特發(fā)性肺纖維化患者血清lncRNA PCGEM1表達(dá)水平及意義分析

許玉妮 曹曉強(qiáng) 孫鴻高 陳 林 王朝英 林 翀

（海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院檢驗科，?？?570203）

特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種原因不明的致命性間質(zhì)性肺炎，患者以慢性、進(jìn)行性、不可逆轉(zhuǎn)、高度異質(zhì)性的肺實質(zhì)損害和纖維化為主要臨床特征，以彌漫性的肺泡炎、肺實質(zhì)炎癥、肺間質(zhì)膠原過度沉積、纖維母細(xì)胞過度增生為主要病理特點?；颊叩呐R床常見癥狀為漸進(jìn)性勞力性氣急、干咳、雙下肺吸氣末捻發(fā)音、呼吸困難、低氧血癥、乏力，晚期可因發(fā)生呼吸功能衰竭而死亡，CT掃描可見胸膜下、兩肺基底部網(wǎng)格狀陰影和蜂窩影，肺功能檢查顯示限制性通氣和彌散功能障礙［1-3］。IPF多發(fā)于老年人群，在50歲以下人群中極少發(fā)病，男性發(fā)病率明顯高于女性，IPF在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率約為（3～6）/10萬人，但有的地區(qū)可高達(dá)（13～20）/10萬人，且呈現(xiàn)逐年上升的趨勢。IPF具有進(jìn)展迅速、致死率高、預(yù)后較差的特點，患者的中位生存期多為確診后的2.5～3.5年，五年生存率僅為20%～40%［4］。IPF的發(fā)病機(jī)制目前尚未闡明，主要原因是肺部慢性炎癥損傷所致肺纖維化，因此臨床上一般應(yīng)用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑或細(xì)胞毒制劑等進(jìn)行抗炎治療。隨著臨床研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)僅有20%的IPF患者對糖皮質(zhì)激素治療敏感，而且常常為過性反應(yīng)，免疫抑制劑及細(xì)胞毒性藥物不僅存在嚴(yán)重的副反應(yīng)，而且對IPF治療效果極小，臨床上尚無對IPF有特效的治療方案，加之IPF早期缺乏特異性臨床表現(xiàn)，故診斷和治療難度均較高［5-7］。近年來的研究結(jié)果顯示，IPF的發(fā)病不僅與肺部的慢性炎癥反應(yīng)有關(guān)，而且還與免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞等相關(guān)細(xì)胞、多種細(xì)胞因子及相關(guān)生物信號通路的病理變化有關(guān)，IPF與肺癌一樣，表觀遺傳學(xué)的改變和基因突變、非編碼RNA的異常表達(dá)等機(jī)制均在其發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮著重要的作用［8］。微小RNA和lncRNA等非編碼RNA在人類基因組中的占比高達(dá)75%以上，它們最開始被認(rèn)為是不具有任何功能的基因噪聲，但隨著研究的深入，非編碼RNA的重要作用逐漸被重視，lncRNA是指長度大于200個堿基的非編碼RNA，它能夠在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、表觀遺傳等多個水平對相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)揮調(diào)控作用，從而廣泛參與基因組印跡、染色體重塑、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾等多種生物學(xué)過程并發(fā)揮重要的調(diào)控作用，具有多重的生物學(xué)效應(yīng)。PCGEM1是一種特異性表達(dá)于前列腺的基因，位于染色體2q32位點，也是在前列腺癌中發(fā)現(xiàn)的第1個腫瘤相關(guān)lncRNA，近年來的研究結(jié)果顯示，PCGEM1的減弱凋亡反應(yīng)、促進(jìn)細(xì)胞增殖的功能不僅與腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)，而且還與成纖維細(xì)胞功能亢進(jìn)有關(guān)，故可能與IPF的發(fā)生也存在關(guān)聯(lián)，但目前學(xué)術(shù)界尚未見針對lncRNA PCGEM1與IPF關(guān)系的專題性研究，基于這一研究現(xiàn)狀，本研究對IPF患者血清lncRNA PCGEM1表達(dá)水平及意義進(jìn)行了觀察和分析。

