間充質干細胞來源外泌體修復炎癥損傷的研究進展

剛喬健，何斯 綜述，哈小琴 審校

1.蘭州大學第二臨床醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730000；2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院檢驗科，甘肅 蘭州 730050；3.甘肅省干細胞與基因藥物重點實驗室，甘肅 蘭州 730050

關鍵字：間充質干細胞；外泌體；炎癥損傷；免疫

間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一種來源廣泛，具有自我更新和多向分化能力的多能干細胞，擁有獨特的免疫調節(jié)和遷移特性及炎癥消退作用，可用于治療炎癥性疾病，且因其具有組織修復作用而具有治療炎癥損傷的能力。但由于MSCs治療存在缺乏標準化產品、治療窗狹窄、無法直接歸巢至發(fā)病部位和難制定特異性治療方案等問題，各種疾病的實際治療效果不佳［1］。因此，MSCs 療法的發(fā)展遇到了瓶頸，需要開發(fā)更好的治療方式來解決其在臨床治療中的弊端并提升療效。

MSCs主要以旁分泌的形式發(fā)揮治療作用。MSCs來源外泌體（mesenchymal stem cell-derived exosomes，MSC-Exos）作為MSCs 主要的旁分泌物質，可通過其包含的生物活性物質調節(jié)免疫細胞表型、功能和歸巢，從而抑制發(fā)炎組織中的有害免疫應答，并促進受損實質細胞的存活和再生［2］。且相較于MSCs而言，MSC-Exos 具有更低的免疫原性和更高的反應性，可以規(guī)避MSCs在治療疾病中的不足。因此，MSC-Exos可作為一種無細胞療法逐步替代MSCs，用于治療、緩解炎癥反應并修復組織損傷。本文就MSC-Exos在炎癥損傷中的應用進展作一綜述，為MSC-Exos 的深入研究和廣泛應用提供參考。

1 外泌體的生物學特性及功能

外泌體（exosomes）是一類直徑30 ～150 mm的細胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs），由晚期內體產生，通過出芽、內陷、多泡小體形成和多泡小體與細胞質膜融合的過程分泌至細胞外［3-4］。外泌體于1983年在綿羊網織紅細胞中被首次發(fā)現(xiàn)［5］。最初外泌體被認為是一種細胞廢棄物［6］，直至1996年，RAPOSO等［7］發(fā)現(xiàn)，來源于人和鼠的B淋巴細胞來源的外泌體可誘導抗原特異性主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）-Ⅱ類限制性T 細胞免疫應答，外泌體的功能才逐漸受到人們關注。

外泌體可由多種細胞如腫瘤細胞、神經細胞、淋巴細胞和造血細胞等分泌，并可在多種體液如血液、漿膜腔積液、尿液、唾液羊水、乳汁和腦脊液中被檢出［8］。外泌體包含多種生物活性物質，如蛋白質、脂質、DNA及RNA、微小RNA（microRNAs，miRNAs）、非編碼RNA（noncoding RNA，ncRNA）等分子，膜轉運相關蛋白以及包括Rab 蛋白、膜聯(lián)蛋白、跨膜轉運蛋白（CD9、CD63、CD81、CD82）、熱休克蛋白（HSP70、HSP90）、整合素、MHC 蛋白等外泌體生物合成相關蛋白在內的融合蛋白［9］，是細胞間通訊的重要媒介?？蓞⑴c各種生理和病理過程，包括抗炎、組織再生、血管生成和免疫［10］。此外，外泌體也被認為是一種合適的藥物傳遞載體，有望用于疾病治療［11-13］。

目前認為，外泌體主要由以下3 種方式發(fā)揮作用［14］：①外泌體直接識別靶細胞表面的信號分子，并與受體結合來傳遞細胞間信息；②外泌體通過與靶細胞融合釋放其內容物發(fā)揮信息轉運功能；③外泌體釋放其內含物并作用于靶細胞表面受體，完成信息傳遞。

