(cè)試劑盒內(nèi)說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.2 外周血白細(xì)胞HCMV檢測(cè)陽(yáng)性率 梯度離心法分離外周血中的白細(xì)胞，試劑盒提取外周血白細(xì)胞中的總RNA，巢式PCR檢測(cè)外周血白細(xì)胞中HCMV UL55基因表達(dá)，如若UL55基因有表達(dá)即視為陽(yáng)性，UL55基因沒(méi)有表達(dá)即視為陰性。引物序列見(jiàn)表1。

表1 巢式PCR引物序列Tab.1 Nested PCR primer sequences

1.2.3 RT-PCR檢測(cè)SLE患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中HCMV病毒基因表達(dá) 梯度離心法分離SLE患者外周血中的白細(xì)胞，試劑盒提取外周血中的總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳篩選相對(duì)特異性高表達(dá)的病毒基因。篩選得到的11個(gè)在SLE患者中相對(duì)特異性高表達(dá)的病毒基因，引物序列見(jiàn)表2。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)SLE患者PBMC中US31表達(dá)水平 梯度離心法分離SLE患者外周血中的白細(xì)胞，試劑盒提取外周血中的總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，實(shí)驗(yàn)分析 采用相對(duì)定量 法，運(yùn)用2-ΔΔCt計(jì) 算UL31表達(dá)。UL31引物序列見(jiàn)表2。

表2 PCR引物序列Tab.2 PCR primer sequences

1.2.5 構(gòu)建過(guò)表達(dá)US31蛋白的重組腺病毒（AdUS31） 選用10μg AAV、Helper、AAV shuttle vector質(zhì)粒的腺病毒包裝體系，加入100μl PEI轉(zhuǎn)染293T工具細(xì)胞。60 h后收集病毒上清，低溫離心后，上清用PEG8000（40%）濃縮，殘留的細(xì)胞采用反復(fù)凍融裂解，將濃縮的上清和凍融的細(xì)胞懸液混勻，添加1 mmol/L MgCl2和25 U/ml Benzonase混勻后，37℃靜置1 h，低溫離心后，取上清。利用17%、25%、40%、60%濃度梯度的碘克沙醇濃縮純化病毒。使用qPCR方法進(jìn)行病毒滴度測(cè)定。

1.2.6 重組腺病毒（AdUS31）感染THP1單核細(xì)胞或THP1源性的巨噬細(xì)胞 待THP1單核細(xì)胞或THP1源性的巨噬細(xì)胞生長(zhǎng)至70%密度時(shí)開(kāi)始感染病毒，病毒感染滴度為1×1011GC/ml，病毒感染72 h結(jié)束實(shí)驗(yàn)。

1.2.7 免疫共沉淀（Co-IP）檢測(cè)NF-κB2與US31的相互作用 收集3×106個(gè)細(xì)胞加入裂解液并反復(fù)凍融使細(xì)胞充分裂解，離心取上清后，每1×107個(gè)細(xì)胞加入2.5μl抗體（IgG作為陰參）4℃孵育過(guò)夜，第2天加入20μl Protein A+G bead Agarose 4℃孵育2 h，離心去除上清，加入wash buffer反復(fù)清洗Protein A+G bead Agarose，最終EP管中留20μl樣本，加入loading buffer，煮沸，吸取上清，進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)。

1.2.8 細(xì)胞水平轉(zhuǎn)染si-NF-κB2待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%覆蓋面積時(shí)換無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓處理6 h以便siRNA可以更好地進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，參照說(shuō)明書(shū)步驟操作，先將siRNA（對(duì)照組為NC）儲(chǔ)液、Lipofectamine?2000和培養(yǎng)基室溫預(yù)混20 min后，配制成所需的工作液。棄去原饑餓培養(yǎng)基，將混合液加入培養(yǎng)板中，輕輕混勻。將培養(yǎng)板放入37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。8 h后換成無(wú)血清培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。siRNA si-NF-κB2正義鏈序列：5'-GAACAGCCTTGCATCTAGCC-3'，反義鏈序列：5'-CAGAGTCCGAGTCGCTATCA-3'。