1 資料與方法

1.1 資料 選取2018年3月至2019年3月收治的106例IPF患者作為病例組，納入患者均符合中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會間質(zhì)性肺疾病學(xué)組2016年制訂的《特發(fā)性肺纖維化診斷和治療中國專家共識》中的IPF診斷標(biāo)準(zhǔn)［9］，患者均存在限制性通氣功能障礙、氣體交接障礙等肺功能異常表現(xiàn)，均經(jīng)查問病史及臨床檢查排除已知原因引起的間質(zhì)性肺疾病，胸部影像學(xué)檢查顯示雙肺出現(xiàn)網(wǎng)狀改變、蜂窩肺，可伴有磨玻璃影，部分病例查體雙肺可聞及吸氣性啰音?；颊叩牟〕虨?～20個月，平均病程為（8.56±4.48）個月。選取100名健康體檢患者作為對照組，納入研究對象均經(jīng)臨床檢查排除心肺疾病、惡性腫瘤、腦卒中、肝腎功能不全，肺部影像學(xué)檢查及肺功能檢查均未見異常。兩組研究對象均排除合并有急慢性感染者、入組前2個月內(nèi)具有應(yīng)用免疫抑制劑和皮質(zhì)類固醇激素者、合并支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、支氣管擴(kuò)張等其他肺部疾病者。兩組研究對象在性別、年齡方面、吸煙者比例、吸煙指數(shù)等方面的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。兩組研究對象均對本研究知情并簽署知情同意書，本研究方案經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核通過。

表1 特發(fā)性肺纖維化患者基礎(chǔ)資料［（±s，例（%）］Tab.1 Basic data for patients with idiopathic pulmonary fibrosis［（±s，n（%）］

表1 特發(fā)性肺纖維化患者基礎(chǔ)資料［（±s，例（%）］Tab.1 Basic data for patients with idiopathic pulmonary fibrosis［（±s，n（%）］

Groups Case Control t/χ2 P n 106 100 Gender（male/female）65/41 62/38 0.010 0.920 Age（years）65.51±8.06 66.13±7.92 0.556 0.438 Ratio of smoker 45（42.45）44（44.00）0.050 0.823 Smoking index（cigarette×year）100 2.23±22.36 100 9.56±31.71 1.263 0.092

1.2 觀察指標(biāo)和檢測方法 采集兩組研究對象的空腹外周靜脈血樣本，于室溫下靜置放置1 h后3 000 r/min離心10 min后分離血清，置于-80℃冰箱中保存待測，應(yīng)用Trizol試劑提取總RNA，經(jīng)DNA酶處理后應(yīng)用ReverTra Ace qPCR RT Kit反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，置于-20℃冰箱中保存待測，應(yīng)用實時定量熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR法）對血清樣本中的lncRNA PCGEM1相對表達(dá)量進(jìn)行檢查和比較，以GAPDH為內(nèi)參，目標(biāo)RNA的引物序列見表2，反應(yīng)體系見表3。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min，95℃5 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共反應(yīng)40個循環(huán)。讀取待測lncRNA與內(nèi)參的循環(huán)閾值（Ct值），并計算兩者Ct值的差值（ΔCt值），以2-ΔΔCt法表示待測lncRNA的相對表達(dá)量。采集兩組研究對象的動脈血樣本，應(yīng)用動脈血氣分析儀（丹麥雷度公司生產(chǎn)）對動脈血氧分壓（PaO2）、氧飽和度（SaO2）、二氧化碳分壓（PaCO2）進(jìn)行檢測和比較。應(yīng)用肺功能檢測儀（日本福田公司生產(chǎn)）對兩組研究對象的用力肺活量（FCV）、第一秒用力呼氣容積（FEV1）、一氧化碳彌散量占預(yù)計值的百分比（DLCO%）、肺總量（TLC）進(jìn)行檢測和比較。

表2 目標(biāo)RNA的引物序列Tab.2 Sequences of primers of target RNAs

表3 RT-qPCR的反應(yīng)體系構(gòu)成Tab.3 Contents of reaction system of RT-qPCR

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用±s表示，兩組之間比較采用獨立樣本t檢驗進(jìn)行處理，lncRNA PCGEM1診斷IPF的價值分析采用受試者工作特征曲線（ROC曲線）進(jìn)行處理，以曲線下面積（AUC）衡量診斷價值，取Youden指數(shù)最大時為最佳篩選界值（Cut-off值），lncRNA PCGEM1與動脈血氣指標(biāo)、肺功能指標(biāo)的相關(guān)性分析采用直線相關(guān)分析進(jìn)行處理，均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組研究對象血清lncRNA PCGEM1相對表達(dá)量、動脈血氣指標(biāo)、肺功能指標(biāo)的比較 病例組患者的lncRNA PCGEM1相對表達(dá)量、動脈血氣PaO2、SaO2、肺功能指標(biāo)均低于對照組，動脈血PaCO2高于對照組，兩組之間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表4 血清lncRNA PCGEM1相對表達(dá)量、動脈血氣指標(biāo)、肺功能指標(biāo)檢測結(jié)果（±s）Tab.4 Relative expression of serum lncRNA PCGEM1，arterial blood gas indicators and pulmonary function indicators between subjects in two groups（±s）