2 MSC-Exos對炎癥損傷的調節(jié)機制

2.1 MSC-Exos對免疫細胞的調節(jié)

2.1.1 巨噬細胞 巨噬細胞是非特異性免疫系統(tǒng)中的關鍵組成部分，在維持組織穩(wěn)態(tài)、免疫監(jiān)視和炎性免疫中起重要作用［15］。巨噬細胞可分化為2 種表型：促進炎癥反應的經典激活表型（M1 型）和抑制炎癥反應的替代激活表型（M2 型）。MSC-Exos 通過調節(jié)巨噬細胞表型和活化來治療炎癥損傷。在小鼠肌腱-骨重建模型中，對損傷部位施用載有骨髓MSCExos的水凝膠，發(fā)現(xiàn)其能夠將M1型巨噬細胞轉化為M2型巨噬細胞，并由此促進抗炎因子白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）和腫瘤壞死因子-β（tumor necrosis factor-β，TNF-β）的表達，以減少局部炎癥反應并促進組織的再生及修復［16］。HUANG 等［17］研究的大鼠肩袖重建模型也證實了MSC-Exos 對巨噬細胞表型的調節(jié)作用。實驗結果顯示，尾靜脈注射骨髓MSC-Exos 后，一氧化氮的釋放和M1 型巨噬細胞表面標志物CD86 的表達降低，與此同時，肩袖重建后的大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8水平均有所降低，表明骨髓MSC-Exos 可抑制M1 型巨噬細胞的極化并干擾與M1型巨噬細胞相關的促炎因子分泌。此外，LIU 等［18］研究發(fā)現(xiàn)，MSC-Exos 可通過極化M2b巨噬細胞來減輕結腸黏膜的炎癥。在生物性因子所導致的疾病中，MSC-Exos 也表現(xiàn)出抑制炎癥的潛力。YAO 等［19］研究發(fā)現(xiàn)，在IL-1β 的促炎刺激下，MSC-Exos 可更有效地誘導巨噬細胞的M2 型極化并減輕敗血癥小鼠的癥狀，提高其生存率。PHINNEY等［20］研究發(fā)現(xiàn)，封裝在人MSC-Exos中的miRNA可通過抑制Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLR）和核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信號傳導（特別是MYD88 依賴性途徑）以及炎癥中心炎癥介質的產生來抑制小鼠巨噬細胞的激活。在擴張性心肌病模型中，MSC-Exos 通過激活轉錄因子酪氨酸蛋白激酶2（januskinase 2，JAK2）及其下游信號傳導及轉錄激活蛋白（signal transducer and activator of transcription，STAT）6 的表達，促進巨噬細胞向抗炎M2 表型極化［21］。此外，MSC-Exos 激活STAT3 通路的能力也已有研究證實［22］。NF-κB 與STAT3 之間的相互抑制串擾可調節(jié)巨噬細胞的M1／M2 平衡，其中NF-κB 通路的激活可誘導M1表型的極化，而STAT3通路的激活則有助于巨噬細胞向M2表型轉化和抑制TLR4驅動的炎癥反應［23］。但也有研究認為，MSC-Exos 通過抑制STAT3 發(fā)揮抗炎作用［24-26］。因此，需要進一步研究MSC-Exos對巨噬細胞表型和活化的影響。

MSC-Exos 也可通過其他方式調節(jié)巨噬細胞，進而調節(jié)炎癥反應。LIU 等［27］研究發(fā)現(xiàn)，脂肪MSCExos 通過靶向介導miR-17 從親代細胞向巨噬細胞的轉移，可抑制核苷酸寡聚化結構域樣受體家族PYRIN 域蛋白3（nod-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體的激活和caspase-1、IL-1β 和IL-6 分泌，從而治療炎癥性肝病。SHAO 等［28］研究發(fā)現(xiàn)，人臍帶MSC-Exos 富含的miR-455-3p 可抑制巨噬細胞浸潤并改善炎癥性肝損傷。此外，SHEN 等［29］研究發(fā)現(xiàn)，趨化因子C-C-基元受體2蛋白高表達的MSC-Exos可降低CCL2 蛋白的濃度并抑制巨噬細胞的募集和其功能的激活。

2.1.2 樹突狀細胞（dendritic cell，DC） DC是功能最強的抗原呈遞細胞，是非特異性免疫應答和特異性免疫應答的中央調節(jié)器。DC 具有捕獲、處理和向CD4+幼稚T細胞呈遞抗原的能力，活化后可表達MHC分子、共刺激分子（CD80、CD86、CD40）和促炎因子，并誘導T 細胞增殖［30］。已有研究證實，MSCs 可影響DC 的分化、成熟和功能，并導致DC 轉化為抑制性或耐受性表型［31］。SHAHIR等［30］用MSC-Exos處理小鼠骨髓來源的DC，發(fā)現(xiàn)MSC-Exos 可降低DC 釋放轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、IL-10 和IL-6 的能力，抑制DC 共刺激分子的表達或DC刺激淋巴細胞增殖的能力。另一項研究分離出小鼠脂肪MSC-Exos 并探討其對DC 的影響，結果顯示，使用MSC-Exos 處理小鼠的未成熟DC 后，DC 的共刺激分子（CD40、CD80、CD86）的表達明顯降低，其對CD4+Th2 細胞的激活能力受到抑制，并因此減輕了由Th2細胞驅動的肺部炎癥［32］。目前認為，MSC-Exos可間接下調DC 和T 細胞依賴性適應性免疫應答的免疫活性。然而關于DC 與MSC-Exos 之間相互作用的研究有限，需要進一步探討以確定其機制。