1.2.9 RT-qPCR檢測(cè)單核巨噬細(xì)胞過(guò)表達(dá)US31抑制NF-κB2后炎癥相關(guān)基因表達(dá) 重組腺病毒（AdUS31）感染單核巨噬細(xì)胞24 h后，轉(zhuǎn)染siRNA抑制NF-κB2表達(dá)，于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至72 h實(shí)驗(yàn)結(jié)束。Trizol法提取細(xì)胞中的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行RT-qPCR，引物序列見(jiàn)表3。

表3 qPCR引物序列Tab.3 qPCR primer sequences

1.2.1 0蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn) 在細(xì)胞培養(yǎng)板中加入Western裂解液將細(xì)胞充分裂解，離心取上清棄沉淀，用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定總蛋白濃度并調(diào)整各組濃度統(tǒng)一，蛋白加入5×Loading buffer（含β-巰基乙醇）熱煮變性，配制SDS-PAGE凝膠，蛋白電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。加入稀釋后的一抗：P-p100（Abclonal，1∶1 000）、p100（Abclonal，1∶1 000）、US31（Abcam，1∶1 000）、P52（Abclonal，1∶1 000）、Re1B（Abclonal，1∶1 000）、Ub（Abcam，1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000），于4℃搖床孵育過(guò)夜。次日置于HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（Jackson，1∶10 000）室溫孵育2 h，ECL發(fā)光試劑盒顯影，Image J分析蛋白條帶的灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)記錄為±s。通過(guò)單因素方差分析及獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)確定組間統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。P＜0.05定義為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCMV感染與SLE相關(guān)

2.1.1 SLE患者抗-HCMV抗體水平明顯高于健康志愿者SLE患者的抗HCMV-IgG（圖1A）及IgM（圖1B）抗體滴度均明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）。

圖1 SLE患者與健康志愿者血清抗-HCMV IgG與IgM抗體滴度比較Fig.1 Comparison of serum anti-HCMV IgG and IgM antibody titers between SLE patients and healthy volunteers

2.1.2 SLE患者外周血白細(xì)胞HCMV檢測(cè)陽(yáng)性率明顯高于健康志愿者 巢式PCR結(jié)果顯示，SLE患者外周血中HCMV檢出率明顯高于對(duì)照組（P＜0.001），其陽(yáng)性率分別為41.7%和1.80%。見(jiàn)表4。

表4 SLE患者與健康志愿者HCMV陽(yáng)性率比較表Tab.4 Comparison of HCMV positive rates between SLE patients and healthy volunteers

2.2 US31是SLE相關(guān)的HCMV病毒基因 采用全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和mRNA測(cè)序聚類(lèi)分析后共鑒定出11個(gè)在SLE患者中相對(duì)特異性高表達(dá)的病毒基因：UL32、UL36、UL44、UL50、UL56、UL82、UL84、UL95、UL105、UL117及US31（圖2）。在11個(gè)SLE患者相對(duì)特異性高表達(dá)的HCMV病毒基因中，進(jìn)一步通過(guò)RT-PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SLE患者PBMC中US31表達(dá)水平明顯高于健康志愿者（圖3）。

圖2 SLE患者PBMC中HCMV病毒基因表達(dá)譜的檢測(cè)Fig.2 Detection of HCMV virus gene expression profiles in PBMC of SLE patients

圖3 US31是SLE患者PBMC特異高表達(dá)的HCMV基因Fig.3 US31 is HCMV gene specifically and highly expressed in PBMC of SLE patients

2.3 US31過(guò)表達(dá)促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)構(gòu)建過(guò)表達(dá)US31的重組腺病毒（AdUS31），感染THP1單核細(xì)胞和THP1源性的巨噬細(xì)胞，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及RT-PCR分析US31基因?qū)魏?巨噬細(xì)胞功能的影響。結(jié)果顯示，與對(duì)照組（感染AdGFP腺病毒）相比，THP1單核細(xì)胞和THP1源性的巨噬細(xì)胞感染AdUS31后分別有133和92個(gè)基因的表達(dá)發(fā)生改變（圖4A、B），進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)16個(gè)在US31過(guò)表達(dá)后上調(diào)的M1型相關(guān)基因（圖4C）。

圖4 US31基因表達(dá)促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞功能和表型Fig.4 US31 gene expression promotes the function and phenotype of M1 macrophages