表4 血清lncRNA PCGEM1相對表達(dá)量、動脈血氣指標(biāo)、肺功能指標(biāo)檢測結(jié)果（±s）Tab.4 Relative expression of serum lncRNA PCGEM1，arterial blood gas indicators and pulmonary function indicators between subjects in two groups（±s）

Groups Case Control tP n 106 100 lncRNA PCGEM1（2-ΔΔCt）52.76±28.87 99.27±47.12-8.481＜0.001 PaO2（mmHg）62.05±5.93 83.35±3.31-31.575＜0.001 SaO2（%）91.44±2.77 96.61±0.89-17.815＜0.001 PaCO2（mmHg）40.42±2.21 37.96±3.38 6.144 0.001 FVC（%）55.40±5.92 98.87±7.32-46.987＜0.001 FEV1（%）57.06±5.94 99.95±6.04-51.374＜0.001 DLCO（%）61.58±23.87 102.16±17.56-13.832＜0.001 TLC（%）72.87±19.67 99.67±5.16-13.201＜0.001

2.2 血清lncRNA PCGEM1相對表達(dá)量在診斷特發(fā)性肺纖維化的價值分析ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清lncRNA PCGEM1相對表達(dá)量診斷IPF的AUC為0.785，95%置信區(qū)間為0.719～0.852，Cut-off值為104.135，此時Youden指數(shù)為0.581，靈敏度為59%，特異度為99.1%，見圖1。

圖1 血清lncRNA PCGEM1相對表達(dá)量診斷IPF的ROC曲線Fig.1 ROC curve on of relative expression of serum lnc-RNA PCGEM1 in diagnosis of IPF

2.3 IPF患者血清lncRNA PCGEM1相對表達(dá)量與動脈血氣指標(biāo)和肺功能指標(biāo)的相關(guān)性 直線相關(guān)研究結(jié)果顯示，IPF患者的血清lncRNA PCGEM1相對表達(dá)量與動脈血PaO、FVC、FEV1、DLCO%、TLC均呈正相關(guān)（P＜0.05），與動脈血PaCO2呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）。見表5、圖2。

表5 IPF患者血清lncRNA PCGEM1相對表達(dá)量與動脈血氣指標(biāo)和肺功能指標(biāo)的直線相關(guān)分析Tab.5 Linear correlation analysis on relative expression of serum lncRNA PCGEM1 and arterial blood gas indicators，pulmonary function indicators

圖2 IPF患者血清lncRNA PCGEM1相對表達(dá)量與動脈血氣指標(biāo)和肺功能指標(biāo)的相關(guān)性Fig.2 Correlation among relative expression of serum lnc-RNA PCGEM1 and arterial blood gas indicators，pulmonary function indicators