2.1.3 T 細胞 T 細胞可在多個方面調節(jié)特異性免疫，如保護機體免受病原體侵害、針對腫瘤細胞的免疫監(jiān)視和針對異體組織的免疫排斥反應，同時也是許多炎癥和自身免疫性疾病的主要驅動因素［33］，在先天和后天免疫應答中均起到至關重要的作用。抑制T 細胞介導的免疫反應的有效方法是調節(jié)T 細胞的表型、增殖及活化。DU 等［34］將哮喘患者的外周血單個核細胞與MSC-Exos共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)MSC-Exos可通過上調哮喘患者的外周血單個核細胞中抗炎因子IL-10和TGF-β1 的的表達來促進CD4+CD25+Foxp3+Treg的增殖，并以劑量依賴的方式增強其免疫抑制能力，這有助于緩解哮喘患者的免疫功能紊亂和氣道炎癥。LEE 等［35］報道，MSC-Exos 是MSCs 發(fā)揮T 細胞免疫抑制作用的機制之一，可通過上調p27kip1的方式誘導細胞周期阻滯并抑制T 細胞的活化。COSENZA等［36］研究了MSC-Exos 在關節(jié)炎中的免疫調節(jié)功能，發(fā)現(xiàn)MSC-Exos 以劑量依賴的方式降低了刀豆球蛋白A（concanavalin A，ConA）激活的脾細胞的增殖。在受此影響的淋巴細胞亞群中，CD8+IFNγ+T 細胞百分比下調，CD4+CD25+Foxp3+Treg 和CD4+IL10+Tr1細胞百分比上調。表明MSC-Exos 通過誘導Tr1 和Treg 誘導的增殖來間接發(fā)揮免疫抑制作用，證明了MSC-Exos抑制炎癥的能力。其中，CD4+CD25+Foxp3+Treg 的分化可由MSC-Exos中的miR-1470上調P27-KIP1來介導［37］。ZHENG 等［38］研究發(fā)現(xiàn)，MSC-Exos可將miRNA-155-5p 轉移至CD4+T 細胞中來調節(jié)其沉默調節(jié)蛋白1的表達，進而調節(jié)Th17與Treg的平衡。MSC-Exos 還可通過減少T 細胞亞群（CD4+IFNγ Th1細胞、CD4+Foxp3+Treg細胞和CD4+IL-17+Th17細胞）和其他炎癥細胞在眼中的浸潤來削弱實驗性自身免疫性葡萄膜炎的炎癥強度［39］。有研究者還指出，MSCExos 處理顯著降低了Stat3 和p-Stat3 的表達以抑制Th17 細胞分化［25］。此外，也有研究者認為，T 細胞極化的改變是由M1／M2 巨噬細胞的平衡向M2 傾斜導致的［40］。值得注意的是，MSC-Exos 不能直接抑制CD8+T和CD4+T淋巴細胞的增殖［35-36，39］。

2.1.4 B 細胞 B 細胞也是特異性免疫中不可或缺的一部分，以分化成漿細胞和產生抗體為特征，除此之外，B 細胞擁有抗原呈遞和產生細胞因子的能力。其中，漿細胞可產生IL-6，IFNγ 和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子來促進免疫反應，調節(jié)性B 細胞（regulatory B Cells，Bregs）則通過提供IL-10、IL-35 和TGFβ 來抑制免疫反應［41］。在發(fā)揮對T 細胞的免疫抑制功能的同時，COSENZA 等［36］還發(fā)現(xiàn)，MSC-Exos 可在抑制漿母細胞向漿細胞分化的同時，誘導Bregs 的生成。表現(xiàn)為CD138+漿母細胞的百分比降低，共培養(yǎng)上清中總IgG、TNF-α 和IL-6 水平下調，以及IL-10 濃度升高。KHARE 等［42］用骨髓MSC-Exos 培養(yǎng)B 細胞并觀察其mRNA 變化，發(fā)現(xiàn)用骨髓MSC-Exos 培養(yǎng)后，有186個基因顯著差異表達，表明骨髓MSC-Exos可通過抑制B 細胞上趨化因子受體的表達來抑制B細胞增殖并降低其趨化性。但也有研究表明，MSCs對骨髓中的B細胞有支持作用［43］。