2.4 US31與NF-κB2相互作用促進(jìn)NF-κB2通路活化 將US31抗體和NF-κB2抗體進(jìn)行免疫共沉淀（Co-IP）實(shí)驗(yàn)，篩選與US31相互作用的蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)p100和p52均可與US31相互作用（圖5A、B）。

細(xì)胞水平感染過(guò)表達(dá)US31蛋白的重組腺病毒，免疫印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)US31表達(dá)量升高，說(shuō)明細(xì)胞水平感染實(shí)驗(yàn)成功，并且過(guò)表達(dá)US31蛋白的重組腺病毒有效，利用siRNA抑制NF-κB2表達(dá)時(shí)，通過(guò)免疫印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，US31表達(dá)沒(méi)有變化，但磷酸化的前體p100水解成的激活狀態(tài)p52表達(dá)水平降低，RelB表達(dá)量降低。熒光定量PCR結(jié)果表明，細(xì)胞在感染過(guò)表達(dá)US31蛋白的重組腺病毒后，炎癥相關(guān)基因TNF-α、IL-8、CCL2、ICAM1表達(dá)量明顯升高，但共轉(zhuǎn)染NF-κB2的siRNA后，炎癥相關(guān)基因表達(dá)明顯降低，說(shuō)明NF-κB2是US31促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的相互作用蛋白（圖5C）。

細(xì)胞水平感染過(guò)表達(dá)US31蛋白的重組腺病毒后，分離細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)，免疫印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，US31蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，并且在感染過(guò)表達(dá)US31蛋白的重組腺病毒后，US31蛋白表達(dá)明顯升高，p100表達(dá)量降低（圖5D）。

圖5 US31與NF-κB2相互作用促進(jìn)NF-κB2通路活化Fig.5 US31 interacts with NF-κB2 to promote activation of NF-κB2 pathway

細(xì)胞水平感染過(guò)表達(dá)US31蛋白的重組腺病毒時(shí)同時(shí)添加MG132蛋白酶抑制劑，免疫印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相較于未添加抑制劑組，添加抑制劑組的US31表達(dá)降低，磷酸化p100表達(dá)量升高（圖5E）。US31表達(dá)促進(jìn)磷酸化的p100泛素化（圖5F）。

3 討論

既往研究發(fā)現(xiàn)，HCMV誘導(dǎo)單核細(xì)胞死亡，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，影響SLE的發(fā)生和發(fā)展［13］。此外，對(duì)感染的單核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序表明，HCMV參與重編程單核細(xì)胞向M1巨噬細(xì)胞分化［14］。然而，目前關(guān)于SLE患者PBMC中HCMV基因表達(dá)的研究尚不明確。采用全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和mRNA測(cè)序聚類(lèi)分析SLE患者PBMC中HCMV病毒基因表達(dá)譜，更加全面可靠地找出差異基因，共鑒定出11個(gè)在SLE患者中相對(duì)特異性高表達(dá)的病毒基因。

本研究發(fā)現(xiàn)，鑒定出的11個(gè)在SLE患者中相對(duì)特異性高表達(dá)的病毒基因都已被證明與HCMV潛伏有關(guān)［15］。例如，UL32是一種主要的被膜蛋白，參與病毒的組裝、成熟和釋放、基因的表達(dá)和調(diào)節(jié)以及宿主細(xì)胞周期的修飾和蛋白質(zhì)的合成，并且與HCMV潛伏期過(guò)程延長(zhǎng)有關(guān)［16］。另外，UL36參與細(xì)胞凋亡、基因表達(dá)調(diào)控和編碼有毒蛋白過(guò)程，UL44、UL50、UL56、UL82、UL84、UL95、UL105和UL117也與病毒潛伏過(guò)程有關(guān)［16-23］。因此，HCMV在SLE患者PBMC中處于潛伏感染狀態(tài)。