3 討論

本研究結(jié)果顯示，IPF患者表現(xiàn)為血清lncRNA PCGEM1相對表達(dá)水平降低，而且在相對表達(dá)量為104.135時，血清lncRNA PCGEM1診斷IPF的價值最大，這一陽性篩選界值雖然未獲得較高的敏感度，但特異度較高，這說明lncRNA PCGEM1的低表達(dá)可能參與了IPF的病理過程，血清lncRNA PCGEM1水平可作為輔助診斷IPF的指標(biāo)。PCGEM1是一種與前列腺癌關(guān)系密切的lncRNA，學(xué)術(shù)界對其進(jìn)行的研究也是從針對前列腺癌的研究開發(fā)的，在近年來的研究中，大多數(shù)研究者仍然是圍繞PCGEM1與前列腺癌及雄激素受體（AR）開展相關(guān)研究。朱竹先等［10］的研究結(jié)果顯示，依賴AR的前列腺癌細(xì)胞呈現(xiàn)出顯著的PCGEM1高表達(dá)，前列腺癌組織中PCGEM1的表達(dá)與AR的表達(dá)水平具有顯著的相關(guān)性。轉(zhuǎn)移性腫瘤中的PCGEM1細(xì)胞核內(nèi)定位與良性前列腺腫瘤存在著顯著的差異，PCGEM1與AR之間存在一定程度的共定位現(xiàn)象。ZHANG等［11］研究結(jié)果顯示，PCGEM1與剪接因子核內(nèi)不均一核糖核蛋白（hnRNP A1和U2AF65）相互作用，誘導(dǎo)PCGEM1表達(dá)能夠調(diào)節(jié)hnRNP A1和U2AF65與AR mRNA前體之間的競爭，因此AR的表達(dá)與PCGEM1及其剪接因子的作用具有相關(guān)性。HE等［12］研究發(fā)現(xiàn)，PCGEM1可與miR-145產(chǎn)生互相調(diào)控作用，從而促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖，過表達(dá)的miR-145能夠下調(diào)PCGEM1的表達(dá)水平，而PCGEM1能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲并在體外誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的凋亡。PAROLIA等［13］的研究結(jié)果顯示，PCGEM1能夠作為體內(nèi)雄激素調(diào)節(jié)的潛在核和/或胞質(zhì)功能的轉(zhuǎn)錄本，從而調(diào)節(jié)AR的活性，影響前列腺癌的病程轉(zhuǎn)歸。但PRENSNER等［14］的研究中PCGEM1并不能影響前列腺癌患者的預(yù)后情況。關(guān)于調(diào)控PCGEM1表達(dá)水平的機(jī)制，HO等［15］的研究結(jié)果顯示，p54/nrb信號通路能夠調(diào)節(jié)PCGEM1和AR的表達(dá)，從而影響前列腺癌的進(jìn)程。HIRSCH等［16］的研究結(jié)果顯示，γ-谷維素能夠通過調(diào)控PCGEM1在DU145和LNCaP細(xì)胞中的基因表達(dá)水平影響前列腺癌細(xì)胞的增殖和凋亡周期，從而在前列腺癌的治療中發(fā)揮輔助作用。XUE等［17］的研究結(jié)果還顯示，PCGEM1的基因多態(tài)性也可用于輔助評價中國人群前列腺癌發(fā)病風(fēng)險的指標(biāo)。此外，徐岷等［18］的研究結(jié)果顯示，胰腺癌組織中PCGEM1水平也要高于癌旁組織，過表達(dá)的PCGEM1可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力，增加腫瘤組織的MMP2和MMP9表達(dá)水平，降低E-鈣黏著蛋白水平?？傊?，學(xué)術(shù)界一般認(rèn)為，PCGEM1是一種抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的lncRNA，其表達(dá)水平的增加有利于腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移，但該領(lǐng)域的研究焦點比較集中，針對PCGEM1在非腫瘤疾病的研究成果比較缺乏，但卻為進(jìn)一步的研究開辟了廣闊的前景，本研究中選取了PCGEM1作為研究指標(biāo)也是基于PCGEM1在細(xì)胞周期中生物學(xué)作用的研究成果，但不同的是本研究結(jié)果提示了在IPF這種纖維化性疾病中出現(xiàn)了PCGEM1低表達(dá)的現(xiàn)象，這可能是由于PCGEM1低表達(dá)增進(jìn)了正常肺組織細(xì)胞的凋亡，導(dǎo)致慢性損傷的肺組織無法得到有效的修復(fù)，而同時又促進(jìn)了成纖維細(xì)胞等肺間質(zhì)細(xì)胞的增殖，從而引起肺組織的纖維化。

本研究結(jié)果顯示，IPF患者的血清lncRNA PCGEM1相對表達(dá)量與動脈血氣指標(biāo)和肺功能指標(biāo)均具有相關(guān)性，這提示了PCGEM1相對表達(dá)量的降低可能參與了IPF的病理進(jìn)展過程。在近年來針對PCGEM1在非腫瘤組織中表達(dá)水平的研究中，KANG等［19］發(fā)現(xiàn)在骨關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞中也存在著PCGEM1的過表達(dá)，PCGEM1能夠通過影響miR-770前驅(qū)體的轉(zhuǎn)染來誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞凋亡，外源性增加PCGEM1的表達(dá)能夠抑制細(xì)胞的凋亡、誘導(dǎo)自噬、刺激滑膜細(xì)胞的增殖。而李博文等［20］通過針對17種lnc-RNA進(jìn)行篩查研究發(fā)現(xiàn)，PCGEM1在哮喘患者的血清中呈現(xiàn)出了明顯的低表達(dá)，檢測其血清水平能夠用于哮喘的臨床診斷。這兩項研究提示了PCGEM1在不同類型的炎癥反應(yīng)性疾病中可能存在著差異性的表達(dá)，而在IPF等肺部慢性炎癥疾病中，PCGEM1的低表達(dá)可能發(fā)揮了促進(jìn)肺實質(zhì)與肺間質(zhì)增生平衡破壞和惡化的作用，但其確切機(jī)制尚有待于進(jìn)一步的基礎(chǔ)研究并予以討論和證實。

綜上所述，IPF患者表現(xiàn)為血清lncRNA PCGEM1相對表達(dá)量的顯著降低，而且其水平與患者的動脈血氣指標(biāo)和肺功能指標(biāo)具有相關(guān)性，提示了lnc-RNA PCGEM1的低表達(dá)可能參與了IPF的發(fā)生和進(jìn)展過程，其水平可作為IPF輔助診斷的指標(biāo)。