2.2 MSC-Exos 對炎癥細胞的調節(jié) 在結腸炎小鼠模型中，對小鼠進行MSC-Exos 注射治療可顯著降低經葡聚糖硫酸鈉處理的小鼠中結腸髓過氧化物酶活性并減輕腸黏膜中嗜中性粒細胞浸潤［18］。而嗜中性粒細胞的浸潤在急性炎癥反應的發(fā)生中起重要作用。由此推測，MSC-Exos 可通過影響嗜中性粒細胞的功能和活性來調節(jié)炎癥反應。細胞自噬也是調控炎癥反應的一項重要機制。在一項關于順鉑誘導的腎毒性研究中，人臍帶MSC-Exos 可通過促進腎小管上皮細胞和腎組織自噬的方式，抑制順鉑引起的細胞凋亡和炎癥反應［44］。此外，ZHANG 等［45］研究發(fā)現(xiàn)，MSC-Exos 可通過轉染miR-126 降低高遷移率族蛋白B1 表達及抑制NF-κB／P65 活化來調節(jié)人視網膜內皮細胞，表明MSC-Exos 具有抑制高糖誘導的炎癥反應的能力。

MSC-Exos 也是通過抑制神經炎癥來改善神經系統(tǒng)功能的潛在選擇。ZHAO 等［46］在急性軟組織損傷試驗中對小鼠進行MSC-Exos注射治療的同時進行了體外模擬試驗，發(fā)現(xiàn)MSC-Exos 通過逆轉CysLT2RERK1／2 介導的小膠質細胞向促炎M1 表型極化和促進小膠質細胞向抗炎M2表型極化，減輕腦損傷并抑制小膠質細胞炎癥。ZHAO 等［47］發(fā)現(xiàn)，CysLT2R 可被MSC-Exos 中的miR-223-3p 以劑量依賴性的方式抑制。有研究發(fā)現(xiàn)，MSC-Exos 通過NRF2-NF-κB 信號通路調節(jié)星形膠質細胞活化。由于星形膠質細胞在調節(jié)和限制中樞神經系統(tǒng)炎癥方面起關鍵作用，且星型膠質細胞增生時間較小膠質細胞更長，造成的炎癥損害更大［48-49］。

3 炎癥疾病的治療及其治療方式

基于MSCs 和MSC-Exos 治療炎癥損傷的多種機制，MSCs 和MSC-Exos 可用于多種炎癥疾病的研究和治療。主要包括關節(jié)炎、炎癥性腸病、移植物抗宿主病、多發(fā)性硬化癥、糖尿病和系統(tǒng)性紅斑狼瘡，并擴展至包COVID-19在內的炎癥性肝臟和肺部疾?。?0］。

目前已開發(fā)出了包括直接注射、靜脈注射、腹膜內注射、口服給藥和水凝膠包裹在內的多種方法將MSC-Exos 用于治療，其中水凝膠包裹療法由于其高效性和良好的生物相容性而備受關注［51］。在一項實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）的研究中，發(fā)現(xiàn)鼻腔給藥可有效緩解EAE 的癥狀，并且作為一種新型非侵入性治療方法，鼻腔給藥與常規(guī)方法（靜脈注射和腹膜內注射）的治療效果相同［52］。此外，HARREL等［53］開發(fā)了一種來源于MSC-Exos 的生物工程產品外泌體衍生的多個同種異體蛋白旁分泌信號因子（exosomederived multiple allogeneic protein paracrine signaling，Exo-d-MAPPS），可顯著下調促炎因子（TNF-α、IL-12、IFNγ、IL-1β）的水平，提高小鼠血清樣本中抗炎因子IL-10 濃度；降低巨噬細胞、中性粒細胞以及自然殺傷細胞、自然殺傷T 細胞產生炎性因子的能力，抑制巨噬細胞和DC 的抗原呈遞特性并促進免疫耐受性DC、M2 型巨噬細胞和Treg 的產生，從而減輕慢性氣道炎癥。更重要的是，30 例慢性阻塞性肺疾病患者在接受Exo-d-MAPPS 治療后均未產生不良反應。此外，脂多糖、缺氧、IFNγ 和甘油酸等預處理也可提高MSC-Exos 的治療效果［25-26，54-55］。因此，開發(fā)出適合的MSC-Exos療法將是MSC-Exos給藥治療的研究重點。

4 總結與展望

MSCs 由于其在免疫調節(jié)、組織修復、刺激血管生成和抗炎等方面的作用為多種疾病的治療提供了新的希望。但其具有較高的生產成本、免疫排斥反應以及腫瘤和異位組織生成等方面的潛在風險，臨床應用受到限制并逐漸被其旁分泌物質MSC-Exos取代［51］。盡管MSC-Exos 在疾病治療方面已有一定進展，但關于其在炎癥方面的臨床應用和機制研究仍比較缺乏，需要從細胞分子、免疫細胞、蛋白組學、基因和信號通路等方面進行深入的探討，闡明MSCExos的抗炎機制和作用。此外，對比不同細胞來源、不同給藥途徑和劑量在治療效果上的差異，開發(fā)新的預處理細胞的策略和研發(fā)新的外泌體療法也將是未來研究的重點。