研究者使用HCMV潛伏感染CD34+細(xì)胞的體外模型，隨后使用HCMV cDNA的微陣列模型發(fā)現(xiàn)68個(gè)與HCMV生產(chǎn)性感染不同的基因［16］。同樣，也有研究者使用基因陣列來(lái)評(píng)估潛伏的HCMV感染的骨髓細(xì)胞中的病毒基因表達(dá)，觀(guān)察到37個(gè)差異表達(dá)的基因［24］。最后，對(duì)實(shí)驗(yàn)和自然HCMV CD14+單核細(xì)胞和CD34+細(xì)胞感染的HCMV基因轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行高通量測(cè)序分析，共檢測(cè)到20個(gè)基因發(fā)生變化［19］。與既往研究者發(fā)現(xiàn)的差異基因相比，本研究中只發(fā)現(xiàn)11個(gè)差異表達(dá)的基因，這種研究結(jié)果的差異可能是由于檢測(cè)方法、研究對(duì)象和實(shí)驗(yàn)性及自然HCMV感染模式的不同。此外，本研究結(jié)果表明US31是一種與SLE疾病相關(guān)的基因，在既往研究中沒(méi)有涉及。

然而，本研究分析的US31基因目前還沒(méi)有被報(bào)道過(guò)功能，由于先前有報(bào)道稱(chēng)HCMV增殖相關(guān)的IE2 86基因可通過(guò)抑制US31基因的表達(dá)抑制HCMV細(xì)胞的增殖，因此猜測(cè)US31可能是HCMV增殖期相關(guān)的基因［25］。由于US31表達(dá)量不高，大眾的關(guān)注度也不高，既往研究基本未涉及US31的報(bào)道［16，24］。但本研究數(shù)據(jù)表明，與健康對(duì)照組相比，SLE患者的US31基因表達(dá)陽(yáng)性率確實(shí)更高，并已通過(guò)qPCR得到證實(shí)。表明US31表達(dá)與SLE的發(fā)生密切相關(guān)。

有研究報(bào)道US31在HCMV感染的單核細(xì)胞來(lái)源的DCs、M1和M2細(xì)胞中高表達(dá)［26］。為了探討US31在單巨噬細(xì)胞中的功能，本研究使用編碼US31蛋白的重組腺病毒感染THP-1細(xì)胞和THP-1來(lái)源的巨噬細(xì)胞后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，隨后的生物信息學(xué)分析顯示，US31主要參與炎癥反應(yīng)和M1巨噬細(xì)胞表型形成過(guò)程。結(jié)合Co-IP實(shí)驗(yàn)和小干擾RNA沉默實(shí)驗(yàn)，確定了NF-κB2與US31直接相互作用調(diào)控單巨噬細(xì)胞的免疫功能。

NF-κB調(diào)節(jié)的關(guān)鍵基因參與細(xì)胞的增殖、凋亡及炎癥反應(yīng)過(guò)程［27］。非經(jīng)典的NF-κB信號(hào)通路通過(guò)磷酸化p100的多聚泛素化和蛋白酶體激活RelB/p52 NF-κB復(fù)合體［28］。本研究發(fā)現(xiàn)US31過(guò)表達(dá)不僅促進(jìn)了p100向p52的轉(zhuǎn)化和RelB/p52復(fù)合物向細(xì)胞核的移位，還上調(diào)了RelB和p100的表達(dá)，當(dāng)US31過(guò)表達(dá)時(shí)，磷酸化和泛素化的p100在蛋白酶體抑制劑MG132存在的情況下表達(dá)量升高，在轉(zhuǎn)染NF-κB2的siRNA后，炎癥相關(guān)因子TNF-α、IL-8、CCL2、ICAM1表達(dá)降低。這些結(jié)果表明，HCMV誘導(dǎo)US31的表達(dá)可能通過(guò)與NF-κB2通路相互聯(lián)系直接改變炎癥相關(guān)疾病基因的表達(dá)。

綜上所述，本研究首次對(duì)SLE患者外周血中HCMV基因的表達(dá)進(jìn)行了系統(tǒng)全面的研究，發(fā)現(xiàn)US31表達(dá)可改變單核巨噬細(xì)胞的免疫功能，促進(jìn)M1炎癥反應(yīng)。這一機(jī)制的闡明為SLE新的治療方案的開(kāi)發(fā)提供了有價(jià)值的見(jiàn)解，最終的目標(biāo)是治療和預(yù)防這種流行的自身免疫性疾病的發(fā)展。